Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Ботанико-фармакогностическая характеристика крапивы двудомной 10
1.2. Фармакологическая активность и медицинское применение сырья и препаратов крапивы двудомной 18
1.3. Фармакологические свойства кальция. Лекарственные препараты кальция 27
1.4. Методы количественного определения ионов кальция в лекарственных препаратах и лекарственном растительном сырье 34
Выводы из главы 1 39
Глава 2. Объекты и методы исследования 40
2.1. Характеристика объектов 40
2.2. Методы исследования 40
Глава 3. Изучение гидрофильных биологически активных веществ листьев крапивы двудомной 42
3.1. Качественный анализ БАВ листьев крапивы двудомной 42
3.2. Определение показателей качества сырья крапивы 46
двудомной 46
3.3. Количественный анализ БАВ листьев крапивы двудомной 49
Выводы из главы 3 63
Глава 4. Количественное определение макроэлементов - кальция и магния в крапиве двудомной 64
4.1. Определение кальция и магния в крапиве двудомной методом атомно-абсорбционной спектроскопии 64
4.2. Комплексонометрическое определение кальция и магния в сырье крапивы двудомной 65
4.3. Валидация количественного определения ионов кальция в солянокислом извлечении из листьев крапивы 71
4.4. Потенциометрическое определение кальция в сырье крапивы двудомной.. 75
Выводы из главы 4 78
Глава 5. Изучение динамики накопления некоторых гидрофильных групп БАВ и макроэлементов кальция и магния в листьях крапивы двудомной 79
Вывод из главы 5 82
Глава 6. Изучение настоя и жидкого экстракта листьев крапивы двудомной 83
6.1. Определение некоторых показателей качества лекарственных форм крапивы двудомной 83
6.2. Количественное определение БАВ в настое и жидком экстракте крапивы двудомной 85
6.3. Определение кальция и магния в лекарственных формах крапивы двудомной 94
6.4. Получение экстракта крапивы, обогащенного кальцием 96
Выводы из главы 6 101
Глава 7. Изучение гомеопатических лекарственных форм, получаемых из крапивы двудомной 102
7.1. Изготовление гомеопатических лекарственных форм 102
7.2. Определение содержания БАВ в гомеопатических лекарственных формах из крапивы двудомной 104
7.3. Определение кальция и магния в гомеопатических лекарственных формах крапивы двудомной 106
Выводы из главы 7 108
Глава 8. Разработка проекта фармакопейной статьи для ГФ XII «Крапивы листья» 109
Выводы из главы 8 116
Общие выводы 117
Список литературы 119
Приложение
- Фармакологические свойства кальция. Лекарственные препараты кальция
- Комплексонометрическое определение кальция и магния в сырье крапивы двудомной
- Количественное определение БАВ в настое и жидком экстракте крапивы двудомной
- Получение экстракта крапивы, обогащенного кальцием
Введение к работе
Актуальность темы. Несмотря на достигнутые успехи в области синтеза лекарственных веществ, лекарственные растения остаются важным источником для получения лекарственных препаратов. В их число входят препараты, получаемые из листьев крапивы двудомной.
Крапива двудомная используется в официнальной и народной медицине в качестве кровоостанавливающего и витаминного средства, применяется в гомеопатии. Наиболее часто листья крапивы используются в виде настоя, также разрешен к применению жидкий экстракт.
Крапива двудомная изучалась достаточно подробно (работы Сошниковой О.В., Сапроновой Н.Н. и др.), однако данные о гидрофильной фракции биологически активных веществ (БАВ) растения представлены недостаточно. Действующая на настоящий момент нормативная документация на листья крапивы не отвечает современным требованиям стандартизации лекарственного растительного сырья (ЛРС).
Рост заболеваний, связанных с нарушением обмена кальция в организме (остеопороз, дефицит кальция у детей), обуславливает повышенный интерес к лекарственным средствам (ЛС), являющимися источниками кальция. Широкий спектр таких ЛС в аптеках представлен, в основном, синтетическими препаратами, которые имеют ряд побочных эффектов. В тоже время, минеральные вещества лекарственных растений (ЛР) находятся в биоусваиваемой форме и более эффективны в нормализации минерального обмена.
Листья крапивы двудомной, помимо богатого комплекса БАВ (флавоноиды, витамины, дубильные вещества, органические кислоты и др.), содержат значительное количество кальция, который переходит в жидкие лекарственные формы (работы Арзамасцева А.П., Листова С.А., Петрова А.В. и др.), поэтому, получаемые из сырья крапивы, настой и жидкий экстракт могут рассматриваться в качестве возможного источника кальция.
Целью исследования является углубленное изучение гидрофильной части БАВ и минерального состава метаболома крапивы двудомной, а также рассмотрение возможности получения лекарственной формы (ЛФ) крапивы двудомной, обогащенной кальцием.
Постановка задач и выбор средств для их решения:
Для осуществления поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
провести информационно-аналитическое исследование по вопросам изучения метаболома и биологической активности крапивы двудомной;
-
изучить гидрофильную фракцию БАВ и минеральный комплекс сырья крапивы двудомной;
-
уточнить и разработать характеристики листьев крапивы двудомной для создания проекта фармакопейной статьи (ФС) на сырье;
-
провести сравнительный анализ БАВ в сырье, аллопатических и гомеопатических лекарственных формах крапивы двудомной, используя принцип «сквозной стандартизации»;
-
изучить факторы, способствующие переходу кальция из сырья в ЛФ.
Решение задач осуществлялось путем обобщения данных литературы и проведения экспериментальных исследований.
Научная новизна. Дана подробная качественная и количественная характеристика гидрофильной фракции БАВ и минерального состава метаболома крапивы двудомной с использованием комплекса современных методов анализа (тонкослойная хроматография (ТСХ), атомно-абсорбционная спектрометрия, титриметрия, потенциометрия, спектрофотометрия). Идентифицированы: флавоноиды – рутин, кверцетин, лютеолин, кумарин – скополетин, кислоты – аскорбиновая, кофейная, галловая, хлорогеновая. Для определения содержания суммы свободных органических кислот, кислоты аскорбиновой, дубильных веществ, суммы флавоноидов, суммы гидроксикоричных кислот, хлорофилла, полисахаридов, восстанавливающих моносахаров, суммы свободных аминокислот, макроэлементов кальция и магния адаптированы действующие и разработаны оригинальные методики определения, защищенные двумя патентами РФ на изобретение.
В процессе исследований в сравнительном аспекте методик титриметрического анализа (титрование 2,6-дихлорфенолиндофенолятом натрия, йодометрия и йодатометрия) показана равноценная возможность их использования для анализа кислоты аскорбиновой в листьях и ЛФ крапивы. Установлено, что наиболее оптимальной для анализа является методика йодометрии.
Разработаны оригинальные методики комплексонометрического определения макроэлементов кальция и магния, и определения содержание кальция методом потенциометрии с использованием ионоселективного кальциевого электрода в листьях и ЛФ крапивы двудомной, методики защищены патентами РФ № 2466387 и № 2488818.
Подобраны условия увеличивающие переход кальция и магния из сырья в извлечение. Показана возможность получения методом дробной мацерации жидкого экстракта листьев крапивы двудомной, обогащенного ионами кальция. Дана качественная и количественная характеристика полученного экстракта.
Практическая значимость результатов исследования. На основании проведенных исследований:
разработан проект ФС «Крапивы листья» для ГФ XII изд. В проект ФС введены новые разделы «Количественное определение» и «Микробиологическая чистота», существенно дополнены разделы: «Внешние признаки» (добавлено описание порошков разной степени измельченности), «Микроскопия» (проведена визуализация и добавлены микроскопические характеристики на измельченное сырье и порошки), «Качественные реакции» (добавлены хроматографические характеристики сырья по аскорбиновой кислоте и флавоноидам), «Числовые показатели» (введены разработанные показатели содержания действующих веществ и показатели, характеризующие порошки крапивы);
в работу испытательной лаборатории ООО «ЦККЛС «Центр Экофарм» внедрена йодометрическая методика количественного определения аскорбиновой кислоты в лекарственном растительном сырье, содержащем витамины, и методика определение кальция в растительных биологически активных добавках (БАД) методом потенциометрии с использованием кальций-селективного электрода;
в учебный процесс кафедры фармакогнозии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России в тему «Лекарственное растительное сырье, содержащее витамины» внедрена альтернативная методика определения аскорбиновой кислоты методом йодометрии и йодатометрии.
Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведен мониторинг основных параметров, аналитическая и статистическая обработка, научное обоснование и обобщение полученных результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии во всех этапах исследования: от постановки задач, их теоретической и практической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях, докладах и внедрения их в практику.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 6 и 7 паспорта специальности фармацевтическая химия, фармакогнозия.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 6 статей – в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 2 патента РФ на изобретение.
Основные положения, выносимые на защиту:
результаты изучения состава и определения содержания биологически активных веществ (органических кислот, кислоты аскорбиновой, дубильных веществ, флавоноидов, гидроксикоричных кислот и хлорофилла, полисахаридов, восстанавливающих моносахаров, аминокислот, макроэлементов кальция и магния) в листьях и лекарственных формах крапивы двудомной;
данные по изучению ЛФ крапивы: настоя и жидкого экстракта из листьев крапивы, настоя гомеопатического и настойки матричной гомеопатической;
результаты исследований по разработке методик количественного определения макроэлементов кальция и магния в листьях и ЛФ крапивы двудомной.
Апробация диссертации. Основные положения диссертации доложены на XXI Московской Международной Гомеопатической конференции (Москва, 2011 г.), Итоговой Всероссийской научной конференции молодых исследователей с международным участием «Татьянин день» (Москва, 2011 г.), конференции «Вопросы стандартизации лекарственных препаратов» (секция молодых ученых) (Москва, 2010 г.), 5-й Международной научно-методической конференции «Фармобразование-2013. Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных веществ» (Воронеж, 2013 г.).
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (№ государственной регистрации 01.2.006 06352) по научной проблеме «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований».
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 131 странице машинописного текста, содержит 36 таблиц и 21 рисунок.
Работа состоит из введения, обзора литературы, 8 экспериментальных глав, выводов, библиографии из 135 наименований, из которых 14 на иностранных языках и 3 интернет ресурса, приложений.
Фармакологические свойства кальция. Лекарственные препараты кальция
Макроэлементы сконцентрированы преимущественно в мышечной, костной, соединительной тканях и в крови [115]. Одним из важных для организма макроэлементов является кальций. Кальций - распространенный макроэлемент в организме растений, животных и человека. В организме человека и других позвоночных большая его часть содержится в скелете и зубах в виде фосфатов [94]. В организме взрослого человека находится 1 - 1,5 кг этого элемента, из всех его запасов около 98% сосредоточено в хрящевой и костной тканях, 1% кальция распределен в мягких тканях, крови и других жидкостях организма. Кальций выполняет многие важные физиологические функции, участвуя во всех жизненных процессах организма:
играет важнейшую структурную и пластическую роль в организме. Он входит в состав основного минерального компонента костной ткани -оксиапатита;
является важнейшим компонентом системы свертывания крови, активирует ряд ферментов и гормонов;
регулирует всю клеточную деятельность, придает стабильность мембране клетки, образуя связи между фосфолипидами, структурными белками и гликопротеидами. Кальций обеспечивает межклеточные связи, помогая тканеобразованию;
необходим для проведения нервного импульса и сокращения мышц;
регулирует сердечные сокращения;
способствует стабилизации тучных клеток и тормозит высвобождение гистамина, уменьшая тем самым проявления аллергических реакций, болевого синдрома и воспалительных процессов;
участвует в формировании иммунного ответа;
оказывает антистрессовое и антиоксидантное действие;
способствует выведению из организма солей тяжелых металлов и радионуклидов, препятствует накоплению свинца в костной ткани;
снижает уровень холестерина в крови;
препятствует поглощению организмом радиоактивного стронция-90.
Одна из важнейших ролей кальция - обеспечение нормального функционирования и целостности костного скелета и зубов. Содержащийся здесь кальций находится в состоянии динамического равновесия с кальцием в кровеносной системе и служит буфером для поддержания стабильного его обмена. Сам по себе скелет не является местом депонирования кальция, в организме постоянно происходит образование новых кристаллов кальция и разрушение старых [94, 135]. Скорость этого разрушения непостоянна, она зависит от возраста человека, пола и физиологического состояния. Потеря костной ткани начинается раньше и происходит с резкими последствиями чаще у женщин, чем у мужчин. В результате возникает остеопороз и сопряженный с ним риск переломов костей. При этом уменьшение костной массы долгое время протекает без каких-либо внешних проявлений.
Ионы кальция играют главную роль в процессе образования неорганического вещества костной ткани (оссификации). Наряду с неорганическими солями в состав межклеточного вещества костной ткани входят органические вещества, в основном коллаген [94]. Ионы кальция образуют несколько солей с анионами фосфорной кислоты. При рН 7,4 (физиологический уровень) в растворе одновременно существуют гидрофосфат- и дигидрофосфат-ионы. Далее происходит депротонирование гидрофосфат-иона, заканчивающееся образованием основной соли - кальция фосфата (термодинамически устойчивой формы в условиях, характерных для организма).
Наряду с кристаллическим кальция гидроксидфосфатом в костную ткань входит аморфный кальция фосфат, содержание которого уменьшается по мере взросления и старения организма. Ученые считают, что аморфный кальция фосфат является лабильным резервом ионов кальция и фосфат-ионов в организме. Помимо ионов кальция, фосфат- и гидроксид-ионов, в костной ткани обнаруживаются ионы натрия, калия, магния, хлорид-ионы и др. Некоторые из этих ионов в кристаллической решетке гидроксидфосфата замещают Са2+ (двухзарядные катионы), а некоторые — ОН" (однозарядные анионы), эффект изоморфизма. Ионы, не способные к изоморфному замещению, могут находиться, либо в растворенном, либо в адсорбированном состоянии.
При образовании костной ткани зуба наряду с гидроксидфосфатом кальция образуется и кальция фторид-фосфат. Известно, что зубная эмаль контактирует с большими объемами жидкостей, что является физико-химическим фактором, способствующим растворению эмали. Кальция фторид-фосфат имеет более плотную упаковку ионов в кристаллической решетке, чем кальция гидроксидфосфат, что повышает устойчивость зубной эмали к растворению. Другим защитным фактором является повышенная концентрация ионов кальция в слюне [135].
Нормальное содержание ионов Са в организме поддерживает непосредственно сам организм, с помощью кальций-фосфатной буферной системы.
Структура кристалла кальция гидроксидфосфата и наличие аморфного кальция фосфата обеспечивают легкость обмена костной ткани ионами с окружающими тканевыми жидкостями. В организме человека костная поверхность имеет площадь около 2000 км". При кальцийдефицитных состояниях происходит частичное растворение кальция гидроксидфосфата, за счет чего концентрация ионов кальция в тканевых жидкостях выравнивается [94]. Поддержание концентрации ионов кальция на постоянном уровне (2,25—2,75 ммоль/л; 90—110мг/л) обеспечивают костная ткань и плазма крови, содержащая фосфат-ионы.
Функционирование кальциевого буфера регулируется гормонально. Одним из таких гормонов является паратгормон, секреция которого усиливается при понижении концентрации ионов кальция в крови [106]. При резорбции межклеточного вещества образуются органические кислоты, в основном молочная, это сдвигает рН в кислую область и облегчает растворение кальция фосфатов. При повышении концентрации ионов кальция в крови усиливается секреция кальцитонина, который уменьшает число остеокластов, угнетает резорбцию костной ткани и активизирует минерализацию. Наряду с паратгормоном и кальцитонином, в регуляции концентрации ионов кальция во внеклеточной жидкости принимает участие гормон кальцитриол [42].
Нарушение регуляции концентрации ионов кальция приводит к гипо- и гиперкальциемии. При гипокальциемии нервно-мышечная возбудимость повышается, вследствие чего могут возникать судороги и спазмы. При гиперкальциемии нервно-мышечная возбудимость, наоборот, понижается, что в результате может привести к коме [54].
Ионы кальция могут образовывать и другие малорастворимые соединения в организме. Так, на поздних стадиях атеросклероза происходит обызвествление склеротических бляшек сосудов кальция карбонатом.
При нарушении обмена веществ могут локально повышаться концентрации некоторых ионов. При увеличении концентрации оксалат-ионов в организме образуются отложения оксалата кальция, так называемые оксалатные камни. В состав конкрементов при мочекаменной болезни входят также аммония-магния фосфат, кальция карбонат-фосфат, различные кальция фосфаты, кислота мочевая и ее соли [94].
Кальций играет огромную роль в поддержании нормальной жизнедеятельности человеческого организма, и исключение не составляет кровеносная система. Одной из важнейших функций крови является гемостатическая. Свертывание крови - сложный физико-химический процесс, протекающий как in vivo (в области раны), так и in vitro. Идет по каскадному механизму, в котором принимают участие как минимум 15 белков плазмы крови, тканевой белок, ионы кальция и тромбоциты. Свертывание крови проходит в три стадии. На второй стадии происходит образование тромбина из протромбина под действием фермента - тромбокиназы, это происходит только в присутствии солей кальция [115, 135]. Одной из причин может являться гиповитаминоз витамина К].
Комплексонометрическое определение кальция и магния в сырье крапивы двудомной
К существенным недостаткам метода ААС относятся невозможность одновременного определения нескольких элементов, длительная трудоемкая пробоподготовка образца, исследуемого при анализе, использование в процессе анализа дорогостоящих приборов и специфических для каждого элемента мощных ламп с полым катодом, которые излучают свет, содержащий спектральные линии исследуемого элемента и необходимость использования государственных стандартных образцов элементов для получения сравнительных спектров поглощения. Таким образом, при проведении рутинного анализа сырья, содержащего существенные количества кальция и магния, ААС является неоправданно дорогим и трудоемким методом.
В российских и зарубежных нормативных документах, в лекарственных субстанциях и лекарственных формах, содержащих кальций и магний, ионы этих металлов определяют комплексонометрическим титрованием [30, 118, 123, 125]. Достаточно высокое содержание в крапиве кальция и магния дает повод к изучению возможности использования этого метода для количественного определения этих элементов в ЛРС.
При изучении возможности использования комплексонометрического титрования для определения Са и Mg в сырье крапивы вначале были рассмотрены химические процессы, протекающие при титровании. Проведен выбор индикатора, использование которого дает лучшие результаты - эриохрома черного Т, мурексида, хромогена темно-синего.
При определении кальция комплексонометрическим методом, в системе протекают следующие процессы. Индикатор мурексид NH4H4Ind в щелочной среде частично нейтрализуется (1), образуя с катионами кальция комплекс розово-красного цвета (2).
НДпсГ + 20Н- = H2Ind3" + 2Н20 (1)
Са2+ + H2Ind3" = CaH2Ind" (красный) (2)
При титровании образуется бесцветный, растворимый кальция эдетеат CaY2" (3), в рассматриваемых условиях ЭДТА присутствует в растворе в форме Y4":
Ca2+ + Y4" = CaY2"(3)
Вблизи точки эквивалентности (ТЭ) разрушается комплекс СаНгЬкГ красного цвета с образованием сине-фиолетовых анионов H2Ind3 , вследствие этого окраска раствора из красной переходит в сине-фиолетовую (4).
CaH2Ind" + Y4" = CaY2" + H2Ind3" (4)
При титровании магния с индикатором эриохромом черным Т протекают следующие процессы. Введение индикатора H3Ind в исходный анализируемый образец приводит к образованию растворимого красно-фиолетового комплекса магния Mglnd" с индикатором по схеме (5). Исходный анализируемый образец окрашивается в красно-фиолетовый цвет.
H3Ind = Hind2" + 2\Ґ
Mg2+ + Hind2" = Mglnd" + H (5)
При добавлении титранта образуется растворимый, устойчивый, бесцветный комплекс магния с ЭДТА состава MgY2+ (6). Вблизи ТЭ менее устойчивый комплекс красно-фиолетового цвета Mglnd" разрушается с образованием более стабильного комплексоната синего цвета MgY2" (7). Окраска раствора в ТЭ изменяется из красно-фиолетовой на сине-голубую.
Mg2+ + HY3" = MgY2" + Н+ (6)
Mglnd + HY3" = MgY2" + Hind2" (7)
Наибольшее количество магния содержится в молекулах хлорофилла, минимальное количество - в виде солей, образованных с органическими кислотами. При действии сильных минеральных кислот соли магния разрушаются, и магний в виде растворимой соли переходит в извлечение. В листьях крапивы двудомной кальций содержится в друзах и цистолитах, в свободном (ионном) виде, в комплексной соли и в виде нерастворимой соли.
В обосновании возможности комплексонометрического определения Са и Mg с раствором №ЭДТА были использованы константы устойчивости (Ку) и нестойкости (К„) соответствующих комплексов, приведенных Лурье Ю.Ю. и соавт. (1971).
Кальций в свободной форме (Са2+)может быть оттитрован раствором №ЭДТА без пробоподготовки, т.е. из извлечения. При взаимодействии Са в виде комплексного аниона (8) с раствором №ЭДТА будет устанавливаться совместное лигандообменное равновесие (9), общая константа реакции больше Ю3, реакция будет протекать необратимо.
При взаимодействии Са в виде соли - кальция оксалата - устанавливается совмещенное гетерогенно-лигандное равновесие, реакция протекает обратимо и идет преимущественно в сторону образования продуктов реакции.
Кальций в листьях крапивы может существовать в виде тартаратного, цитратных (моногидроцитратного, дигидроцитратного) комплексов. Проведенные расчеты констант устойчивости комплексов показали, что при нахождении Са, в ЛРС в перечисленных выше состояниях, он будет оттитровываться раствором КаЭДТА, так как во всех случаях Ку комплексов Са меньше Ку Са с раствором №ЭДТА.
Данные по Ку комплекса кальция салицилата отсутствуют. Данные о существовании кальция в форме солей с органическими кислотами, наиболее часто встречающимися в растениях, в литературе не представлены.
Таким образом, в ходе проведенных исследований была установлена возможность использования комплексонометрического титрования для количественного определения кальция, находящегося в растении, как в свободном, так и связанном виде.
Количественное определение БАВ в настое и жидком экстракте крапивы двудомной
В соответствии с системным подходом к оценке качества ЛРС и ЛФ, получаемых из ЛРС, разработанным членом-корреспондентом РАМН Самылиной И.А. и сотрудниками кафедры фармакогнозии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова, следует оценивать количественное содержание БАВ в ЛФ с помощью методик, применяемых в определении содержания БАВ в листьях крапивы двудомной. В связи с этим, методики количественного определения БАВ в ЛРС (глава 3) были модифицированы к изучаемым ЛФ: настою (1:10) и жидкому экстракту (1:1).
Содержание суммы свободных органических кислот в пересчете на кислоту яблочную в лекарственных формах крапивы двудомной определяли по следующей модифицированной методике: 5 мл настоя или жидкого экстракта помещали в колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 10 мл воды очищенной, 1 мл 1%-го спиртового раствора фенолфталеина, 2 мл 0,1%-го раствора метиленового синего и тировали 0,1 М раствором натрия гидроксида до появления в пене лилово-красной окраски.
Содержание свободных органических кислот в пересчете на кислоту яблочную в настое и жидком экстракте в процентах (X) вычисляли по формуле где 0,0067 - количество кислоты яблочной, соответствующее 1 мл раствора натрия гидроксида (0,1 М), в г; V - объем раствора натрия гидроксида (0,1 М), пошедшего на титрование, в мл; V - объем ЛФ, г; а - объем ЛФ, взятой для титрования, в мл.
Установлено, что содержание суммы свободных органических кислот в пересчете на кислоту яблочную составило в настое 1,471±0,002 мг% и в жидком экстракте 6,152±0,003 мг% (табл. 6.2.1).
Для определения содержания кислоты аскорбиновой в лекарственных формах листьев крапивы двудомной была модифицирована методика определения этого вещества, изложенной в ГФ XI ст. 38 «Плоды шиповника» (титрование 2,6-дихлорфенолиндофенолятом натрия) (табл. 6.1.2, рис. 6.2.1). В коническую колбу вносили 5 мл настоя или жидкого экстракта, 5 мл воды очищенной, 5 мл 2%-го раствора кислоты хлористоводородной, перемешивали и титровали из микробюретки раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (0,001 моль/л) до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 30 - 60 с.
Содержание кислоты аскорбиновой в настое и жидком экстракте в процентах (X) вычисляли по формуле: Vx 0,000088x100 где 0,000088 - количество кислоты аскорбиновой, соответствующее 1 мл раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (0,001 моль/л), г; V - объем раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (0,001 моль/л), пошедшего на титрование, мл; V - объем ЛФ, г; а - объем ЛФ, взятой для титрования, в мл.
Также была модифицирована методика йодометрического определения содержания кислоты аскорбиновой (табл. 6.1.2, рис. 6.2.1): в коническую колбу вносили 5 мл настоя или жидкого экстракта, 5 мл воды очищенной, 1 мл 0,1 М раствора кислоты серной, 5 капель раствора крахмала и титровали 0,1 Н раствором йода до появления синего окрашивания, не исчезающего в течение 3 мин.
Содержание кислоты аскорбиновой в настое и жидком экстракте в процентах (X) вычисляли по формуле
Установлено, что содержание кислоты аскорбиновой составило по методике ГФ XI в настое 0,0296±0,0001 мг%, в жидком экстракте 0,0367±0,0001 мг%, по йодометрической методике в настое содержалось 0,0326±0,0002 мг% кислоты аскорбиновой, в жидком экстракте 0,0386±0,0001 мг%.
Содержание дубильных веществ в настое и жидком экстракте крапивы двудомной определяли по модифицированной фармакопейной методике: в коническую колбу вносили 5 мл настоя или жидкого экстракта, прибавляли 100 мл воды очищенной, 5 мл раствора индигосульфокислоты и титровали при постоянном перемешивании 0,02 М раствором калия перманганата до золотисто-желтого окрашивания. Параллельно проводили контрольный опыт. 1 мл раствора калия перманганата (0,02 М) соответствует 0,004157 г дубильных веществ в пересчете на танин.
Содержание дубильных веществ (X) в пересчете на танин в процентах в ЛФ вычисляли по формуле (V- Y0 X 0,004157 X 100 где V - объем раствора калия перманганата (0,02 М), израсходованного на титрование испытуемого раствора, в мл; V - объем раствора калия перманганата (0,02 М), израсходованного на титрование в контрольном опыте, в мл; 0,004157 -количество дубильных веществ, соответствующее 1 мл раствора калия перманганата (0,02 М) в пересчете на танин, в г; V - объем ЛФ, в г; а - объем ЛФ, взятой для титрования, в мл.
Содержание дубильных веществ в пересчете на танин составило в настое 3,476±0,009 мг%, в жидком экстракте - 4,017±0,003 мг% (табл. 6.2.3).
Определение содержания гидроксикоричных кислот и хлорофилла в ЛФ крапивы двудомной проводили по следующей методике: 0,5 мл настоя или жидкого экстракта переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили объем до метки 70% спиртом этиловым. Оптическую плотность полученного раствора измеряли на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 325±5 нм и 663±5 нм (приложение 1, рис. 1). В качестве раствора сравнения использовали 70% спирт этиловый.
Содержание суммы гидроксикоричных кислот в процентах (X) в пересчете на кислоту хлорогеновую в ЛФ вычисляли по формуле: Ах 25 х 100 Х= Vx 507x0,5 где А - оптическая плотность полученного раствора; V - объем ЛФ, г; 507 - удельный показатель поглощения Е\0/м кислоты хлорогеновой при 325±5 нм.
Содержание хлорофилла в процентах (X) в жидком экстракте вычисляли по формуле: Ах 25x100 Х V х 944,5 х 0,5 где А - оптическая плотность полученного раствора; V - объем ЖЭ, г; 944,5 - удельный показатель поглощения Е] м хлорофилла при 663±5 нм. В настое содержание хлорофилла не определяли, так как хлорофилл, являлся липофильным веществом, в гидрофильные среды (воду) плохо экстрагируется. Содержание гидроксикоричных кислот в пересчете на кислоту хлорогеновую в настое и жидком экстракте составило 2,417±0,001% и 1,541±0,001% соответственно, содержание хлорофилла в жидком экстракте составило 1,055±0,003%.
Получение экстракта крапивы, обогащенного кальцием
Изучение метаболома крапивы двудомной показало, что листья растения богаты кальцием. Принимая во внимание литературные данные о том, что макро-и микроэлементы лекарственных растений лучше усваиваются организмом человека [1, 39, 53, 107, 133, 135] была изучена возможность получения жидкого экстракта крапивы, обогащенного кальцием.
На первом этапе исследования были изучены факторы, которые могли бы увеличить переход кальция из ЛРС в экстрагент. Как уже говорилось ранее (глава 4) Са в листьях крапивы двудомной находится в друзах, цистолитах и свободном виде (ионном и в виде комплексных солей). Для того, чтобы увеличить переход Са в экстрагент, ЛРС можно обработать сильной минеральной кислотой, например, хлористоводородной, при этом друзы, состоящие из кальция оксалата, и цистолиты, состоящие из кальция карбоната, разрушаются, Са высвобождается из тканей растения и переходит в извлечение.
Для изучения возможности высвобождения Са из солей при воздействии кислоты хлористоводородной в реальных условиях эксперимента (концентрация реагентов не равна 1 моль/л) с использованием данных справочника Лурье Ю.Ю. (1971 г.) содержание Са в листьях крапивы (1,5%) было пересчитано на молярную концентрацию, которая составила 3,75 10" моль/л.
Расчет энергии Гиббса процессов взаимодействия кислоты хлористоводородной с солями Са показал, что оптимальным условием для получения ионных форм Са является экстракция 8% раствором кислоты хлористоводородной.
Для подтверждения этого положения были проведены микроскопические исследования. По ст. 25 ГФ XI изд. Характерными анатомо-диагностическими признаками являются друзы, расположенные в мезофилле, и цистолиты, находящиеся в клетках эпидермиса [18, 29, 101, 102, 103].
Были приготовлены и изучены микропрепараты листа крапивы с поверхности до и после обработки ЛРС 8% раствором кислоты хлористоводородной. Стандартный микропрепарат листа крапивы с поверхности получали по следующей методике: 10 кусочков листовой пластинки помещали в колбу, прибавляли 5% раствор натрия гидроксида, и кипятили в течение 5 мин. Затем содержимое выливали в чашку Петри, жидкость сливали, а сырье тщательно промывали водой очищенной. Из воды кусочки сырья вынимали скальпелем, помещали на предметное стекло в каплю раствора глицерина, закрывали покровным стеклом, прогревали и исследовали под микроскопом.
Для изучения воздействия на ЛРС 8% раствора кислоты хлористоводородной 10 г измельченных листьев крапивы помещали в колбу, заливали 8% раствором кислоты хлористоводородной и аккуратно нагревали на водяной бане под вытяжным шкафом в течение 20 мин. Остужали и фильтровали, извлечение сливали, а листья крапивы, из которых была получена кислотная вытяжка, сушили в течение 3 ч при комнатной температуре на листах фильтровальной бумаги. Затем брали 10 кусочков листовой пластинки и из сырья готовили микропрепарат по стандартной методике. В результате было установлено, что в сырье, использованном для получения солянокислого извлечения, друзы отсутствуют, а цистолиты либо растворяются, либо от них остается только оболочка (рис. 6.4.1, 6.4.2).
Был проведен сравнительный анализ содержания Са и Mg в водном извлечении из листьев крапивы и в извлечении, для получения которого использовали 8% раствор кислоты хлористоводородной.
Содержание Са в солянокислом извлечении определяли по следующей методике: около 5 г (точная навеска) сырья помещали в колбу со шлифом вместимостью 200 мл, прибавляли 100 мл воды очищенной, колбу присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Затем колбу охлаждали до комнатной температуры и фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 200 мл, доводили объем фильтрата водой очищенной до метки. К полученному извлечению добавляли раствор натрия гидроксида концентрированный для осаждения катионов магния в виде магния гидроксида, т.к. они мешают определению, катионы кальция остаются в анализируемом образце. Полученный осадок отфильтровывали, а фильтрат нейтрализовали кислотой хлористоводородной концентрированной до рН = 10 - 12. Далее в коническую колбу вносили 25 мл полученного фильтрата, 25 мл воды очищенной, небольшое количество индикаторной смеси хромогена темно-синего и титровали раствором трилона Б (№ЭДТА) (0,05 М) до перехода красной окраски в сине-фиолетовую.
Для определения Mg в солянокислом извлечении около 5 г (точная навеска) сырья помещали в колбу со шлифом вместимостью 200 мл, прибавляли 100 мл 8% раствора кислоты хлористоводородной, колбу присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 15 мин. Затем колбу охлаждали до комнатной температуры и фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 200 мл, доводили объем фильтрата 8% раствором кислоты хлористоводородной до метки. Затем в коническую колбу вносили 25 мл полученного фильтрата, 25 мл воды очищенной, 3 мл концентрированного аммиака, аммиачного буфера до рН = 10, небольшое количество индикаторной смеси пирокатехинового фиолетового и титровали раствором трилона Б (ЫаЭДТА) (0,05 М) до перехода зелено-голубой окраски в сине-фиолетовую.
Полученные данные показали, что использование в качестве экстрагента 8% раствора кислоты хлористоводородной увеличивает переход Са из листьев крапивы в извлечение в 2,4 раза, Mg - в 1,7 раза.
Методом дробной мацерации в лабораторных условиях был изготовлен жидкий экстракт (1:1) листьев крапивы с использованием в качестве экстрагента 50% спирта этилового, подкисленного до рН=2 кислотой хлористоводородной концентрированной (Са-жидкий экстракт).
Изготовленный Са-жидкий экстракт соответствовал всем требованиям ОФС «Экстракты» ГФ XI, вып. 2.
Он представлял собой прозрачную жидкость бурого цвета, кислого вкуса, без специфического запаха. В процессе хранения, также как и при хранении классического жидкого экстракта крапивы, выпадал небольшой осадок. рН Са-жидкого экстракта 2,09. Сухой остаток для этого экстракта составил 7,079±0,001%.
Полученный Са-жидкий экстракт крапивы был проанализирован на содержание флавоноидов, Са и Mg с использованием разработанных ранее методик. Результаты представлены в табл. 6.4.2.
