Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Ботанико-географическая характеристика растений семейства Крапивные (Urticaceae) 10
1.1.1. Общая характеристика семейства Urticaceae 10
1.1.2. Характеристика рода крапива Urtica 11
1.1.3. Морфологические признаки крапивы двудомной 11
1.1.4. Морфологические признаки крапивы коноплевой 13
1.1.5. Географическое распространение и места обитания видов крапивы. 14
1.2. Современное состояние исследования крапивы двудомной и крапивы коноплевой. 17
1.2.1. Химический состав и применение крапивы двудомной 17
1.2.2. Химический состав и применение крапивы коноплевой 23
1.2.3. Растительные лекарственные средства, используемые для лечения и профилактики геморрагических состояний 24
Выводы к главе 1 28
Экспериментальная часть
Глава 2. Материалы и методы исследования 29
2.1. Характеристика объектов исследования 29
2.2. Методики исследования 30
2.2.1. Методики химического исследования биологически активных веществ крапивы коноплевой. 30
2.2.2. Хроматографический анализ фенольных соединений 45
2.2.3. Спектральные методы анализа 47
2.2.4 Методики морфологического и микроскопического исследования 48
2.2.5. Методики товароведческого исследования 48
2.2.6. Методы статистической обработки результатов исследований 48
Глава 3. Химическое исследование крапивы коноплевой и крапивы двудомной 49
3.1. Качественное исследование основных групп биологически активных веществ 49
3.2. Изучение состава флавоноидов и фенолкарбоновых кислот и их идентификация 53
3.2.1. Препаративное выделение фенольных веществ 54
3.2.2. Идентификация флавоноидов и фенолкарбоновых кислот с использованием УФ-спектроскопии 60
3.2.3. Исследование качественного состава фенольных соединений методом ВЭЖХ 66
3.3. Изучение полисахаридного комплекса крапивы коноплевой 69
3.4. Определение аминокислотного состава крапивы коноплевой 70
3.5. Изучение элементного состава крапивы коноплевой 72
3.6. Количественное определение биологически активных веществ в сырье крапивы коноплевой и крапивы двудомной 77
3.6.1. Определение количественного содержания кислоты аскорбиновой 77
3.6.2. Определение количественного содержания суммы каротиноидов 79
3.6.3. Определение количественного содержания витамина К 80
3.6.4. Определение количественного содержания суммы дубильных веществ 82
3.6.5. Определение количественного содержания кумаринов 83
3.6.6. Определение количественного содержания суммы фенолкарбоновых кислот 84
3.6.7. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов 85
Выводы к главе 3 96
Глава 4. Морфолого-анатомическое изучение крапивы коноплевои 98
4.1. Морфологические признаки крапивы коноплевой 98
4.2 Микроскопическое изучение крапивы коноплевой 99
Выводы к главе 4 113
Глава 5 . Стандартизация сырья крапивы коноплевой 114
5.1 Определение подлинности сырья на основании морфолого-анатомических признаков 114
5.2. Определение товароведческих показателей доброкачественности сырья 116
5.3. Методики качественного обнаружения биологически активных веществ 119
5.4. Методики количественного определения биологически активных веществ 120
5.5. Определение сроков заготовки сырья 124
5.6. Установка срока годности сырья крапивы коноплевой 125
Выводы к главе 5 128
Общие выводы 129
Список используемой литературы 130
Приложения
- Химический состав и применение крапивы двудомной
- Изучение элементного состава крапивы коноплевой
- Микроскопическое изучение крапивы коноплевой
- Методики количественного определения биологически активных веществ
Введение к работе
Актуальность темы
В настоящее время изучение и использование лекарственных растений в практике здравоохранения приобретает все большие масштабы. Это объясняется мягким пролонгированным действием биологически активных веществ растений на организм человека и почти полным отсутствием токсичности. Расширение номенклатуры лекарственных растений и средств растительного происхождения является актуальной задачей фармацевтической и медицинской науки, так как спрос на них удовлетворен менее чем на 40 % [РЛС,2007]. Одним из подходов для внедрения новых лекарственных растений в официнальную медицину является изучение растений, близких к фармакопейным видам, и широко применяемых в народной медицине. Одним из таких растений является крапива коноплевая (Urtica cannabina L.) семейства крапивные (Urticaceae). Из данных литературы известно, что наряду с крапивой двудомной, крапива коноплевая применяется в качестве кровоостанавливающего, поливитаминного и общеукрепляющего средства [Телятьєв В.В., 1987; Носов A.M., 1999]. Несмотря на то, что этот вид широко распространен на всей территории Восточной Сибири, данных о его фитохимическом изучении не обнаружено.
Фармакопейным видом является крапива двудомная, у которой в качестве сырья используются листья (ГФ XI, вып. 2, Ст. 25). Следует отметить, что листья крапивы коноплевой считаются примесью и не подлежат заготовке [Инструкция..., 1987]
На основании вышеизложенного, фармакогностическое изучение крапивы коноплевой в качестве нового вида лекарственного растительного сырья является актуальным и позволит расширить сырьевую базу лекарственных растений, обладающих кровоостанавливающим действием.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы явилось изучение химического состава, определение показателей подлинности и доброкачественности сырья крапивы коноплевой.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
установить химический состав и количественное содержание основных биологически активных веществ в надземной части крапивы коноплевой в сравнении с химическим составом сырья крапивы, двудомной;
исследовать морфологическое и анатомическое строение надземной
части крапивы коноплевой и выявить основные диагностические признаки сырья;
разработать методику количественного определения суммарного содержания флавоноидов в листьях крапивы коноплевой и крапивы двудомной;
установить показатели доброкачественности сырья крапивы коноплевой и разработать нормативную документацию - проект фармакопейной статьи предприятия (ФСП) «Крапивы коноплевой листья».
Научная новизна работы
Изучены биологически активные вещества надземной части
крапивы коноплевой. Установлено, что в их состав входят витамины
(кислота аскорбиновая, каротиноиды и витамин К); флавоноиды (рутин,
кемпферол, изорамнетин и их гликозиды); фенолкарбоновые кислоты
(хлорогеновая, цикориевая и феруловая); дубильные вещества
конденсированной и гидролизуемой групп; кумарины (умбелиферон).
Полисахаридный комплекс представлен водорастворимыми
полисахаридами, пектиновыми веществами и гемицеллюлозами. Мономерный состав перечисленных фракций включает в себя нейтральные моносахариды (глюкоза, арабиноза, галактоза и ксилоза) и уроновые кислоты. Изучен макро- и микроэлементный состав надземной части крапивы коноплевой (стеблей и листьев), который представлен 58 элементами, из которых доминирующими являются калий, кальций, магний, железо и цинк. Определен аминокислотный состав, идентифицированы 21 аминокислота, среди которых 8 незаменимых.
Проведены макро- и микроскопические исследования надземной части крапивы коноплевой, выявлены основные диагностические признаки для сырья - листьев крапивы коноплевой.
Разработана методика дифференциального
спектрофотометрического определения содержания суммы флавоноидов в пересчете на кверцетин, изучена динамика накопления этих веществ по фенофазам и в онтогенезе растения.
Осуществлена стандартизация сырья крапивы коноплевой. Разработан проект фармакопейной статьи предприятия (ФСП) «Крапивы коноплевой листья» и инструкция по заготовке и сушке сырья.
Практическая значимость работы
Определены анатомо-диагностические признаки сырья и предложены методики качественного и количественного анализа биологически активных соединений с использованием методов бумажной
и тонкослойной хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии и УФ - спектрофотометрии.
Разработаны Инструкция по сбору и сушке лекарственного сырья и проект ФСП на сырье «Крапивы коноплевой листья».
Материалы диссертации используются в учебном процессе кафедры фармакогнозии с курсом ботаники ГОУ ВПО «ИГМУ».
Определены эксплуатационный запас и объем возможных ежегодных заготовок сырья крапивы коноплевой на территории Баяндаевского, Зиминского, Ольхонского, Слюдянского и Усть-Ордынского районов Иркутской области.
Апробация работы и публикации
Основные положения диссертационной работы доложены и
обсуждены на научно-практической конференции «Фармация XXI века:
достижения, проблемы и пути их решения» (Санкт-Петербург, 2008); 63-й
региональной научно-практической конференции по фармации и
фармакологии (Пятигорск, 2008); 64-й региональной научно-
практической конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2009); международной научно-практической конференции «Фармация Казахстана: интеграция науки, образования и производства», посвященной 30-летию химико-фармацевтического факультета Южно-Казахстанской государственной медицинской академии (Шымкент, 2009), И-ой итоговой конференции молодых ученых Иркутского государственного медицинского университета (Иркутск, 2009).
Химический состав и применение крапивы двудомной
Химический состав крапивы двудомной всесторонне изучен. В литературе имеются сведения о содержании биологически активных веществ во всех органах данного растения. В медицинской практике используются все части крапивы двудомной, однако, применяются они при разных заболеваниях и имеют сильно отличающийся химический состав.
Листья крапивы двудомной богаты витаминами: К или филлохинон (42-45мкг/г), пантотеновая кислота, каротиноиды (р-каротин, ксантофилл, виолаксантин) [29, 59, 60, 63, 89, 124]. Зола содержит минеральные вещества: до 20%, (СаО -24-33%, К20 - 14-20%, MgO -3-10%, Fe203 - 3-6%, Na20 - 1-2%, Р205 4-9%, Si02 - 6-10%, хлориды 4-6%, медь -0,4 мг%, марганец 6 мг%, алюминий 16 мг%, следы кобальта и цинка) [67, 96]; фенолкарбоновые кислоты (кофейная, 0-кумаровая, феруловая) [89,132]; хлорофилл (2-5%) [63, 96, 124], протопорфирин, ситостерин, холин, бетаин, фитонциды, камедь [84, 117]. Содержание флавоноидов, в основном кверцетина и его гликозидных форм (кверцетин, рутин, гиперозид, лютеолина-7-гликозид) по разным литературным данным составляет от 0,7 до 1,8%. Можно отметить высокое содержание кумаринов (эскулин и эскулетин) [96,110,133,134]. В свежих листьях обнаружены 2 мг% ацетилхолина, 3 мг% гистамина (он обеспечивает вместе с содержащейся там же муравьиной кислотой при соприкосновении с крапивой сильное раздражение на коже), 0,02 мг%о серотонина, а вот в сухом сырье этих веществ уже практически не остается [115]. Из органических кислот в листьях крапивы двудомной содержатся: масляная, яблочная, щавелевая, лимонная, янтарная, уксусная, муравьиная. Некоторые авторы отмечают присутствие вещества с неопределенной формулой, так называемого "глюкокинина", который в эксперименте на животных обладает инсулиноподобным действием [130].
В свежих молодых листьях очень высокое содержание аскорбиновой кислоты [28,45,61,115].
Корневища содержат 5% золы, на 10 % состоящей из окиси кальция, а также производного кумарина - скополетина и около 1 % фитостеринов (3-(3-ситостерин, ситостерин-3-Р-О-глюкозид и др.). Обнаружены фенилпропаны, а так же лигнаны относительно редкого типа [109]. Содержатся свободные аминокислоты: аргинин, аспаргиновая, глутаминовая и др. кислоты, а также протеины и углеводы [14, 61].
Из водного экстракта корневищ крапивы был выделен редкий лектин с низкой специфической агглютинизирующей активностью. Растительные лектины группы гликопротеинов способны узнавать и связывать сахарные остатки. Лектины также были выделены из семян бобовых и вегетативных органов некоторых других растений. Лектин из корневищ крапивы названный UDA (U. dioica agglutinin) способен склеивать эритроциты, независимо от группы крови. Он также стимулирует синтез у-интерферона в человеческих лимфоцитах. При аналитическом ионообменном хроматографическом изучении 102 индивидуальных образцов крапивы были найдены 11 различных изолектинов. Дальнейшие исследования прояснили, что UDA является смесью 6 изолектинов, которые имеют одинаковые молекулярные структуры и проявляют идентичную углевод-связующую специфичность и агглютинизирующие свойства.
UDA ингибирует клеточную пролиферацию, причем проявляет большую активность чем лектины из других видов растений. Учитывая, что это соединение представлено в корневищах крапивы в значительном количестве (0,1% в пересчете на сухое вещество), оно может внести существенный вклад в лечение воспалительных заболеваний, включая простатит [39,76,67].
Плоды содержат 25-33% жирного масла, 78-83% которого составляет цислиноловая кислота, а кроме нее 1 % линоленовой кислоты, 0,1 % 5-токоферола и 3-8% каротиноидов. Кроме того, обнаружены белки и минеральные вещества [14, 29, 59,89].
Крапива двудомная входит в фармакопеи очень многих стран мира. Это растение широко применяется научной медициной. В европейских странах чаще используют корневища, в нашей стране - листья или всю надземную часть.
Спектр применения этого растения чрезвычайно широк. Больше всего в России и странах СНГ известно кровоостанавливающее действие крапивы, которое связывают с присутствием значительных качеств витамина К, и поэтому ее используют при маточных, легочньк, почечных, желудочно-кишечных и геморроидальных кровотечениях. Применяют водный настой или жидкий спиртовой экстракт листьев. Однако препараты этого растения сильно повышают свертываемость крови и противопоказаны при тромбозе и повышенной свертываемости крови [115].
Настой листьев усиливает деятельность пищеварительных желез, уменьшает метеоризм, обладает желчегонным действием. Листья крапивы двудомной входят в состав препарата аллохол [61]. Жидкий экстракт применяют при атеросклерозе, он снижает содержание холестерина, в крови, а у животных с экспериментальным аллоксановым диабетом заметно снижает содержание сахара в крови и повышает утилизацию глюкозы тканями. Содержащиеся в сырье-витамины, хлорофилл и соли железа стимулируют эритропоэз, повышают уровень гемоглобина и активизируют сердечно-сосудистую систему и газообмен в легких [29]. Крапиву включают в общеукрепляющие сборы. Водный настой широко применяют в качестве противовоспалительного средства при заболеваниях суставов. Зачастую это средство помогает уменьшить боли при обменных артритах и ревматоидном полиартрите [61,62,96].
Настои крапивы используют местно в виде примочек и ванночек при экземах и дерматитах, а также при трофической язве голени, ожогах, долго не заживающих ранах. Она входит в состав сбора, который используют при рожистом воспалении [ПО, 111]. В свежем виде листья применяются при гнойных язвах, свищах. При остеомиелите применяется сок в виде компрессов. Из крапивы как источника хлорофилла, получен препарат уртифиллин, применяемый для лечения язвы желудка [61], а мази и эмульсии на его основе эффективны как антибактериальные средства при ранах и ожогах [ПО]. Отвар корней и корневищ используется в виде компрессов при фурункулезе, кожной сыпи, угрях.
В средние века основные направления применения крапивы, сегодня во многом забытые, были хорошо известны. А. Амасиаци (XV в., 1990) рассчитывал на прекращение кровохарканья, втяжения внутрь выпавшей матки (средства, эффективные при пролапсе и птозе матки, в современной медицине отсутствуют), на излечение инфекционного гепатита. Еще в XI в. было известно, что крапива «истечение месячных гонит» и «с вином помогает желтушным». (Одо из Мена, XI в., 1976, с. 104). Крапива повышает либидо, потенцию. Она является не только желчегонным, но и гепатопротективным средством. Крапива входит в состав полифитохола, созданного на основе заимствованного из тибетской медицины блока растений и включающего крапиву. Полифитохол снижает процессы перекисного окисления липидов на мембранах гепатоцитов, уменьшает цитолиз, холестаз, что коррелирует со снижением АЛТ, ACT, щелочной фосфатазы в сыворотке крови крыс с токсическим, вызванным СО 4 гепатитом. Полифитохол проявлял высокие защитные свойства при гепатитах, вызванных тетрациклином, галактозамином. Следовательно, крапива в сочетании с другими растениями-гепатопротекторами должна использоваться для профилактики и лечения гепатотоксических реакций, вызванных туберкулостатиками,, органическими растворителями и ядами из спектра соединений, определяющих наличие профессиональных вредностей, бытовой химией, алкоголем и его суррогатами.
Представление о крапиве как о гепатопротективном и детоксикационном средстве подкрепляется и результатами экспериментов. Отвар листьев препятствовал падению детоксикационной функции печени при инъекции мышам СО4, снижал токсическое, диабетогенное действие аллокеана и оказывал лечебное действие на аллоксан-диабетических животных, уменьшал число эрозивных токсикодистрофий желудка при инъекции животным атофана, бутадиона, резерпина. Если еще в V—VII вв. одним из принципов индо-тибетской медицины было включение блока гепатопротекторов в сборы для лечения тяжелобольных, то сегодня такие блоки должны быть обязательной составной частью фитотерапии большинства пациентов [13, 14].
В 80-х годах прошлого века крапива привлекала внимание андрологов. С тех пор были проведены многосторонние клинические исследования на большом числе пациентов, страдающих доброкачественной гиперплазией предстательной железы (ДГПЖ). В 1986 г. Комиссия Немецкого Федерального Министерства Здравоохранения выдала разрешение на применение подземных органов крапивы двудомной. Клиническими показаниями для использования корневищ крапивы являются: расстройства мочеиспускания, связанные с легкой и средней степенью ДГПЖ.
Изучение элементного состава крапивы коноплевой
Известно, что микроэлементы могут быть активаторами или ингибиторами процессов роста, развития растений и регуляции их продуктивности; выступать как компоненты ферментных систем или их коферментов. Из встречающихся в природе элементов 81 обнаружен в организме человека, при этом 15 из них (железо, йод, медь, цинк, кобальт, хром, молибден, никель, ванадий, селен, марганец, мышьяк, фтор, кремний, литий) признаны эссенциальными, т.е. жизненно необходимыми.
Макро- и микроэлементы растений оказывают несомненный терапевтический эффект в лечении человека, так как находятся в наиболее доступной и усвояемой форме и в наборе, свойственном живой природе в целом [1, 41, 46, 48, 92,]. Следовательно, определение элементного состава надземной части крапивы коноплевой представляет интерес для оценки возможности ее использования.
Полученные в результате исследования данные представлены в таблице 11.
Абсолютная погрешность определения соответствует уровню доверительной вероятности Р = 0,95.
Из данных приведенных в таблице 11, следует, что в листьях и стеблях крапивы коноплевой обнаружено 7 макро-, 51 микро- и ультрамикроэлемента, которые по степени убывания могут быть расположены в следующие ряды: в листьях макроэлементы K Ca Mg S P Si Na; в стеблях макроэлементы K Ca Mg P S Si Na; в листьях микро- и ультрамикроэлементы Sr Fe Ba Mn Al Zn Rb Li Br Cu Ti Mo Ni Se Co Cr Pb V As Ce W Zr La Nd Y Ga Ge Cd Pr Sn Th Sm U Gd Dy Hg Ag Tl Er Yb Bi Hf Ho Tb Eu Lu Tm Au; в стеблях микро- и ультрамикроэлементы Sr Fe Al Ba Rb Zn Mn Li Cu Ti Br Ni Cr Pb Mo Se V Co As Ce Zr La Nd Ge Y Ga Cd W Sn Pr Th Sm Gd Ag U Dy Er Yb Tl Hf Bi Ho Eu Tb Tm Lu Ta Au.
Нами установлено, что изучаемый вид растительного сырья, кроме известных элементов (магния, кальция, фосфора, алюминия, железа, бария, цинка), которые накапливают практически все растения в разных количествах и соотношениях, отличается содержанием следующих элементов, которые можно разделить на следующие группы:
1. Важнейшие: Си, Zn, Mn, Fe, Mo, Р, Со, Cr, S.
2. Условно важнейшие: Ва, Ni, Si, V.
3. Токсичные: Bi, Pb, Al, Hg, Sn, As.
4. Потенциально токсичные: Ті, Ga, Ge, Zr.
Полученные данные мы сопоставили со средними величинами содержания микроэлементов для растений сходных зон произрастания (кларк, К) [48]. При содержании элементов в количестве, превышающем К в 2-9 раз, растение рассматривается в качестве умеренного накопителя, а при превышении К на 1-2 порядка и более - в качестве "сверхконцентратора" элементов (Ловкова М.Я, Соколова СМ. Бузук Г.Н, 1999). Таким образом, согласно данной классификации крапива коноплевая является "сверхконцентратором" калия и кальция, а также умеренным накопителем железа и хрома.
Высокое содержание фосфора и марганца согласуется с их важной ролью в процессе биосинтеза продуктов первичного и вторичного метаболизма. Довольно высокое содержание магния объясняется тем, что он входит в состав хлорофилла, которого, как известно, много в листьях крапивы коноплевой. Магний принимает участие в регуляции функций нервной системы, способствует усвоению кальция, предупреждает развитие атеросклероза, поддерживает иммунитет и повышает устойчивость клеток к повреждающим факторам. Железо, входит в состав гемоглобина эритроцитов и миоглобина мышц, участвует в транспорте кислорода тканям, поддерживает функциональную активность цитохромов. Известно, что достаточное количество цинка активизирует Т-клеточный иммунитет. Медь участвует в окислительном фосфорилировании, влияет на функции желез внутренней секреции, оказывает инсулиноподобное действие и обуславливает антиоксидантную активность. Велико ее значение в процессах кроветворения, при синтезе гемоглобина и фермента цитохрома. Фосфор участвует во всех видах обмена веществ, необходим для нормального функционирования нервной системы, сердечной мышцы. Содержание фосфора также велико. Молибден участвует в защитных функциях и реакциях организма. Он повышает фагоцитарную активность лейкоцитов дезинтоксикационного действия [41, 46, 51, 77].
Содержание важнейших макро- и микроэлементов в листьях крапивы коноплевой значительно превосходит их количество в стеблях, в то время как, содержание токсичных и потенциально токсичных элементов в стеблях растения выше, чем в листьях. Это позволяет сделать вывод о том, что в качестве лекарственного растительного сырья следует применять листья крапивы коноплевой.
Минеральные компоненты растения подчеркивают его терапевтическую значимость и позволяют использовать данный вид в дальнейшем для комплексного создания лекарственных средств.
Микроскопическое изучение крапивы коноплевой
Проведенный нами микроскопический анализ позволил выявить следующие диагностические признаки в анатомическом строении надземных органов крапивы коноплевой.
Микроскопия листовой пластинки. Для исследования были приготовлены препараты верхней и нижней поверхности листа. При рассмотрении препарата с поверхности под микроскопом с верхней стороны листовой пластинки видны изодиаметрические клетки эпидермиса с извилистыми стенками, имеющие значительное количество цистолитов точечной структуры, погруженных в палисадную ткань, с хорошо различимой ножкой (фото 7, 8). Устьица аномоцитного типа, мелкие, располагаются на уровне клеток эпидермиса, встречаются редко. Важным диагностическим признаком являются трихомы. Характерно наличие нескольких видов волосков по всей поверхности эпидермиса листа:
жгучий волосок, расположенный на высоком многоклеточном выросте представляет собой клетку продолговатой формы, расширенной у основания с суженным к верху кончиком в виде легко обламывающегося шаровидного вздутия.
простой одноклеточный волосок остроконечной формы с расширенным, но слабо погруженным основанием.
ретортовидный волосок с бородавчатой кутикулой.
головчатый волосок с короткой одноклеточной ножкой и 2 -клеточной головкой (рис 11).
Клетки эпидермиса нижней стороны листовой пластинки имеют более извилистые стенки. Устьица располагаются часто, крупные, широко открытые. Жилки сильно выступают над поверхностью листовой пластинки, выступ образован проводящим пучком и паренхимой. Волоски идентичны располагающимся на верхней стороне листа. В мезофилле встречаются остроконечные друзы оксалата кальция, ориентированные группами вдоль жилок (рис. 12, 13 и фото 3, 7, 5).
Микроскопия черешка. Черешок листа в поперечном разрезе подковообразной формы. С наружи покрыт эпидермой с утолщенными наружными стенками. Под эпидермой находятся 1-2 слоя уголковой колленхимы. На поперечном срезе видны 5 проводящих коллатеральных пучков открытого типа, расположенные по периферии сечения. По всей поверхности черешка встречаются простые и железистые трихомы (рис. 14 и фото 8, 10).
В паренхиме черешка встречаются одиночные остроконечные друзы оксалата кальция (фото 9).
Микроскопия стебля. Стебель в поперечном сечении многоугольной формы. Край поперечного среза волнистый. Клетки эпидермиса стебля тонкостенные. При рассмотрении с поверхности на ребрах несколько вытянуты вдоль стебля, в межреберьях - более короткие. Отчетливо видны простые, головчатые и жгучие волоски. Устьица располагаются в межреберьях (рис. 16 и фото 11, 12, 13). В поперечном срезе клетки эпидермиса мелкие, короткие. Под эпидермисом залегает уголковая колленхима. Основная ткань стебля представлена крупноклеточной паренхимой. В клетках паренхимы встречаются друзы оксалата кальция. В центре сердцевины имеется полость. Волокна в коре имеют рыхлую слоистость (рис. 15 и фото 14, 15 , 16).
Порошок листа крапивы коноплевои. Для исследования элементов порошка листьев крапивы коноплевои воздушно-сухое сырье измельчали в ступке и просеивали через сита с диаметром отверстий 0,5; 1,0 и 2,0 мм. После просеивания получали фракции с размером частиц от 0,5 до 1,0 мм, от 1,0 до 2,0 и менее 0,5 мм. Каждую фракцию подвергали микроскопическому анализу. Для приготовления препаратов использовали методики в ГФ XI.
Анализ результатов микроскопических исследований показал, что оптимальный размер частиц составляет 1,0 мм.
При рассмотрении порошка листьев крапивы коноплевои под микроскопом видны клетки эпидермиса и элементы губчатого мезофилла.
Встречаются обрывки спиралевидных проводящих сосудов с друзами оксалата кальция. Также отчетливо видны фрагменты жгучих волосков, головчатые волоски и волоски с бородавчатой кутикулой (рисунок 17).
Методики количественного определения биологически активных веществ
Кислота аскорбиновая. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито (ТУ 23.2.2068-89) с диаметром отверстий 1 мм. Около 20,0 г сырья (точная навеска) помещают в колбу вместимостью 500 мл, прибавляют 300 мл воды очищенной и настаивают в течение 10 минут, затем перемешивают и фильтруют. В коническую колбу вместимостью 100 мл вносят 1 мл полученного фильтрата, 1 мл 2% раствора кислоты хлористоводородной, 13 мл воды, перемешивают и титруют из микробюретки раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (0,001 моль/л) до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 30-60 секунд. Титрование продолжают не более 2 минут. В случае интенсивного окрашивания фильтрата или высокого содержания аскорбиновой кислоты [расход раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (0,001 моль/л) более 2 мл], обнаруженного пробным титрованием, исходное извлечение разбавляют водой в 2 раза.
Содержание аскорбиновой кислоты в пересчете на абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле: Х= У 0.000088 « 300 100 »100 ,где т 1 (100- W) 0,000088 - количество.аскорбиновой кислоты, соответствующее 1мл раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (0,001 моль/л), в граммах; V - объем раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (0,001 моль/л) пошедшего на титрование, в миллилитрах; т - масса-сырья в граммах; W— потеря в массе при высушивании сырья в процентах. Примечание 1. Приготовление раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (0,001 моль/л): 0,22 г 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия растворяют в 500 мл свежепрокипяченной и охлажденной воды при энергичном взбалтывании. Раствор фильтруют в мерную колбу на 1 л и доводят объем-раствора до метки-водой. Срок годности раствора не более; 7 суток при условии хранения в холодном, темном месте.
Показатель «Количество кислоты аскорбиновой» должен быть не менее 260 мг %.
Флавоноиды. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих через сито (ТУ 23.2.2068-89) с диаметром отверстий 2мм. Около 1,0 г (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 150 мл, прибавляют 30 мл 90% спирта этилового, содержащего 3% кислоты хлористоводородной концентрированной. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 минут, периодически встряхивая для удаления частиц сырья со стенок. После чего колбу с содержимым охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу на 100 мл. Экстракцию повторяют еще раз указанным выше способом, затем еще один раз 90% спиртом этиловым в течение 30 минут. Извлечения фильтруют через тот же фильтр в ту же мерную колбу, промывают фильтр 90% спиртом этиловым. Объем фильтрата доводят до метки 90% спиртом этиловым (раствор А).
В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 1 мл раствора А и 1 мл раствора алюминия» хлорида в 95% спирте этиловом, доводят объем полученного раствора 95% этиловым спиртом до метки. Через 30 минут измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 430 нм в кювете с толщиной слоя 10мм. В качестве раствора равнения используют раствор, состоящий из 1 мл извлечения, 1 капли кислоты уксусной разведенной и доведенный 95% этанолом до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.
Содержание суммы агликонов флавоноидов (Х%) в пересчете на кверцетин-стандарт в абсолютно сухом сырье, вычисляют по формуле: Х= 100 25 100 ,где 764,6 т»(100-W) D — оптическая плотность испытуемого раствора; 764,6 — удельный показатель поглощения с комплекса с алюминия хлоридом при 430 нм; т — масса сырья, в граммах; W— потеря в массе при высушивании сырья, в процентах. Примечание 2 .Приготовление 5% раствора алюминия хлорида в 95% спирте этиловом: 5 г алюминия хлорида (ГОСТ 3759-75, х.ч., ч.д.а.) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 50 мл 95% этилового спирта и доводят объем раствора до метки спиртом аналогичной концентрации.
Показатель «Количество флавоноидов в пересчете на кверцетин-стандарт» должен быть не менее 1,3 %.
Результаты комплексного фармакогностического исследования листьев крапивы коноплевои послужили основой для создания нормативной документации: проекта фармакопейной статьи «Листья крапивы коноплевои» (таблица 35).
