Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Перспективы использования электрохимических методов исследования в фармации 8
Экспериментальная часть
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Объект исследования 39
2.2. Методы исследования 43
Глава 3. Результаты квантово-химического исследования молекул лекарственных средств 52
Глава 4. Результаты разработки методик количественного определения лекарственных средств вольтамперометрическим методом в растворе стандартного образца 77
Глава 5. Разработка вольтамперометрических методик количественного определения лекарственных средств в модельных смесях и лекарственных формах 131
Глава 6. Фармакокинетическое исследование лекарственных средств с использованием вольтамперометрии 215
Глава 7. Изучение возможности использования вольтамперометрического экспресс-анализа для определения эндогенных пептидов в биожидкостях 269
Обсуждение результатов 304
Выводы 311
Список литературы 313
Приложение
- Обзор литературы. Перспективы использования электрохимических методов исследования в фармации
- Результаты квантово-химического исследования молекул лекарственных средств
- Результаты разработки методик количественного определения лекарственных средств вольтамперометрическим методом в растворе стандартного образца
- Разработка вольтамперометрических методик количественного определения лекарственных средств в модельных смесях и лекарственных формах
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время в России зарегистрировано и внесено в Государственный реестр порядка 3000 лекарственных средств, ежегодно их список пополняется на 200 – 300 наименований; вместе с тем, каждый год из списка разрешенных для клинического применения исключают 100 – 200 препаратов, чаще всего по причине высокой токсичности и широте побочных эффектов. Необходимо учитывать и то, что лекарственные средства в качестве монотерапии используют редко, чаще в виде сочетаний в одной лекарственной форме, что усиливает терапевтический эффект и увеличивает число побочных реакций (Ю.Б. Белоусов, 2002; И.И. Мирошниченко, 2002).
В связи с этим, актуальным становится поиск и выбор современных высокочувствительных методов контроля качества лекарственных средств, при этом оптимальным является тот, который осуществляет детекцию по фармакологически активной группе, пригоден для анализа лекарственного средства в растворе стандартного образца, лекарственных формах и биологических жидкостях. Поскольку в оказании фармакологического эффекта непосредственно задействованы эндогенные электрохимические процессы, следует обратить внимание на электрохимические методы анализа, в частности, вольтамперометрию, используемую в настоящее время для контроля состояния окружающей среды, лекарственных средств, исследования физиологических процессов в организме и способную обеспечить определение значительного числа как неорганических, так и органических веществ. Она характеризуется высокой чувствительностью и селективностью, быстротой отклика на изменение состава анализируемого объекта, легкостью автоматизации и возможностью дистанционного управления, не требуют дорогостоящего аналитического оборудования и может применяться в лабораторных, производственных и полевых условиях. Нижняя граница определяемых концентраций при линейном изменении потенциала индикаторного электрода в классической вольтамперометрии составляет 106 105 моль/л, для ее снижения до 108 107 моль/л используют усовершенствованные инструментальные варианты: переменнотоковую и дифференциальную импульсную.
Особый интерес представляет изучение возможности использования вольтамперометрии для анализа сердечнососудистых лекарственных средств, как наиболее обширной части рынка всех лекарственных средств.
Цель и задачи исследования
Целью настоящего исследования являлось обоснование целесообразности использования вольтамперометрии для контроля качества и изучения фармакокинетики сердечнососудистых лекарственных средств на примере амиодарона, нибентана, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида и карведилола. Исследование возможности использования вольтамперометрии в анализе эндогенных полипептидов.
Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:
выполнить квантово–химические расчеты структуры амиодарона, нибентана, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида и карведилола;
разработать вольтамперометрические методики количественного определения лекарственных средств в модельных растворах стандартного образца;
предложить валидированные условия количественного определения лекарственных средств в лекарственных формах;
изучить возможность количественного анализа лекарственных средств в сыворотке крови и предложить схему пробоподготовки анализируемых образцов крови;
провести сравнительные фармакокинетические исследования сердечнососудистых лекарственных средств вольтамперометрическим методом в сравнении с высокоэффективной жидкостной хроматографией;
исследовать возможность использования вольтмаперометрии в анализе эндогенных полипептидов.
Научная новизна
С помощью квантово–химических расчетов структур амиодарона, нибентана, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида и карведилола, выполненных методом РМ–3, впервые получены соответствующие значения энергий ионизации атомов, на основании чего дано заключение о вероятном механизме электродного процесса.
Впервые в мировой практике:
обнаружена способность и показана возможность амиодарона, нибентана, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида, карведилола и ангиотензина II участвовать в процессах, протекающих на поверхности стационарных электродов с образованием малодиссоциированных соединений, электрорастворение которых приводит к появлению сигнала на вольтамперной кривой с параметрами, являющимися качественной и количественной характеристикой определяемого вещества. Получены патенты: «Вольтамперометрический способ определения инсулина»; «Вольтамперометрический способ количественного определения нибентана»; «Способ определения амиодарона (кордарона) методом инверсионной вольтамперометрии»; «Способ определения ангиотензина II методом инверсионной вольтамперометрии»; «Способ определения спираприла гидрохлорида методом инверсионной вольтамперометрии»; «Способ определения беназеприла гидрохлорида (лотензина) методом инверсионной вольтамперометрии»; «Способ определения фозиноприла натрия методом инверсионной вольтамперометрии»; «Способ определения карведилола методом инверсионной вольтамперометрии»;
показана возможность и разработаны эффективные, экономичные и экологически безопасные технологии количественного определения сердечнососудистых средств в лекарственных формах вольтамперометрическим методом;
предложены методики пробоподготовки образцов сыворотки крови, содержащих амиодарон, нибентан, спираприла гидрохлорид, фозиноприл натрий, беназеприла гидрохлорид и карведилол для целей вольтамперометрического исследования;
вольтамперометрическим методом проведены сравнительные фармакокинетические исследования амиодарона, нибентана, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида и карведилола на базе отделения хирургического лечения сложных нарушения ритма сердца и электрокардиостимуляции (научный руководитель отделения д.м.н., профессор Попов С.В.) и отделения сердечной недостаточности (научный руководитель отделения д.м.н., профессор Тепляков А.Т.) ГУ НИИ кардиологии СО РАМН и установлены основные фармакокинетические параметры;
предложены методические подходы к определению соединений полипептидной структуры в биологических образцах вольтамперометрическим методом;
предложены вольтамперометрические экспресс–методики определения гормонов: инсулина и ангиотензина II в сыворотке крови для целей изучения влияния лекарственных средств на организм человека.
Практическая значимость результатов исследования
Разработаны методики количественного определения амиодарона, нибентана, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида, карведилола, инсулина и ангиотензина II в модельных растворах, лекарственных формах и сыворотке крови вольтамперометрическим методом, защищенные патентом Российской Федерации и внедренные в практическую деятельность;
Рассчитаны основные фармакокинетические показатели нибентана, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида и карведилола, полученные с использованием вольтамперометрии и установлена степень влияния сопутствующих заболеваний на фармакокинетику указанных препаратов;
Разработанные методики вольтамперометрического определения лекарственных средств и полипептидов используются в работе ГУ НИИ кардиологии СО РАМН, ЗАО «ВекторМедика», ГУ Новосибирского института органической химии им. Н.Н. Ворожцова (НИОХ СО РАН), ФГУ «Новосибирский научноисследовательский институт патологии кровообращения имени Е.Н. Мешалкина Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи», Государственного научного учреждения «Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока» СО Российской академии сельскохозяйственных наук, что подтверждено актами внедрения.
Связь темы диссертации с проблемным планом фармацевтической науки
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работы ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России и г. Новосибирск: «Системные механизмы действия ксенобиотиков на организм и разработка новых фармакологических препаратов» № гос. регистрации 01.2.00709495, код ВНТИЦ 0203042450323 и ГУ НИИ кардиологии СО РАМН, г. Томск.
Положения, выносимые на защиту:
– исследование электрохимического поведения амиодарона, нибентана, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида и карведилола и соответствующие квантово–химические расчеты;
разработка методик вольтамперометрического количественного определения амиодарона, нибентана, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида и карведилола, в раствора стандартного образца, модельных смесях, лекарственных формах и сыворотке крови;
оценка валидности предлагаемых вольтамперометрических методик;
методические подходы к количественному определению эндогенных полипептидов инсулина и ангиотензина II в сыворотке крови вольтамперометрическим методом;
получение фармакокинетических характеристик амиодарона, нибентана, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида и карведилола вольтампеорметрическим методом у пациентов с сердечнососудистой патологией.
Апробация работы
Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на конференции «Коммуникативная технология наркологии и психиатрии» (Новосибирск, 2002); научно–практической конференции «Рациональное использование лекарств» (Пермь, 2004); международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2004); XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005), VI Ежегодной конференции общества специалистов по сердечной недостаточности «Сердечная недостаточность 2005» (Москва, 2005); Всероссийской научно–практической конференции «Современные проблемы фармакологии и фармации» (Новосибирск, 2005). Первом съезде кардиологов Сибирского Федерального Округа (Томск, 2005), региональной конференция «Актуальные проблемы фармакотерапии с позиций доказательной медицины» (Томск, 2006).
Личный вклад автора: для получения результатов, изложенных в диссертации, автор лично изучил электрохимические свойства амиодарона, нибентана, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида, карведилола, инсулина, ангиотензина II вольтамперометрическим методом и разработал методики количественного определения перечисленных веществ в растворах стандартных образцов, модельных смесях и биологических средах, выполнил валидацию предложенных методик с использованием спектрофотометрии и ВЭЖХ, провел фармакокинетические исследования и рассчитал фармакокинетические параметры сердечно–сосудистых лекарственных средств с участием 59 пациентов.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 34 работ, в том числе 8 патентов и 10 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации
Обзор литературы. Перспективы использования электрохимических методов исследования в фармации
Вольтамперометрия - метод исследования и анализа, основанный на явлении поляризации электрода при прохождении электрического тока через проводники второго рода (растворы электролитов) с регистрацией аналитического сигнала (катодный или анодный ток), возникающего в результате электродных процессов, происходящих на индикаторном электроде при развертке внешнего поляризующего напряжения [27; 38; 72].
Источником информации для качественного и количественного анализа служит вольтамперограмма - графическое изображение зависимости тока от потенциала микроэлектрода. В зависимости от разновидности вольтампе-рометрии, то есть от вида развертки поляризующего напряжения и способа измерения тока, на вольтамперограмме наблюдается либо S-образная волна, либо пик. Положение волны (пика) на оси потенциалов определяется природой вещества, участвующего в электродной реакции, а величина тока линейно зависит от его концентрации [38; 59; 99].
Теоретически высокая чувствительность и точность вольтамперомет-рии обусловлены тем фактом, что в ее основе лежат законы Фарадея: электропревращение (восстановление или окисление) на электроде 1 моля вещества эквивалентно прохождению п 96 500 кулонов, где п - число электронов, участвующих в электродной реакции. Но, как и в любом методе анализа, реально достигаемый предел обнаружения ограничивается допустимым отношением аналитического сигнала и шума (помехи) [79; 99].
Величина предела обнаружения в вольтамперометрии зависит от отношения фарадеевского тока (IF, аналитический сигнал электрохимической реакции) и емкостного тока или тока заряжения (1С, помеха). Емкостной ток обусловлен формированием двойного электрического слоя (конденсатора) у заряженной поверхности индикаторного электрода. С понижением концентрации определяемого элемента отношение QF/IC) уменьшается, и это не позволяет достигать желаемого предела обнаружения [12; 72; 79; 131].
Для того, чтобы снизить предел обнаружения, необходимо увеличить отношение (IF/IC). Сделать это можно двумя способами. Первый заключается в использовании подачи поляризующего напряжения отдельными кратковременными импульсами и измерении тока, протекающего через ячейку до подачи импульса и в конце его. В конце импульса (1С) падает до ничтожно малой величины и отношение (IF/IC) значительно возрастает. Такая разновидность вольтамперометрии называется дифференциальной импульсной вольтамперометрией. Это наиболее современная и высокочувствительная разновидность вольтамперометрии, позволяющая определять до пх10 8 моль/л ионов в случае обратимой электрохимической реакции, протекающей с высокой скоростью переноса электронов [79].
Для многих объектов (поверхностные воды, биологические жидкости) такая чувствительность недостаточна. Радикальный способ улучшения отношения (IF/IC) заключается в предварительном концентрировании определяемого вещества на поверхности индикаторного электрода. Полученный концентрат затем при развертке потенциала подвергают электролитическому растворению. Поскольку в процессе концентрирования содержание определяемого элемента на поверхности электрода может на несколько порядков увеличиться по сравнению с анализируемым раствором, регистрируемый IF также значительно возрастет. Такой вариант вольтамперометрии получил название «инверсионная вольтамперометрия» (ИВА) (в англоязычной литературе stripping voltammetry) [79; 131]. Сочетание предварительного концентрирования определяемого элемента с использованием дифференциальной импульсной вольтамперометрии для регистрации вольтамперограммы позволяет достичь пределов обнаружения на уровне 10 10 - 10 п моль/л.
Электролитическое предварительное концентрирование впервые было использовано в начале 60-х годов прошлого века для определения примесей тяжелых металлов в особо чистых реактивах и воде, необходимых для бурно развивающейся тогда радиоэлектронной промышленности. Вольтамперомет-рический метод, использующий предварительное электролитическое концентрирование определяемого элемента с частичным или полным растворением его в индикаторном электроде, назвали анодной инверсионной вольтамперо-метрией [72].
Анодную инверсионную вольтамперометрию успешно применяют для одновременного определения следовых количеств ионов металлов, обладающих достаточно высокой растворимостью в ртути [10; 13; 14; 38]. К ним в первую очередь относят медь, свинец, кадмий и цинк. Разработаны простые и надежные методики определения этих элементов в разнообразных природных (воды поверхностные, грунтовые, морские, почвы, растения), биологических объектах и пищевых продуктах с пределами обнаружения порядка КГ8-Ю-9 моль/л [39; 136; 147].
Адсорбционное концентрирование появилось значительно позднее. Его суть заключается в том, что определяемый элемент накапливают в виде комплекса с адсорбированным на поверхности электрода лигандом. Концентрирование проводят при потенциале максимальной адсорбции лиганда, который устанавливают в предварительных экспериментах, в течение строго контролируемого времени при энергичном перемешивании раствора магнитной мешалкой. После выключения мешалки и успокоения раствора регистрируют катодную вольтамперограмму, изменяя потенциал электрода к более отрицательным значениям. На вольтамперограмме наблюдается пик восстановления вещества из комплекса, сконцентрированного на поверхности электрода, или реже пик восстановления лиганда из этого комплекса. При контролируемых условиях (состав фона, рН, потенциал и время адсорбции, площадь поверхности электрода, скорость перемешивания) высота пика линейно зависит от концентрации вещества в растворе.
Этот метод анализа получил название «адсорбционная катодная инверсионная вольтамперометрия» или просто «адсорбционная вольтамперо-метрия». В последнее двадцатилетие это один из самых надежных и чувствительных методов определения следовых количеств элементов в разнообразных объектах, особенно в объектах окружающей среды [72; 82; 146]. Таким образом, ценными особенностями вольтамперометрии являются:
1) высокая чувствительность, позволяющая определять малые концентрации исследуемого вещества (Ю-4- Ю-1! моль/л);
2) возможность исследования малых объемов исходного вещества — 1 - 2 капли (0,03 - 0,06 мл);
3) возможность одновременного проведения качественного и количественного анализа;
4) применимость метода к смесям веществ (без предварительного разделения, выделения и очистки компонентов);
5) возможность анализа смесей веществ, близких по строению и свойствам (гомологов, изомеров и т.п.);
6) высокая точность, быстрота исполнения, удобное и сравнительно простое аппаратурное оснащение.
Вольтамперометрическим методом можно определять концентрацию ионов и молекул органических и неорганических веществ в водных, неводных средах, в расплавах [86; 126; 127; 129; 131; 147].
Помимо аналитических целей вольтамперометрический метод применяют в решении вопросов кинетики химических и электрохимических реакций и строения вещества (кето-енольной таутомерии, цис-транс-изоме-рии), также для изучения адсорбции, растворимости, комплексообразова-ния, окислительно-восстановительных процессов и ряда других явлений [10; 69; 72]. Кроме того, его широко используют в биологии и фармакологии для анализа лекарственных средств, а в медицине - для диагностики заболеваний [4; 15; 56; 69; 80; 101; 102; 107; 255].
В настоящее время вольтамперометрию предлагают для анализа ряда биологически активных и лекарственных веществ, способных к электролитической диссоциации на катион, а также для установления или подтверждения структуры данных веществ, их синтеза и изучения промежуточных продуктов, процессов деструкции и в количественном анализе. Кроме того, данный метод успешно применяют для исследования фармакокинетики лекарственных препаратов и в анализе биологически-активных веществ группы алкалоидов, глицидов, гликозидов, витаминов, антибиотиков, противоопухолевых, бактерицидных, психотропных препаратов, транквилизаторов, гормонов, гормоноподобных веществ и т.д. [4; 33; 69; 101; 102; 294].
Анализ литературных данных показал, что методом инверсионной вольтамперометрии определяют незначительные количества лекарственных средств, применяемых при заболеваниях сердечно-сосудистой системы [4; 32; 33; 40; 157; 160; 234; 243; 259; 283; 294].
Результаты квантово-химического исследования молекул лекарственных средств
Исходя из анализа литературных данных по исследованию соединений, подобных нибентану, амиодарону, спираприла гидрохлориду, фозиноприла натрию, беназеприла гидрохлориду, карведилолу, представленных в Главе 1, можно придти к заключению об отсутствии методического подхода к оптимизации процесса поиска условий анализа различных классов химических соединений. Для рационализации данной стадии разработки методик исследования (теоретического обоснования электрохимической активности, выявления вольтамперометрически активных функциональных групп и установления конформационных особенностей исследуемых кардиопрепаратов) возможно использование на начальном этапе квантово-химических расчетов структуры молекул.
Для этого с помощью программы РМ-3 (RMS 0,1) провели оптимизацию геометрии исходных субстратов и вычислили пространственные структуры лекарственных веществ, представленные на рисунках 12 и 16.
При этом установили, что структура молекулы нибентана (рис. 12) характеризуется линейностью и наличием свободной нитрогруппы. Структура амиодарона демонстрирует ориентацию бензофуранового цикла в одной плоскости (рис. 12).
При расчете распределения электронных плотностей между всеми атомами, входящими в состав молекул (рис. 13, табл. 1), установлено, что в структуре нибентана наибольшей электрохимической активностью обладает нитрогруппа (рис. 13, атомы № 7, 8, 9) а также карбонильный фрагмент карбамидной функциональной группы (рис. 13, атомы № 14, 15), что согласуется с литературными данными [82; 99], отсюда можно предположить, что вероятный механизм электрохимического процесса соответствует предлагаемому Manuel М. Baizer и Henning Lynd (1988).
Механизм электрохимического процесса для мононитробензолов
В водных растворах при низких значениях рН нитробензол дает две полярографические волны. В присутствии поверхностно-активных веществ (ПАВ) или при высокой концентрации таких органических соединений, как, например, спирты, первая волна является четырехэлектронной, а вторая волна - двухэлектронной. В отсутствие поверхностно-активных веществ высота первой волны соответствует присоединению четырех — пяти электронов, но сумма высот первой и второй волны остается постоянной и отвечает шестиэлектронному процессу. Это рассматривают как результат протекания двух конкурирующих процессов, один из которых включает четырехэлек-тронное восстановление фенилгидроксиламина и его последующее двухэлек-тронное восстановление до анилина при более отрицательных потенциалах.
Другой процесс - это сочетание на поверхности электрода протонирован-ного нитробензола и фенилгидроксиламина, приводящее к азоксибензолу, и дальнейшему восстановлению последнего (рис. 14) [99].
Предполагают, что при восстановлении нитробензола в результате присоединения двух электронов образуется Т, Т-дигидроксианилин, который можно зафиксировать, если в бензольном кольце имеется электроно-акцепторный заместитель [99].
При исследовании структуры амиодарона обнаружено, что наибольшей электрохимической активностью обладает карбонильная группа, присутствующая между бензофурановым гетероциклом и фенильным радикалом, условно пронумерованная как 14-15 (рис.15; табл.2), высокое напряжение данной связи обусловлено значительной разницей в величине электронной плотности углерода и кислорода (0,410 в сравнении с - 0,309), что не соответствует нашим начальным предположениям по высокой электрохимической активности ковалентно-связанного йода в бензольном кольце [82; 99]. Активность последнего уступает таковой в связи (=С -О -), обозначенной как 32-39, и ( С = С ), обозначенной как 2-3.
Исходя из полученных результатов, можно сделать предположение о возможных механизмах реакций, проходящих на электродах.
Литературные источники предлагают следующие возможные механизмы электрохимического процесса для молекул органических соединений, где в процессе электролиза на поверхности электродов после перехода электрона может происходить образование реакционных частиц, обладающих неспа-ренным электроном (радикалов) или несущих электрический заряд (ионов).
Первой стадией электровосстановления кратных связей С=С, С=0, N=0 и т.п. может быть образование ион-радикалов
Образующиеся при электродных процессах ионы би-радикалы благодаря своей высокой реакционной способности вступают в многочисленные реакции, главными из которых являются димеризации, диспропорциониро-вания, взаимодействие с материалом электрода и т.д.
Предложенные механизмы реакций имеют место и в случае с амиода-роном. По литературным данным легче всего восстанавливаются иодзаме-щенные соединения, труднее всего (если вообще восстанавливаются) -фторзамещенные [192; 260; 271]. Полизамещенные соединения восстанавливаются легче монозамещенных. Накопление электроноакцепторных заместителей в а- и, в меньшей степени, р-положении облегчает восстановление галогенозамещенных соединений. Во многих случаях влияние заместителей можно оценить количественно, используя уравнение Гамета и Тафта. В отдельных случаях наблюдаются резкие отклонения от линейной зависимости, вытекающей из этих уравнений, это чаще всего связано с изменением направления реакции, например, с сопряженным отщеплением Р заместителя. Иногда введение -заместителя, например, оксогруппы делает возможным отрыв галогена по механизму типа сопряженного отщепления.
Соединения с двойной связью в а, ( -положении восстанавливаются гораздо труднее, чем соответствующие насыщенные соединения. Напротив, введение двойной связи в р,у-положение облегчает восстановление (а также предшествующую реакцию с материалом электрода). Алифатические и ароматические галогениды незначительно отличаются друг от друга по легкости восстановления [27; 99].
В случае с амиодароном имеет место замещение атомами йода бензольного кольца при этом в орто-положении к замещенным атомам находится алифатически замещенный фенольный гидроксил, а в мета-положении - карбонильная группа, что, вероятнее всего, будет облегчать процесс электрохимического отщепления галогенидов.
При этом восстановление будет происходить по механизму замены атома галогена на водород, которое может протекать в различных условиях: как на ртути, так и на платине, как в водных, так и в неводных средах. Донорами протонов могут служить и такие растворители, как ацетонитрил, а также катионы тетраалкиламмония. Если возможны альтернативные пути восстановления (образование гидродимера или металлоорганических соединений), то для осуществления реакции замены галогена на водород требуется наиболее отрицательный потенциал [192; 260; 271].
Результаты разработки методик количественного определения лекарственных средств вольтамперометрическим методом в растворе стандартного образца
Начальным этапом в разработке методики количественного определения нибентана являлся выбор оптимальных условий обнаружения аналитического сигнала.
Принимая во внимание результаты квантово-химического анализа (Гл. 3), где выявили высокую электрохимическую активность нитрогруппы, и, учитывая, что атом азота в указанной функциональной группе имеет высокую степень окисления, предпочли вариант катодной вольтамперометрии [99; 162; 163]. Оптимальным электродом был признан стеклоуглеродный, так как только на нем был выявлен сигнал нибентана (рис. 21).
На следующем этапе выбрали фоновый электролит (или индифферентный фоновый носитель), выполняющий несколько функций в вольтам-перометрическом анализе, он:
уменьшает сопротивление раствора как проводник 2-го рода;
образует комплексы с определяемыми или сопутствующими ионами;
в ряде случаев создает буфер для постоянства рН раствора;
предотвращает гидролиз многовалентных ионов (фоны - кислоты хлорная или серная);
предотвращает гидролиз и образует комплексы (кислоты хлороводородная, бромоводородная или фосфорная).
Химический состав фона влияет на:
обратимость электродного процесса;
вязкость раствора и коэффициент диффузии ионов;
адсорбцию ионов/молекул фона на поверхности электрода, а, следовательно, на увеличение остаточного тока и полезного сигнала;
ширину рабочей области потенциалов рабочего электрода [38].
В качестве фоновых электролитов исследовали растворы Бриттона-Робинсона; хлоридов натрия, лития, кальция; сульфатов и нитратов натрия, калия, аммония и ряда других квалификации ос.ч. и х.ч. Однако аналитические сигналы нибентана на данных фоновых электролитах были нечеткими и плохо воспроизводимыми, либо отсутствовали. Тогда как раствор калия хлорида обеспечивал необходимые условия для обработки сигнала и экспресс-анализа.
Оптимальная концентрация фона составила 0,01 моль/л. В более концентрированных растворах не наблюдали прироста от добавки при наличии большого остаточного тока, тогда как разбавление приводило к неустойчивости во времени. Выбранная же концентрация обеспечивала минимальный остаточный ток и максимальную величину аналитического сигнала. Существенным недостатком калия хлорида, является то, что большинство функциональных групп выявляются именно на данном фоне и экранируют нитро-группу.
В имеющихся на сегодняшний день вольтамперометрических методиках определения веществ, содержащих в своем составе указанную функциональную группу, данная проблема решается путем добавления 96 % этанола и 1 % раствора желатина. Этанол в данном случае играет роль поверхностно-активного вещества, тогда как желатин, представляющий собой биополимер (полидисперсную смесь полипептидов с молекулярной массой 50 — 70 кД, или же их агрегатов 200 - 300 кД), способен к образованию соединений включения или водородных связей с карбонильной группой нибентана тем самым открывая нитрогруппу для электрохимической реакции [37; 83; 112; 141]. Предложенный вариант определения использовали в нашем случае, причем, их количество установили экспериментально, что составило 0,45 и 0,05 мл, соответственно. При уменьшении или увеличении предложенных количеств этанола и 1 % раствора желатина аналитический сигнал нибентана значительно уменьшался (табл. 7, 8).
Параллельно с подбором фонового электролита определяли оптимальное значение рН электролиза. Литературные источники указывают на то, что соединения, содержащие в своем составе нитрогруппу, аминогруппу, или вещества производные бензамида, как и нибентан, обнаруживают электрохимическими методами при слабокислой или нейтральной рН [104; 111]. Исходя из этого, получали вольтамперограммы при рН, соответствующей 3 (к фоновому электролиту добавляли кислоты хлороводородную, серную или винную), 6-7 (фоновый электролит без добавления дополнительных веществ), 10 (к фоновому электролиту прибавляли натрия гидроксид). Результаты эксперимента показали, что в щелочной среде при подобранных условиях сигнал нибентана был слабо выражен, а в кислой - наблюдали резкое сужение рабочей области и наличие большого остаточного тока. Интерес представила вольтамперограмма, полученная в слабо-кислой - нейтральной среде при рН 6,0 - 7,0 без добавления буферных растворов. Таким образом, выбранное значение рН совпало со значением, рекомендуемым для анализа веществ, подобных нибентану [ 104].
Выполнив развертку вольтамперограммы в катодном и анодном направлениях, сделали вывод о целесообразности использования метода катодной вольтамперометрии в сочетании с квадратно-волновой формой развертки потенциала, поскольку в данном направлении сигнал нибентана более выражен. Это подтвердило предположения о том, что нитрогруппа нибентана, характеризуясь высокой степенью окисления, способна легко восстанавливаться в процессе предварительного электрохимического накопления определяемого элемента на поверхности рабочего электрода с последующей регистрацией вольтамперограммы, тогда как анодное направление подразумевает окисление исследуемого вещества. Также была замечена вторая волна восстановления нибентана в области (- 0,9) - 0,5 В, что еще раз подтверждает гипотезу об участии нитрогруппы в процессе электролиза.
Разработка вольтамперометрических методик количественного определения лекарственных средств в модельных смесях и лекарственных формах
В соответствии с Регистром лекарственных средств нибентан выпускают в виде инъекционной лекарственной формы состава: 1 мл раствора-концентрата для инфузий содержит нибентана 10 мг, натрия цитрата для инъекций 4,96 мг, кислоты лимонной 1,28 мг; в ампулах по 2 мл, в коробке 1 или 5 ампул [55; ПО; 124].
Модельные смеси готовили из субстанций нибентана, натрия цитрата и кислоты лимонной, приобретенных по каталогу Sigma-Aldrich. Для приготовления 100 мл исследуемого раствора на аналитических весах отвешивали 1,0 г нибентана, 0,496 г, натрия цитрата, 0,128 г лимонной кислоты.
В соответствии с данными по статистической обработке результатов исследования нибентана в растворе стандартного образца, оптимальная концентрация для количественного анализа лекарственного средства составляет 1-10 мг/мл, поэтому для анализа лекарственной формы дополнительного разведения полученного раствора не требовалось.
Модельную смесь анализировали вольтамперометрически в соответствии с п. 4.1. [21], при этом установили, что компоненты лекарственной формы не влияют на высоту сигнала нибентана и не изменяют его форму.
С целью проверки воспроизводимости, точности, чувствительности и линейности результатов определения нибентана по разработанной методике готовили модельные растворы в объеме 10 мл, в которых изменяли сдержа-ние нибентана (0,020; 0,040; 0,060; 0,080; 0,100; 0,120; 0,140; 0,160; 0,180; 0,200 г), тогда как количество натрия цитрата и лимонной кислоты оставалось постоянным и составляло 0,050 и 0,013 г на 10 мл, соответственно. Затем выполнили количественное определение нибентана в модельных смесях по предлагаемой методике. Полученные результаты количест венного определения статистически обработали с использованием оценки параметров линейной зависимости (табл. 18).
Исходя из статистических данных, коэффициент линейности составил 0,999, что свидетельствует о наличии прямолинейной зависимости результатов исследования от содержания нибентана в навеске, при этом электрохимическая методика чутко реагировала даже на незначительные (0,020 г) изменения в концентрации определяемого вещества, что говорит о ее специфичности и чувствительности.
Для испытания вольтамперометрической методики количественного определения нибентана в анализе лекарственных форм заводского производства использовали три серии (200902; 241002; 261002) концентратов раствора для инфузий 1 % в ампулах по 2 мл, произведенных Центром по химии лекарственных средств ФГУП (ЦХЛС-ВНИХФИ), предоставленные отделением нарушения ритма сердца ФГБУ НИИ кардиологии СО РАМН (в свободной продаже лекарственная форма нибентана отсутствует).
Ход анализа: 2 мл лекарственного препарата помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем раствора водой очищенной до метки и перемешивали. 5 мл полученного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем раствора водой очищенной до метки, перемешивали. В пластиковый стаканчик емкостью 40 мл помещали 20 мл 0,01 моль/л раствора калия хлорида, 0,05 мл 1 % раствора желатина и 0,45 мл 96 % этанола. Для исключения мешающего влияния кислорода раствор деаэрировали азотом в течение 180 с и проводили электролиз при следующих условиях: потенциал электролиза - 2,2 В, время электролиза -180 с. Фиксировали вольтамперограмму при квадратно-волновой форме развертки потенциала со скоростью 50 мВ/с и амплитуде импульса 11 мВ. Отсутствие посторонних сигналов на поляризационной кривой свидетельствовало о чистоте фона. Затем добавляли 0,01 мл исследуемого раствора нибентана и фиксировали вольтамперограмму для пробы, далее добавляли 0,01 мл 1 10 5 г/мл стандартного раствора нибентана, перемешивали и проводили электрохимическое накопление при тех же условиях. Аналитический сигнал нибентана регистрировали как пробу с добавкой в диапазоне потенциалов от 0,6 до 1,4 В. Время единичного анализа не превышало 10-15 мин.
При получении вольтамперных кривых исследуемых растворов установили, что полученные аналитические сигналы не отличаются от сигналов, соответствующих стандартному образцу и модельной смеси, также установили, что компоненты готовой лекарственной формы не мешают определению нибентана.
Валидацию полученных результатов осуществляли по фармакопейной методике определения: 2 мл лекарственного препарата помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем 0,1 моль/л раствором кислоты хлористоводородной до метки и перемешивали. 5 мл полученного раство pa помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем 0,1 моль/л раствором кислоты хлористоводородной до метки, перемешивали и измеряли оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 270 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм.
Одновременно измеряли оптическую плотность раствора рабочего стандартного образца (РСО) нибентана [26].
В качестве раствора сравнения использовали 0,1 моль/л раствор кислоты хлористоводородной.
Количественное определение нибентана выполнили параллельно спек-трофотометрической и вольтамперометрической методикой в трех образцах лекарственных форм в десяти повторностях каждый, результаты анализа подвергли статистической обработке с использованием оценки параметров линейной зависимости (табл. 19, 20, 21), во всех трех сериях коэффициент корреляции составил не менее 0,99.
Таким образом, установили, что результаты, полученные при количественном определении нибентана вольтамперометрическим методом коррелируют с результатами, полученными при анализе спектрофотометрическим методом. Следовательно, вольтамперометрическую методику целесообразно рекомендовать для анализа инъекционных форм с нибентаном.
![Стандартизация и контроль качества лекарственных средств группы фторхинолонов методами хроматографии и ИК-спектроскопии [Электронный ресурс]](/i/i/4375/184827.png "Стандартизация и контроль качества лекарственных средств группы фторхинолонов методами хроматографии и ИК-спектроскопии [Электронный ресурс] Коновалов Андрей Александрович")
