Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Спектральные характеристики БИК 11
1.2. Хемометрические подходы при обработке БИК 14
1.3. Оборудование для БИК-спектрометрии 22
1.4. Метод диффузного отражения в БИК 27
1.5. Метод БИК-спектрометрии в фармацевтической промышленности 31
Заключение по главе 1 46
Глава 2. Материалы, методы, оборудование 47
2.1. Объекты исследования 47
2.2. Процедура измерения 60
2.3. Оборудование и методы статистической обработки 63
2.3.1. ИК-спектрометр в ближнем диапазоне ANTARIS II - , особенности программного обеспечения 63
2.3.2. Арбитражный метод количественного определения содержания метамизола натрия в препарате «Баралгин М» 71
2.3.3. Арбитражный метод определения однородности дозирования препарата «Супрастин» 73
2.3.4 Арбитражный метод определения плотности этанола по нормативной методике ГФ с использованием пикнометра 75
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение 77
3.1. Метод БИК-спектрометрии в оценке воспроизводимости показателей качества при серийном выпуске фармацевтической продукции 77
3.1.1. Оценка спектральной дисперсии: парные расстояния при одновременном сравнении всех серий одного ЛП 81
3.1.2. Оценка диапазона максимальных значений спектральной дисперсии: результаты перекрестной проверки с исключением по одному образцу 116
3.2. Исследование спектральной дисперсии (БИК область) образцов фармацевтических субстанций и готовых лекарственных форм в течение срока годности 126
3.3. Разработка спектральной модели (БИК-область) для контроля качества готовых лекарственных форм по показателю «однородность дозирования» 136
3.4. Разработка спектральной модели (БИК-область) для определения нормативных показателей качества жидких лекарственных форм на примере оценки плотности водно-этанольных смесей 149
Заключение 157
Выводы 158
Литература 160
Приложение 172
- Оборудование для БИК-спектрометрии
- ИК-спектрометр в ближнем диапазоне ANTARIS II - , особенности программного обеспечения
- Оценка спектральной дисперсии: парные расстояния при одновременном сравнении всех серий одного ЛП
- Разработка спектральной модели (БИК-область) для контроля качества готовых лекарственных форм по показателю «однородность дозирования»
Введение к работе
Актуальность темы
Присутствие на фармацевтическом рынке лекарственных средств (ЛС), не отвечающих нормативным требованиям, стимулирует проведение исследований по разработке новых и совершенствованию существующих методов и методик их анализа
В дополнение к существующим традиционным методам в системе контроля качества ЛС в России и за рубежом успешно внедряется метод ИК-спектрометрии в ближнем диапазоне (область от 12 000 до 4000 см'1) [Арзамасцев А.П., Дорофеев В.Л. 2009; Елизарова Т.Е. 2008, 2011; Титова А.В. 2010]. Это инструментальный метод качественного и количественного анализа, сочетающий спектроскопию и статистическую обработку результатов, полученных при исследовании многофакторных зависимостей. Комбинация принципов колебательной спектроскопии и хемометрического подхода к интерпретации результатов обеспечивает универсальность метода не только при установлении подлинности или определении содержания действующего вещества в ЛС, но и позволяет обнаружить различия между препаратами-дженериками или отдельными производственными сериями лекарственных препаратов одного наименования и производителя [Rodionova O.Ye., Pomerantsev A.L. 2010; Арзамасцев А.П. 2010; Елизарова Т.Е. 2008]. Особым достоинством метода является возможность проведения экспертизы ЛС без предварительной подготовки образца для анализа - измельчения, отделения вспомогательных веществ, растворения, концентрирования, вскрытия упаковки и др.
Уже в течение ряда лет метод БИК-спектрометрии представлен в периодических изданиях ведущих зарубежных фармакопеи: с 1997 г. в фармакопее Евросоюза (статья 2.2.40); с 2002 г. в фармакопее США (статья 1119). Крупнейшие мировые фармацевтические компании взяли на вооружение спектральный анализ в ближней ИК-области для обеспечения аналититического контроля технологических процессов (PAT) [Prendergast Е. et а]. 2012, Ji-XiongDongetal. 2011].
Введение во вторую часть 12-го издания Государственной фармакопеи ОФС «Спектрометрия в ближней инфракрасной области» (42-0099-09) позволяет полноправно использовать метод в системе контроля качества ЛС и в России. Тем не менее, внедрение БИК-спектрометрии в отечественную фармацевтическую практику сдерживается из-за отсутствия детальных методических указаний по его применению при контроле качества ЛС. Таким образом, разработка новых методик анализа ЛС на основе метода спектрометрии в ближней инфракрасной области является актуальной задачей.
Выражаем глубокую признательность генеральному директору контрольно-аналитической лаборатории ООО «КоАЛ Фарманализ» к.б.н. Елизаровой Татьяне Евгеньевне за консультации и предоставленную возможность использования оборудования, образцов фармацевтических субстанций и лекарственных препаратов.
Цель и задачи исследования
Цель диссертационной работы - разработать новые методики для оценки показателей качества лекарственных средств на основе спектрометрии в ближней инфракрасной области и обосновать необходимость их внедрения в практику фармацевтического анализа.
Для реализации цели были поставлены следующие задачи:
-
Разработать новые подходы к контролю качества фармацевтических субстанций и готовых лекарственных форм на основе метода ИК-спектрометрии в ближней области для оценки межсерийной воспроизводимости лекарственных средств.
-
Оценить спектральную дисперсию для образцов фармацевтической продукции разных производственных серий и на основе метода дискриминантного анализа ввести дополнительный критерий качества в виде числового показателя спектрального расстояния.
-
Сформировать спектральную библиотеку фармацевтических субстанций и препаратов при хранении в условиях, соответствующих нормативным требованиям, для последующей разработки количественных критериев оценки качества ЛС при естественном старении.
-
Разработать методику контроля качества готовых лекарственных форм по показателю «однородность дозирования» и охарактеризовать такие ее валидационные характеристики, как правильность и воспроизводимость.
-
Разработать спектральную методику (БИК-область) определения содержания этанола в водно-этанольных смесях и обосновать возможность ее использования в качестве модельной при определении концентрации и/или плотности жидких лекарственных форм.
Научная новизна исследования. В диссертации разработаны новые подходы к контролю качества фармацевтических субстанций и готовых лекарственных форм с использованием метода спектрометрии в ближней инфракрасной области.
По результатам оценки дисперсии образцов серийной продукции для 23 лекарственных препаратов 15 производителей впервые обоснован количественный показатель спектральной дисперсии, отражающий степень однородности продукции.
Разработан алгоритм формирования спектральной библиотеки, позволяющий выявлять изменения свойств лекарственных субстанций и препаратов при контроле их стабильности в течение установленного срока годности. Впервые количественно оценены пределы допустимой спектральной дисперсии при естественном старении ЛС (единицы Махаланобиса).
Показана возможность применения метода БИК-спектрометрии для оценки такого показателя качества твердых лекарственных форм, как «однородность дозирования». Впервые разработаны методики определения однородности дозирования лекарственных препаратов Супрастин и Баралгин М (таблетки) и проведена их валидация.
Определены величины корреляционных связей (калибровочные модели) между спектральными характеристиками этанола в ближней ИК-области и плотностью его водных растворов разной концентрации. Показана возможность использования разработанной спектральной методики при контроле качества водно-этанольных смесей с содержанием этанола от 10% до 95%.
Разработанные методики существенно сокращают продолжительность анализа и повышают эффективность определения показателей качества ЛС по сравнению с нормативными методами.
Практическая значимость исследования. Практическое значение настоящей работы заключается в развитии метода спектрометрии в ближнем ИК-диапазоне для управления качеством ЛС как на этапах производства (при контроле технологических процессов производства), так и при контроле качества готовой продукции (при проведении испытаний для декларирования качества в соответствии с нормативными требованиями).
Разработанные методики пригодны для: оценки межсерийной стабильности продукции фармацевтического производства; оценки качества ЛС при естественном старении; определения однородности дозирования таблетированных лекарственных препаратов; определения качества жидких лекарственных форм.
Созданная библиотека БИК-спектров может быть использована в работе контрольно-аналитических лабораторий промышленных предприятий и лабораторий Росздравнадзора.
Результаты диссертационной работы могут быть использованы при разработке проекта новой общей фармакопейной статьи «ИК-спектрометрия в ближнем диапазоне» для ГФ РФ.
Внедрение результатов исследований. Разработанные методики внедрены в практику контрольно-аналитической лаборатории ООО «КоАЛ Фарманализ», принимающей участие в процедуре декларирования качества лекарственных средств (Акт внедрения от21.03.2012).
Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе и научно-исследовательской работе кафедры фармацевтической и токсикологической химии РУДН. Материалы диссертации включены в цикл лекций для слушателей курсов дополнительного профессионального образования по специальности «Фармация».
Положения, выносимые на защиту:
-
Результаты оценки спектральной дисперсии фармацевтической продукции: парные расстояния при одновременном сравнении большого числа серий одного ЛП.
-
Оценка диапазона максимальных значений спектральной дисперсии: результаты перекрестной проверки с исключением по одному образцу (кросс-валидация).
3. Результаты исследования спектральной дисперсии (БИК-область) образцов
фармацевтических субстанций и готовых лекарственных форм в течение срока годности.
4. Результаты разработки спектральных моделей (БИК-область) для оценки однородности
дозирования действующего вещества в препаратах Баралгин М, Супрастин.
5. Результаты разработки спектральной модели (БИК-область) для определения
нормативных показателей качества жидких лекарственных форм на примере водно-этанольных
смесей различной концентрации.
Апробация работы
Результаты исследований были представлены в периодической печати и доложены на XI и XII Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, декабрь 2010 и 2011); III Международной научно-практической конференции «Клинические и теоретические аспекты современной медицины» (Москва, апрель 2011); XVIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, апрель 2011); 14 Международной конференции по
вопросам новых разработок в области фармацевтического анализа «Recent Developments in Pharmaceutical analysis» (Павия, Италия, сентябрь 2011); Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Актуальные вопросы медицинской науки», посвященной 70-летию профессора А.А. Чумакова (Ярославль, апрель 2012), XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, апрель 2012), объединенном научном семинаре кафедры фармацевтической и токсикологической химии, кафедры биохимии и Центра коллективного пользования РУДН (Москва, 16.05.2012).
Публикации: По результатам диссертации опубликовано 14 работ, из них четыре статьи - в журналах списка ВАК и одна зарубежная публикация.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 171 странице и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований и обсуждение результатов, заключение, выводы и приложение. Библиографический указатель включает 118 литературных источников, из которых 97 на иностранных языках. Работа содержит 66 таблиц, 45 рисунков.
Оборудование для БИК-спектрометрии
Вне зависимости от применяемого способа измерения общая конструкция БИК-спектрометра включает: источник излучения, диспергирующую систему для фильтрации светового потока и регистрирующий элемент (детектор). Специфика РЖ-излучения приводит к особенностям в устройстве каждого элемента [36].
Движущей силой в увеличении разнообразия БИК-спектрометров служит развитие новых элементов фильтрации светового потока. Выделяют несколько способов получения излучения с определенной длины волны, причем каждая из этих технологий может быть реализована несколькими способами: использование фильтров с фиксированной или меняющейся узкой полосой пропускания, применение дифракционных решеток и интерферометров [37].
Светофильтры и сканирующие дифракционные решетки ограничивают измерения возможностью одновременной работы лишь с определенной длиной волны, в то же время отличительными характеристиками светодиодных, акустооптических и жидкокристаллических фильтров является возможность быстрого переключения длины волны и простой развертки. Спектральное разрешение диспергирующих приборов определяется фиксированной шириной щели, обычно она составляет 6-10 нм. Повышение разрешающей способности требует более узкой щели и ослабления результирующего сигнала. Один из недостатков связан с невозможностью выбора разрешения с помощью программного обеспечения. Таким образом, для всех диспергирующих приборов стоит проблема выбора между разрешающей способностью и отношением сигнал/шум [38].
Спектрометры с рассеивающими светодиодными матрицами, приборы с преобразованием Адамара и приборы с интерферометрами (спектрометры с Фурье-преобразованием) позволяют получать спектры одновременно для всего ближнего ИК-диапазона. Кроме того, еще одно преимущество приборов с интерферометрами заключается в возможности лазерной калибровки шкалы длин волн. Точная спектральная воспроизводимость позволяет переносить калибровки с одного прибора на другой без математической корректировки волнового числа. Тем не менее, обеспечиваемое интерферометром высокое спектральное разрешение не всегда приносит пользу при обработке БИК-спектров, насыщенных полосами поглощения.
В основе действия Фурье-спектрометров лежит явление интерференции электромагнитного излучения - наложение волн, при котором происходит их взаимное усиление в одних точках пространства и ослабление в других. Результат интерференции зависит от разности фаз накладывающихся волн.
Интерферометр Майкельсона [36, 39] является основой большинства интерферометрических систем (рис. 1.5). Быстросканирующий интерферометр модулирует энергию с частотой, пропорциональной частоте излучения, формируя, таким образом, интерферограмму, которая в дальнейшем преобразуется в спектр с помощью алгоритма Фурье. В некоторых случаях, например, при использовании в гиперспектральных оптических системах, процесс сбора изображений сопровождается медленным изменением положения зеркала, после завершения сбора данных происходит преобразование интерферограммы в БИК-спектр [36].
Фурье-спектроскопия имеет ряд существенных преимуществ по сравнению с диспергирующими приборами. Во-первых, на приемник в ходе сканирования (смещения зеркала) в каждый момент времени попадает излучение всего спектрального диапазона, а не узкий его участок, определяемый диспергирующей системой обычного прибора. Во-вторых, разрешающая сила интерферометра легко повышается (увеличением расстояния смещения подвижного зеркала) без уменьшения потока излучения. Отсюда следуют такие достоинства Фурье-спектрометров, как очень высокая чувствительность и точность измерений интенсивности (особенно при многократном сканировании и накоплении сигнала); очень высокое разрешение (до 0,01 см"1), высокая точность определения волновых чисел и быстродействие (за 1 секунду можно просканировать интервал в несколько сотен см 1).
Другие компоненты спектрометров, в частности, источники излучения и детекторы, в значительной мере влияют лишь на эксплуатационные характеристики приборов. Среди источников излучения наиболее распространены стержни из карбида кремния (глобар) или из оксидов редкоземельных элементов (штифт Нернста), нагреваемые током до 1500 -1800 С. Они дают мощное ИК-излучение в ближней области, интенсивность которого быстро падает с увеличением длины волны [38].
Детектирование ИК-излучения основано преимущественно на его тепловом действии. Классическим и старейшим детектором является резистор из сульфида свинца (PbS) с пропусканием в области 1000-4000 нм. В последние годы в качестве детектора все чаще используется полупроводниковый индий-галлий-мышьяковый (InGaAs) фотодиод.
Измерительные характеристики БИК-спектрометров определяются также спецификой и расположением оптических деталей, осуществляющих передачу излучения между образцом и прибором. Оптическая часть приборного интерфейса зависит от назначения спектрометра и может быть выполнена по индивидуальному заказу. Одно из преимуществ БИК-спектрометрии состоит в том, что для измерений применяется довольно недорогое оптоволокно. Использование оптоволоконного зонда позволяет проводить измерения в непосредственной близости от образца или внутри его. Оптоволоконные аксессуары для средней ИК-области очень хрупкие, с ними сложно работать. В то же время для ближнего ИК-излучения, вследствие его высокой проникающей способности, практически прозрачен кварц и даже стекло, что облегчает проблему изготовления кювет, окон спектрометров и других деталей оптики. В классической инфракрасной спектроскопии для этих целей используют обычно галогениды металлов, и высокая растворимость этих материалов создаёт серьезные трудности при анализе объектов, содержащих значительные количества воды [38].
Не так давно вошедшие в практику фармацевтического анализа гиперспектральные системы изображения открывают новые дополнительные возможности измерений. До последнего времени, спектрометр позволял получить средний спектр лишь одной определенной области образца. Сегодня гиперспектральные оптические системы могут обеспечить получение изображений одновременно различных областей пробы, что открывает огромные перспективы применения данного метода [38].
При прохождении света через жидкий или газообразный образец спектры ближней ИК-области могут быть представлены в виде величины поглощения (А) или пропускания (Т) [1-4, 40]. Измерение в режиме направленного пропускания представляет собой стандартный метод спектрального анализа, который используется для достаточно тонких слоев неотражающих материалов. В режиме пропускания энергия излучения от источника попадает на образец и проходит сквозь него, на детектор попадает та часть, излучения, которая прошла через пробу. Обеспечение контроля производства in-line достигается за счет использования спектрометров, встраиваемых в производственное оборудование. При этом, в случае, когда имеется лишь одно входное отверстие для волоконного зонда, ИК-излучение проходит через пробу дважды. Использование зеркала позволяет отразить и перенаправить энергию обратно в сторону доступного выхода, где находится оптоволоконный зонд. Возможности приставок направленного пропускания-отражения, часто называемых приставками на пропускание, особенно полезны, когда заданная длина пути не может быть обеспечена однократным сквозным прохождением излучения через образец [38, 40].
Важная особенность работы на БИК-спектрометре - необходимость разработки стабильной и надёжной в эксплуатации модели калибровки. Это очень трудоёмкая, требующая значительного количества ресурсов работа, которая включает в себя подготовку и анализ большого числа образцов стандартным методом, а затем их анализ методом Фурье - БИК. Важно разработать такую калибровочную модель, которая обеспечивала бы точные результаты измерений в течение длительного времени вне зависимости от вида прибора, типа источника излучения, детектора, датчиков и т.д. Необходимо также учитывать факторы, влияющие на точность калибровочной модели при ее переносе с одного прибора на другой. К этим факторам в первую очередь относятся длина волны и фотометрическая точность различных приборов: [41, 42].
Очевидно, что вектор модернизации приборов будет направлен на создание портативных БИК-спектрометров, с возможностью переноса калибровок с прибора на прибор, которые смогут обеспечить работу с различными библиотеками в осуществлении скрининга контрафактной продукции на фармацевтическом рынке.
Интерес со стороны аналитиков к методу БИК-спектрометрии был связан, в первую очередь, с технологическим прорывом в области ближнего ИК-оборудования, например, значительным улучшением детекторов, развитием быстросканирующих и Фурье спектрометров, вытеснивших впоследствии диспергирующие приборы, широким использованием волоконной оптики, новых приставок (интегрирующая сфера), а также, включением в программное обеспечение математических и статистических методов обработки БИК-спектров.
ИК-спектрометр в ближнем диапазоне ANTARIS II - , особенности программного обеспечения
Для исследования межсерийной воспроизводимости и изменений во времени спектральных характеристик лекарственных субстанции и готовых лекарственных форм был применен метод Discriminant Analysis - один из классификационных методов, предлагаемых программным обеспечением ИК-спектрометра в ближнем диапазоне Antaris II.
Для оценки однородности дозирования лекарственных препаратов Баралгин М, тб. 500мг, и Супрастин, тб. 25мг, а также для создания спектральной модели определения плотности этанола были созданы калибровочные модели с использованием количественного метода Stepwise Multiple Linear Regression.
Программное обеспечение Nicolet TQ Analyst предназначено для создания методов анализа спектральных данных, в том числе спектров средней инфракрасной области, ближней инфракрасной области, дальней инфракрасной области и комбинационных спектров. Программное обеспечение имеет удобный интерфейс и множество сетевых опций. Профессиональная версия программного обеспечения «Professional Edition» использует разнообразные методики количественного и классификационного анализа: закон Бера, методы наименьших квадратов, множественной линейной регрессии, регрессии главных компонент.
В рамках этой программы могут быть использованы методики классификации образцов: теория подобия (Similarity Match), теория сдвига (Distance Match), дискриминантный анализ, исследование стандартов, сравнительный контроль качества; методики базовых измерений: идентификация спектральных максимумов, измерение высоты и площади спектральной полосы, сравнение спектральных полос, оценка полуширины спектральной полосы при поглощении. Программа позволяет оценить уровень шумов в исследуемой области и обнаружить спектральные полосы, составляющие 1%, 2%, 5%, 10% от максимального регистрируемого значения.
Принципы TQ Analyst. TQ Analyst представляет собой пакет программ для разработки методов количественного и классификационного анализа спектральных данных.
Количественные методы позволяют рассчитать концентрацию одного или нескольких компонентов смеси.
Классификационные методы позволяют определить особенности спектра образца, с целью последующего сравнения с известными спектрами. Обычно классификационные методы используют для контроля качества или для предварительного анализа образцов, которые предполагается включить в количественный эксперимент. Возможна идентификация неизвестного вещества и оценка степени его чистоты.
Обработка спектральных данных. Несмотря на то, что БИК-спектрометрия предполагает прямую и линейную зависимость между поглощением, концентрацией и длиной пути, получить спектр, для которого эти условия полностью выполняются, не всегда представляется возможным.
Обработка спектра необходима для его максимального приведения к идеальной модели, например, более точный анализ часто можно провести при использовании первой или второй производной, а не оригинального спектра.
Под обработкой спектра подразумевается сглаживание, получение производных и коррекция базовой линии, а также коррекция длины пути MSC (Multiplicative Signal Correction) или SNV (Standard Normal Variate).
Программное обеспечение TQ Analyst позволяет установить формат спектральных данных для анализа - можно провести анализ оригинальных спектров, а также первых или вторых производных спектров.
Первая производная позволяет обнаружить пики, которые на оригинальном спектре имеют вид выступов, а для определения точных координат таких выступов используется вторая производная. Для получения производных обычно используют спектры, полученные в единицах поглощения, Kubelka-Munk или фотоакустических единицах.
Первая производная отражает скорость изменения на протяжении всего спектра. При такой обработке становятся заметны незначительные изменения, существующие в исходном спектре. При этом точки максимума и минимума первой производной соответствуют точкам максимальной скорости изменений, а не точкам максимума и минимума оригинального спектра. Точки максимума и минимума оригинальных пиков на первой производной спектра имеют координату 0 по оси ординат.
Вторая производная демонстрирует изменение скорости изменений на протяжении всего спектра. Вторая производная используется для определения точного местонахождения экстремумов, которые располагаются там же, где и максимумы оригинального спектра. При получении любой производной спектра уровень шумов немного повышается, интенсивность сигнала сильно падает, а отношение сигнал-шум понижается.
Сглаживание позволяет улучшить внешний вид спектра за счет сглаживания пиков, вызванных повышением уровня шумов. Понижение уровня шума позволяет снизить ошибку калибровочной модели.
Алгоритм сглаживания основан на предположении, что спектральные характеристики варьируют медленно и ослабляются случайными помехами. Данный алгоритм позволяет в первую очередь сгладить высокочастотную компоненту спектра, он находит и сглаживает пики, вызванные помехами.
Методы качественного (классификационного) анализа. Программное обеспечение TQ Analyst предлагает целый набор методов сравнения и идентификации неизвестных образцов на основании имеющихся спектров различных веществ. TQ Analyst предлагает следующий набор классификационных методов:
- Similarity Match;
- Distance Match;
- Discriminant Analysis; - Search Standards;
- QC Compare search.
Все классификационные методы основаны на сравнении спектра неизвестного образца со спектрами одной или нескольких групп (классов) известных соединений (стандартов).
Классификационный метод Discriminant Analysis позволяет определить один или несколько классов известных веществ, наиболее близких к исследуемому веществу. Для этого производится расчет расстояния от центра каждого класса в единицах расстояния Mahalonobis. Данный метод обычно используется для входного контроля веществ.
Метод позволяет определить два и более класса известных веществ, для каждого класса используется несколько стандартов. При анализе может быть использовано несколько областей спектра.
В процессе калибровки для каждой сравниваемой группы/класса программное обеспечение «TQAnalystTM» вычисляет усредненный спектр, а затем создает модель распределения путем оценки отклонений на каждой частоте диапазона.
Усредненный спектр группы вычитается из каждого отдельного спектра, что и создает спектр дисперсии. При анализе следующей группы программное обеспечение осуществляет анализ основной компоненты на каждом отдельном спектре и спектре дисперсии, что позволяет оценить величину вклада. Графически величины вклада представляют в виде спектральных расстояний в единицах Mahalonobis a. Эти расстояния используют для ранжирования исследуемых классов: чем ближе значение расстояния к нулю, тем выше спектральное соответствие.
Метод Discriminant Analysis использует для создания модели распределения спектральной информацию всех стандартов. По этой причине добавление или удаление стандартов может сильно повлиять на калибровочную модель. Результатом применения дискриминантного анализа является название класса или нескольких классов, наиболее близких к спектру неизвестного образца. Помимо этого, на экран может быть выведено расстояние Mahalonobis между неизвестным образцом и каждым классом.
Метод Discriminant Analysis наиболее эффективен при создании программой отдельной модели распределения для каждого класса. Однако если в распоряжении пользователя имеется менее пяти стандартов для каждого класса, а спектры различных классов очень схожи, рекомендуется использовать обобщенную модель распределения.
Метод Discriminant Analysis особенно эффективен при анализе образцов разного состава, содержащих один и тот же ингредиент. Например, можно применить данный метод для анализа наркотиков, находящихся в смеси с различными веществами.
Количественные методы. Программное обеспечение TQ Analyst предлагает широкий выбор количественных методов при условии, что интенсивность пиков спектра поглощения прямо пропорциональна количеству образца (закон Бэра-Ламберта-Бугера).
Оценка спектральной дисперсии: парные расстояния при одновременном сравнении всех серий одного ЛП
1) Оценка межсерийной дисперсии ЛП Структум, капсулы 500 мг (Пьер Фабр Медикамент Продакшн, Франция).
В ходе дискриминантного анализа капсулированного препарата Структум, капе. 500 мг, в таблицу стандартов программы TQ Analyst было включено 144 спектра для 16 классов (по 9 спектров для каждой из 16 серий). Хемометрическая обработка БИК-спектров различных серий ЛП методом дискриминантного анализа позволила преобразовать спектральные данные и спроецировать их на подпространство меньшего размера, которое было представлено в виде двумерного графика в координатах Махаланобиса (рис.3.1). Каждая точка на полученной плоскости соответствует отдельному спектру определенной серии препарата.
На рисунке 3.1 представлен результат дискриминантного анализа при первом типе группировки данных - один из графиков парных расстояний (Pairwise Distance) между отдельными сериями ЛП.
Точки, соответствующие спектрам серии, выбранной по оси ординат, обозначаются треугольниками. Квадратами обозначены спектры класса, выбранного по оси абсцисс. Как видно из рисунка, в полученный диапазон попадают спектры большинства оставшихся исследуемых классов, на графике они обозначены кругами.
Перпендикулярные осям серые линии на плоскости являются пограничными значениями - они показывают 95% доверительные интервалы для двух выбранных классов. Смешение точек характеризует схожесть БИК-спектров серийной продукции, при этом достоверно отличить некоторые производственные серии практически невозможно. В то же время из графиков видно, что спектры, соответствующие сериям, выбранным по осям, формируют на плоскости 2 четкие области скопления точек, которые находятся на максимальном расстоянии друг от друга.
Меняя номера серий ЛП по осям абсцисс и ординат, можно определить величины максимальных парных расстояний между спектрами для всех исследуемых классов. Полученные значения для серий ЛП Структум, капс.500 мг, представлены в таблице 3.1.
Как следует из данных таблицы 3.1, наибольший размах спектрального расстояния был выявлен между сериями ЛП Структум, капе. 500 мг, под номерами 7 и 14 - 4,36 ед. Махаланобиса. Отметим, что ни одна из этих серий не является выбросом, поскольку парные расстояния между ними и всеми остальными классами не превышают среднюю по таблице величину межсерийной дисперсии.
2) Оценка межсерийной дисперсии ЛП Полин, капе. 200 мг (Лек д.д., Словения).
В ходе дискриминантного анализа капсулированного препарата Палин, 200 мг, в таблицу стандартов программы TQ Analyst было включено 225 спектров для 25 классов (по 9 спектров для каждой из 25 серий). На рисунке 3.2 представлен результат дискриминантного анализа при первом типе группировки данных - один из графиков парных расстояний между отдельными сериями ЛП.
Так из рисунка 3.2 следует, что в целом разброс спектров внутри одной серии соизмерим с величиной межгрупповой дисперсии, при этом расстояние Махаланобиса между наиболее отстоящими друг от друга спектрами серий 5 и 16 не превышает 4,6 единицы.
Величины максимальных парных расстояний для всех исследуемых серий ЛП Палин представлены в таблице 3.2.
Как следует из данных таблицы 3.2, наибольший размах спектрального расстояния был выявлен между сериями ЛП Палин, капе. 200 мг, под номерами 8 и 9 - 9,05 ед. Махаланобиса. Ни серию под номером 8, ни серию под номером 9 нельзя считать грубым промахом выборки, поскольку расстояния между указанными сериями и оставшимися классами не превышают среднюю по таблице величину межсерийной дисперсии. Так, например, спектральное расстояние между серией 8 и 20 составляет всего 2,90 ед. Махаланобиса, а между серией 9и11-2,10 единицы.
3) Оценка межсерийной дисперсии ЛП Бактисубтил, капе. 35 мг (Патеон Франц, Франция).
В ходе дискриминантного анализа капсулированного препарата Бактисубтил, 35 мг, в таблицу стандартов программы TQ Analyst было включено 225 спектров для 25 классов (по 9 спектров для каждой из 25 серий). Величины максимальных парных расстояний, рассчитанные для всех исследуемых серий ЛП Бактисубтил, капе. 35 мг, представлены в таблице 3.3.
Как следует из таблицы 3.3, наибольший размах спектрального расстояния был выявлен между сериями ЛП Бактисубтил, капс.35 мг, под номерами 9 и 17 - 4,00 ед. Махаланобиса.
4) Оценка межсерийной дисперсии ЛП Флуконазол, капе. 150 мг (Реплекфарм АО, Македония).
В ходе дискриминантного анализа капсулированного препарата Флуконазол, 150 мг, в таблицу стандартов программы TQ Analyst было включено 162 спектра для 18 классов (по 9 спектров для каждой из 18 серий). На рисунке 3.4 представлен результат дискриминантного анализа при первом типе группировки данных - один из графиков парных расстояний между отдельными сериями ЛП.
Так из рисунка 3.3 видно, что разброс спектров внутри одной серии соизмерим с величиной межгрупповой дисперсии, при этом расстояние Махаланобиса между наиболее отстоящими друг от друга спектрами серий 7 и 11 не превышает 3,74 единицы.
Величины максимальных парных расстояний для всех исследуемых серий ЛП Флуконазол, капе. 150 мг, представлены в таблице 3.4.
Разработка спектральной модели (БИК-область) для контроля качества готовых лекарственных форм по показателю «однородность дозирования»
Известно, что одним из фармакопейных критериев качества лекарственных средств является показатель однородности дозирования. Традиционно анализ таблетированных лекарственных форм на однородность дозирования осуществляется количественными методами ВЭЖХ, ГХ, УФ-спектрофотометрии и др. [1-5]. Все эти высокоточные методы довольно длительны, трудоемки, требуют пробоподготовки, подразумевают выборку образцов с производственной линии и исследование их в лаборатории контроля качества.
Спектроскопия ближнего ИК-диапазона является альтернативным, удобным, неразрушающим методом анализа на однородность дозирования [113]. БИК-спектрометр, при условии его объединения с формой для прессования таблеток, может обеспечить решение проблемы автоматического контроля продукции на фармацевтическом производстве [114]. Это особенно важно сегодня, когда многие производители стремятся не только выпустить конечный продукт самого высокого качества, но также повысить производственную эффективность с помощью жесткого лабораторного контроля технологии изготовления лекарственных препаратов [115, 116, 117, 118].
Была проведена оценка возможности применения метода РЖ-спектрометрии в ближней области для контроля качества готовых лекарственных препаратов по показателю «однородность дозирования» [52].
В качестве модельных препаратов были использованы ЛП Супрастин, тб. 25 мг (Фармацевтический завод Эгис А.О., Венгрия) и Баралгин М, тб. 500 мг (Авентис Фарма Лтд, Индия). Для более полной оценки правильности и воспроизводимости метода БИК-спектрометрии были специально отобраны препараты с различающимися массовыми долями действующих веществ (табл. 3.24).
Для количественной оценки однородности дозирования лекарственных препаратов Супрастин, тб. 25 мг, и Баралгин М, тб. 500 мг, применяли заложенный в программе прибора статистический метод Stepwise Multiple Linear Regression (множественная линейная регрессия), представляющий концентрацию как функцию поглощения при различных частотах. Для построения калибровочной прямой точные значения содержания действующего вещества, определяемые арбитражными валидированными методами, вносились в программу прибора. Оценка правильности и воспроизводимости полученной калибровки производилась с использованием тех же валидированных нормативных методик.
При определении однородности дозирования препарата Супрастин, тб. 25 мг, содержание активного ингредиента, хлоропирамина гидрохлорида, устанавливали для каждого калибровочного стандарта арбитражным нормативным методом - УФ-спектрофотометрии (спектрофотометр Сагу, Varian, США).
Согласно ОФС 42-0129-09 [5] испытание на однородность дозирования для таблеток без оболочки с массовой долей активного ингредиента менее 25% проводят количественным определением содержания действующего вещества по отдельности в каждой отобранной для испытания единице препарата (способ 1).
Для оценки однородности дозирования действующего вещества при его массовой доле в ЛП 25 % применим способ 2 - расчетное определение содержания действующего вещества по массе единиц дозированного препарата. Условиями, определяющими возможность применения данного способа, являются также равномерное распределение действующего вещества по массе испытуемого препарата и предусмотренное в частной фармакопейной статье использование навесок усредненной пробы при «количественном определении» действующего вещества.
Массовая доля действующего вещества (метамизола натрия) в таблетке ЛП Баралгин М составляет более 90%, поэтому спецификация на данный препарат не включает методики определения показателя однородности дозирования по способу 1. В связи с этим в качестве арбитражного количественного метода была использована методика йодометрического титрования, адаптированная для заданных условий эксперимента. Согласно методике, утвержденной в частной фармакопейной статье, определение действующего вещества проводят из навески порошка 20 измельченных таблеток Баралгина, эквивалентной 500 мг метамизола натрия. Однако для обеспечения точности калибровочной прямой, где каждому калибровочному стандарту должна соответствовать определенная концентрация активного компонента, данная методика была преобразована: каждое измерение проводили для отдельной таблетки Баралгина М. После снятия БИК-спектра таблетку ЛП растворяли по методике НД, а аликвоту полученного раствора титровали 0,1 М раствором йода на автоматическом титраторе «794 BASIC» производства фирмы Metrohm.
В программном методе множественной линейной регрессии для обоих исследуемых препаратов были получены экспериментальные модели, описывающие зависимость между спектральным откликом и содержанием действующего вещества (рис. 3.28 и 3.29).
На оси ординат откладывали значения содержания действующего вещества, рассчитанные программой на основании спектральных данных. На ось абсцисс наносили значения содержания действующего вещества, полученные арбитражным валидированным методом. Для обоих случаев получили высокие коэффициенты корреляции: для Супрастина, тб. 25 мг -0,983, для Баралгина М, тб. 500 мг - 0,987.
Для обоих ЛП вычислена относительная ошибка определения содержания действующего вещества в исследуемом препарате методом БИК-спектрометрии в сравнении с аттестационным методом. Относительная ошибка определения в обоих случаях превысила 3% лишь для двух измерений из 10 (табл. 3.25, 3.26).
Для количественной оценки показателя «однородность дозирования» был рассчитан первый показатель приемлемости (AV), характеризующий разброс в содержании действующего вещества по отдельно взятым единицам дозированной лекарственной формы испытуемых ЛП (см. табл. 3.27 и 3.28).
Согласно требованиям ОФС 42-0129-0 «Однородность дозирования» результат испытания признается удовлетворительным, если при п = 10 первый показатель приемлемости AV L). Исходя из данных, представленных в таблице 3.27 и 3.28, результаты испытания на однородность дозирования во всех случаях можно считать удовлетворительными.
Для оценки метода БИК-спектрометрии по правильности и воспроизводимости была проведена статистическая обработка результатов количественного анализа, полученных двумя методами - методом БИК-спектрометрии и валидированным арбитражным методом.
Статистическая обработка и представление результатов количественного анализа для препарата Баралгин М
1. Расчет метрологических параметров для метода йодометрического титрования - результаты представлены в табл. 3.29.
2. Расчет метрологических параметров для метода БИК-спектрометрии -результаты представлены в табл. 3.30.
3. Оценка двух методов анализа по воспроизводимости (сравнение дисперсий). Для оценки того, значимо или не значимо (статистически) расхождение между двумя дисперсиями V] и V2, используем так называемый критерий Фишера (F-критерий) согласно формуле
4. Сравнение результатов количественного анализа образца, полученных двумя методами (сравнение средних). Сначала рассчитываем средневзвешенную дисперсию ( V) и функцию Стьюдента tpacC4 по формулам
Таким образом, в ходе исследования были разработаны методики определения однородности дозирования действующего вещества в лекарственных препаратах Супрастин и Баралгин М методом спектрометрии в ближней ИК-области. Статистически оценена правильность и воспроизводимость разработанных методик и доказана возможность применения метода спектрометрии в ближней ИК области для контроля качества ЛС по показателю «однородность дозирования».
![Стандартизация и контроль качества лекарственных средств группы фторхинолонов методами хроматографии и ИК-спектроскопии [Электронный ресурс]](/i/i/4375/184827.png "Стандартизация и контроль качества лекарственных средств группы фторхинолонов методами хроматографии и ИК-спектроскопии [Электронный ресурс] Коновалов Андрей Александрович")
