Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Характеристика растений рода Alchemilla L 11
1.1.1. Систематика рода Alcheinilla L, 11
1.1.2. Ареал, растительные зоны и места обитания растений рода манжетка 13
1.1.3. Влияние антропогенных факторов на развитие манжетки 15
1.1.4. Заготовка и сушка травы манжетки 16
1.1.5. Использование манжетки в научной и народной медицине России и других стран 16
1.1.6. Состояние изученности химического состава и фармакологической активности манжетки 18
1.2. БАВ противодиабетического действия 21
Выводы по главе 1 23
Экспериментальная часть
Глава 2. Объекты и методы исследования
2.1. Объекты исследования 25
2.2. Методы исследования 27
2.2.1. Макро и микроскопические методы анализа 27
2.2.2. Методы обнаружения и идентификации БАВ 28
2.2.3. Методики количественного определение БАВ 30
2.2.4. Фитоценотические и ресурсоведческие методы исследования 33
2.2.5. Методы определения технологических параметров 34
2.2.6. Методы фармакологического исследования 36
2.2.7. Статистическая обработка данных 42
Глава 3. Сравнительное фармакогностическое изучение видов рода Alchemilla L.
3.1. Исследования морфолого-анатомических признаков 43
3.2. Сравнительный фитохимический анализ видов рода Alchemilla L. 53
3.2.1. Изучение качественного состава 53
3.2.2 Количественное определение 56
Выводы по главе 3 57
Глава 4. Исследования к разработке проекта «Инструкции по заготовке травы манжетки»
4.1. Изучение динамики накопления БАВ травы манжетки 58
4.1.1. Динамика качественного состава флавоноидов и других фенольных соединений 58
4.1.2. Содержание БАВ в органах манжетки обыкновенной и в образцах сырья, заготовленного в разные фазы вегетации 64
4.1.3. Динамика морфометрических показателей 66
4.1.4. Сезонная динамика накопления флавоноидов, полисахаридов, окисляемых веществ и аскорбиновой кислоты 70
4.1.5. Обнаружение и динамика накопления свободных аминокислот 74
4.2. Ресурсоведческие исследования 80
4.2.1. Содержание БАВ в образцах травы манжетки из разных районов заготовки 80
4.2.2. Накопление микроэлементов в траве манжетки 87
4.2.3. Ресурсоведческие характеристики манжетки обыкновенной на модельных лугах 93
4.2.4. Изучение перспективы использования отавы при заготовке травы манжетки 100
4.2.5. Особенности заготовки травы манжетки и прогноз запасов сырья 104
Выводы по главе 4 105
Глава 5. К разработке проекта фармакопейной статьи «Манжетки трава»
5.1. Показатели подлинности 106
5.2. Числовые показатели 109
5.3. Разработка и валидация методики количественного определения суммы флавоноидов 112
Выводы по главе 5 122
Глава 6. Экстракционные лекарственные формы из травы манжетки
6.1. Исследования по оптимизации условий приготовления настоя травы манжетки 123
6.2. Исследование химического состава настоя травы манжетки 125
6.2.1. Обнаружение и количественное определение флавоноидов, полисахаридов, окисляемых веществ и аскорбиновой кислоты 125
6.2.2. Обнаружение и количественное определение свободных аминокислот в настое травы манжетки 131
6.3. Разработка и стандартизация экстракта травы манжетки сухого 132
6.3.1. Оптимизация условий экстрагирования 132
6.3.2. Технологическая схема получения экстракта 135
6.3.3. Исследование качественного состава экстракта 137
6.3.4. Количественное определение БАВ в экстракте 139
6.3.5. Изучение элементного состава экстракта травы манжетки 140
6.3.6. Параметры стандартизации и установление срока годности экстракта 141
6.3.7. Определение технологических параметров экстракта травы манжетки сухого 149
Выводы по главе 6 149
Глава 7. Фармакологическая активность фитопрепаратов травы манжетки
7.1. Острая токсичность 151
7.2. Гипогликемическая активность 152
7.2.1. Гипогликемическая активность настоя травы манжетки 152
7.2.2. Гипогликемическая активность экстракта травы манжетки сухого 156
7.3. Иммунотропная активность 164
7.3.1. Иммунотропная активность настоя травы манжетки 164
7.3.2. Иммунотропная активность экстракта травы манжетки 167
Выводы по главе 7 172
Общие выводы 173
Список литературы 175
- Состояние изученности химического состава и фармакологической активности манжетки
- Исследования морфолого-анатомических признаков
- Разработка и валидация методики количественного определения суммы флавоноидов
- Гипогликемическая активность экстракта травы манжетки сухого
Введение к работе
Аісгуальность темы. Одной из глобальных медико-социальных проблем мирового здравоохранения является стремительный рост распространения сахарного диабета. Экспертами ВОЗ сахарный диабет был признан неинфекционной эпидемией XX века. Сахарный диабет поражает большое число людей всех социальных групп во всем мире, им страдают от 1,5 до 5% населения планеты. Экспертная прогностическая оценка позволяет считать, что к 2010 году в мире будет насчитываться более чем 230 млн., а к 2025 году - 300 млн. больных сахарным диабетом, из которых 80-90% приходится на больных диабетом 2-готипа.
Поиск и разработка новых высококачественных и безопасных препаратов для лечения и профилактики сахарного диабета - одна из актуальных задач современной фармацевтической науки.
Фармакотерапевтическая активность фитопрепаратов обусловлена гармоничным сочетанием биологически активных веществ. Гипогликемическую активность обусловливают флавоноиды, которые способствуют увеличению ионов кальция, и стимуляции секреции инсулина р-клетками поджелудочной железы; аскорбиновая кислота, потенцирующая саха-роснижающий эффект флавоноидов; полисахариды препятствующие всасыванию углеводов в кишечнике. Эти группы веществ, а также полифенольные соединения оказывают противовоспалительный, диуретический, антигипоксический и другие эффекты важные в комплексной терапии сахарного диабета.
Растения рода Alchemilla L. перспективны для изучения в данном аспекте. Они широко распространены на территории Европейской части России, в том числе Пермского края, который является одним из центров видообразования рода.
Цель исследования - изучение возможности использования в медицинской практике травы манжетки и фитопрепаратов из неё в качестве противодиабетических средств.
Задачи исследования:
Изучить морфолого-анатомические признаки и фигохимические характеристики видов манжетки в Пермском крае, объективно представляющих род Alchemilla L.
Исследовать эколого-ценотические характеристики манжетки обыкновенной, приёмы и сроки заготовки, и динамику накопления биологически активных веществ (БАВ) сырья для разработки «Инструкции по заготовке и сушке травы манжетки». Обосновать возможности и перспективы заготовки и запасы сырья манжетки в Пермском крае
Изучить товароведческие показатели, разработать методику количественного определения БАВ травы манжетки для проекта фармакопейной статьи «Alchemillae herba» -«манжетки трава».
Определить оптимальные условия получения экстракта травы манжетки сухого и разработать проект нормативной документации-ФСП на экстракт травы манжетки сухой.
Изучить фармакологическую активность травы манжетки и экстракта травы манжетки сухого.
Научная новизна. Проведено комплексное фармакогностическое исследование нового вида сырья - трава манжетки.
Выявлены диагностические признаки в морфолого-анатомическом строении вегетативных и генеративных органов 20 видов рода Alchemilla L. и содержащиеся в них БАВ: флавоноиды, полисахариды, аскорбиновая кислота, окисляемые вещества
Изучена динамика накопления в траве манжетки БАВ, в том числе свободных аминокислот в течение вегетационного периода. Изучено влияние сезонного изменения морфометри-ческих показателей на содержание БАВ в траве манжетки.
Определены запасы сырья и выявлены перспективы заготовки травы манжетки в Пермском крае. Исследована возможность использования отавы в качестве дополнительного источника сырья манжетки.
Выявлена гипогликемическая и гиполипидемическая активность настоя и экстракта травы манжетки сухого. Выявлено иммунокорригирующее действие настоя и экстракта травы манжетки сухого, развитие которого связано с их способностью восстанавливать фагоцитоз, уровень Т- и В-лимфоцитов, экспрессию рецепторов иммунокомпетентных клеток. Приоритет проведённых исследований подтверждён Патентом РФ на изобретение (Заявка на выдачу патента № 2008100346/15(000378), решение от 28.11.2008г.)
Практическая значимость.
Научно обоснована возможность заготовки травы манжетки от сборного вида Alchemilla vulgaris L. и использования травы манжетки в качестве лекарственного средства и сырья для получения экстракта травы манжетки сухого.
Разработан проект «Инструкции по заготовке и сушке травы манжетки».
Определены ресурсы травы манжетки и перспективы её заготовки в Пермском крае.
Разработана и валидирована методика количественного определения суммы флавонои-дов в траве манжетки. Методика адаптирована для сквозной стандартизации настоя и экстракта травы манжетки сухого.
Установлены параметры стандартизации травы манжетки, показатели качества включены в проект ФС «Alchemillae herba» - «манжетки трава».
Получена субстанция «экстракт травы манжетки сухой», установлены параметры её стандартизации, установлена гипогликемическая, иммунокоррегирующая и гиполипидемическая активность. Показатели качества включены в проект ФСП «Extractum herbae Alchemillae siccum» - «Экстракт травы манжетки сухой». Разработан лабораторный технологический регламент получения экстракта травы манжетки сухого. Проведена апробация получения экстракта травы манжетки сухого на ООО «Биохиммаш», г. Москва.
Результаты проведённых исследований используют в учебном процессе кафедры фармакогнозии, на факультете дополнительного профессионального образования, в интернатуре ГОУ ВПО ПГФА Росздрава и в качестве лекционного материала - в отделении повышения квалификации фармацевтов ГОУ ДПО Пермского областного центра повышения квалификации работников здравоохранения.
Положения, выносимые на зашиту:
фитохимический анализ и валидация методики количественного определения суммы флавоновдов в траве манжетки;
товароведческий анализ травы манжетки;
исследования динамики накопления БАВ травы манжетки;
исследования сырьевой базы травы манжетки в Пермском крае;
фитохимический анализ настоя и экстракта травы манжетки сухого и его стандартизация;
изучение фармакологической активности настоя и экстракта травы манжетки. Публикация материалов исследования и апробация работы. По теме диссертации
опубликовано 10 работ, в том числе монография и патент. Материалы диссертационной работы представлены на научно - практических конференциях профессорско-преподавательского состава Пермской государственной фармацевтической академии (Пермь 2005, 2006, 2007гг.), на международной (Российско-китайской) научной конференции (Пермь 2007 г); на международном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва 2003, 2004 гг.)
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в ГОУ ВПО ПГФА Росздрава в соответствии с планом научно-
5 исследовательских работ по теме «Изучение лекарственной флоры РФ» (номер Государственной регистрации 01:9.10.018875). Тема утверждена на заседании Ученого совета Пермской государственной фармацевтической академии (протокол № 3 от 24 ноября 2005 г).
Объём и структура диссертации. Работа изложена на 200 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (6 глав), общих выводов, списка литературы и приложений; иллюстрирована 30 рисунками и 106 таблицами. Список литературы включает 245 источников, в том числе 10 - на иностранных языках.
Во введении обоснована актуальность выбранной темы, определены цели и задачи исследования, показана научная и практическая значимость работы, основные положения, выносимые на защиту.
В обзоре литературы (глава 1) обобщены данные о современном состоянии исследований химического состава, морфологической характеристики, фармакологической активности и условий произрастания видов рода Alchemilla L. Глава 2 посвящена описанию объектов и методов исследования.
В главе 3 приведены данные сравнительной характеристики видов рода Alchemilla L. по морфолого-анатомическому строению и химическому составу.
В главе 4 изложены материалы по разработке «Инструкции по заготовке и сушке травы
манжетки»., .
В главе 5 приведены исследования по разработке проекта Фармакопейной статьи «Alchemil-lae herba». - «манжетки трава».
В главе 6 приведены исследования по разработке технологии получения экстракта травы манжетки сухого и его стандартизация.
В главе 7 представлены материалы по гипогликемической, иммуномодулирующей и гипо-липидемической активности настоя и экстракта травы манжетки сухого. Приложение включает проекты ФС«А1спетШае herba» - «манжетки трава», ФСП «Extrac-tum herbae Akhemillae siccum» - «Экстракт травы манжетки сухой» и материалы, подтверждающие практическую значимость проведённых исследований.
Состояние изученности химического состава и фармакологической активности манжетки
Интерес к изучению растений рода манжетка наблюдается в различных регионах страны. В Сибирском государственном медицинском университете при исследовании надземной части манжетки найден богатый комплекс биологически активных соединений, таких как кумарины - эскулетин, эскулин, умбеллиферон, скополетин; флавоноиды - кверцетин, апигенин, апигенин-7-глюкозид, лютеолин, рутин, лютеолин-7-глюкозид; фенолкарбоновые кислоты - кофейная, хлорогеновая, феруловая, синаповая, эллаговая, п-кумаровая; дубильные вещества, полисахариды, аминокислоты, витамины С, К, кароти-ноиды и микроэлементы. Получен препарат на основе полифенольного комплекса манжетки, обладающий выраженной гемореологической активностью [9, Ю, 177].
В траве м. тринадцатилопастной, произрастающей в Даутском ущелье Карачаево-Черкесской Республики обнаружены флавоноиды и коричные кислоты [224].
При изучении химического состава м. обыкновенной в надземной части её были обнаружены флавонолы, а в корнях - катехины и лейкоантоцианы. Полученный полифенольный препарат из подземных органов манжетки является антигипоксантом и уменьшает степень некроза при инфаркте миокарда, а также проявляет капилляроукрепляющие, адаптогенные свойства в экс-тримальных условиях [117] (табл. 1.1).
Сотрудниками Московской медицинской академии им. Сеченова при сравнительной характеристике м. изящной, м. балтийской, м. шерстистой, м. шаровидно скрученной, заготовленных в Тульской и Московской областях, установлено сходство их полифенольного состава. В работах сотрудников Пермской фармацевтической академии [208] показано присутствие в траве и корневищах с корнями манжетки дубильных веществ пирогалловой и пиро-катехиновой групп. Обобщённые данные по химическому составу представлены в таблице 1.1.
Изучены морфологические преобразования в тимусе крысы при синдроме длительного сдавливания и его коррекции биофлавоноидами манжетки обыкновенной. Показаны существенные возможности направленного восстановления структуры и функции тимуса с помощью растительных полифе-нольных соединений из манжетки обыкновенной, которая использовалась как адаптоген и лимфостимулятор [28].
Из корней растения выделен суммарный полифенольный препарат, который обладает капилляроукрепляющим, гиполипидемическим действием и стимулирует работу сердца при аритмии, стенокардии, инфаркте миокарда [117,128].
Исследование влияния полифенольного состава травы манжетки на структурные изменения паренхимы и стромы сердца при инфаркте миокарда показало, что под действием полифенолов манжетки улучшается морфофункциональное состояние микроциркуляционного русла мышцы сердца, что препятствует образованию грубого рубца [30, 88, 128, 206].
Экстракты из надземной части манжетки, содержащие флавоноиды оказывают существенное влияние на реологические свойства крови, что выражается в снижении остроты проявления синдрома повышенной вязкости крови при ишемии мозга вплоть до полной нормализации некоторых гемореоло-гических параметров [8, 45, 66, 97, 108, 109].
В литературе описано использование листьев манжетки обыкновенной при лечении онкологических заболеваний: раке яичников, матки, молочной железы [30] и сборов с травой манжетки обыкновенной при миоме матки [119].
Исследования морфолого-анатомических признаков
Изучение морфолого-анатомических признаков проводили на образцах 20 видов манжетки [98. 190. 212]. В результате макроскопического исследования установили видовую принадлежность и выделили признаки, очерчивающие границы видов. Это характер опушения стеблей и черешков прикорневых листьев; форма, степень вырезанности и опушение листовой пластинки; форма и количество лопастей листа; число, форма зубцов лопастей листовой пластинки; консистенция и характер опушения соцветия (табл. 1 приложения); форма, опушение и окраска гипантия, листьев чашечки и подчашия (табл. 3.1). Из них направленность волосков по черешкам прикорневых листьев, стеблям, по жилкам листовой пластинки; степень волнистости и структура листа были установлены только на свежесобранном материале, в высушенном сырье их характер менялся. Форма и количество лопастей листьев отличись в образце в зависимости от их расположения в розетке (внутренние, наружные) или на стебле н. п. у манжетки семиугольной {A. heptagona Juz.) и м. голой {A. glabra Neyg.), что согласуется с литературными данными [52, 95, 130,157,205].
Гипантии у большинства исследованных видов манжетки имели колокольчатую, воронковидную, бокаловидную и бочковидную формы. В образцах манжетки Линдберга {A. lindbergiana Juz.), м. неправильной {A. irregularis Alech.) и м. сизоватой {A. glaucescens Wallr.) наблюдали изменчивость данного признака, причиной которой является полиморфизм. Этим же объясняется изменчивость формы и опушения листочков чашечки и подчашия (табл. 3.1). Выше изложенное подтверждает сложность видовой идентификации растений и то, что изменение диагностических признаков после сушки делает определение подлинности сырья по видам практически невозможным. Важным было выделить наиболее часто встречаемые признаки рода [151] и с учетом их вариабельности составить описание внешних и микроскопических признаков сборного вида Alchemilla vulgaris L.
Морфологические признаки. Стебли полые, цилиндрические, тонкие, слегка ребристые, более или менее опушены или изредка голые длиной до 40 см. Прикорневые листья длинночерешковые, стеблевые сидячие с воронко-видными или колокольчатыми прилистниками.
Листья почковидные или округло почковидные, с широкими почти округлыми или широкояйцевидными крупнозубчатыми лопастями, более или менее опушённые. Количество зубцов на лопастях прикорневых листьев составляет 9-11, у стеблевых листьев 4-5. Жилкование пальчатое.
Соцветие щитковидная метёлка из клубочков цветков с прицветниками. Цветки мелкие, актиноморфные обоеполые четырехмерные с редуцированным венчиком длиной около 1,5—3 мм, чашечковидные (рис. 3.1). Чашечка двурядная, каждый ряд из четырёх свободных широкояйцевидных или треугольных чашелистиков. Чашелистики с одной хорошо выраженной центральной жилкой, уходящей в верхушку и двумя боковыми жилками петле-видно-замыкающимися на центральную.
Гипантий голый или редко волосистый с железистым диском, андроце-ей из 4х тычинок, гинецей однопестичный. Тычинки расположены между чашелистиками на довольно коротких тычиночных нитях, с сильно редуцированным связником, имеющим вид суженной и затем слегка расширенной нити. Пыльник, поникающий шаровидный, одногнёздный, раскрывающийся поперечной щелью. К моменту созревания пыльников пестик полностью скрыт в полости гипантия. Пыльцевые трубки из высыпавшихся на волосистое кольцо пыльцевых зёрен прорастают внутрь гипантия, направляясь к рыльцу, или столбику завязи. Таким образом, возможно самоопыление, наряду с апомиксисом. Пестик расположен на дне гипантия на короткой ножке (рис. 3.1). Завязь верхняя. Форма завязи яйцевидная, столбик латеральный. Он отходит от нижней части завязи и завершается головчатым рыльцем, слегка вогнутым в центре. Столбик и рыльце сохраняются долго при сформировавшемся орешке. Плод - одиночный односемянной орешек, заключенный в цветоложе с чашечкой. Экзокарпий шероховатый, мелкоячеистый, светлобурый. Эндокарпий беловато-зелёный, гладкий. Семя с почти чёрной семенной кожурой.
Анатомические признаки. Исследованные виды манжетки имеют общий план анатомического строения стебля, черешка, листовой пластинки и цветка. Листовая пластинка дорзивентрального типа. Проводящий пучок закрытый, коллатеральный, подковообразный. Мезофилл дифференцирован на палисадную и губчатую паренхиму (рис. 3.2). Клетки палисадной ткани располагаются в 1 ряд перпендикулярно поверхности листа, соприкасаясь, друг с другом. Клетки губчатой паренхимы расположены рыхло с крупными межклетниками. Кутикула гладкая, с нижней стороны неравномерная по толщине
Под эпидермой располагается зона дифференцированной коры, представленной 10-12 рядами клеток. По периферии видны 2-3 ряда пластинчатой колленхимы. Клетки паренхимы мезодермы, по мере приближения к центральному цилиндру, укрупняются, затем становятся мельче. Клетки эндодермы хорошо прослеживаются. Проводящая система имеет обычное не пучковое строение. В перицикле встречаются отдельные склеренхимные клетки, расположенные по 1-3. Во флоэме - отдельные крупные клетки (идиобласты). Ксилема состоит из 8-10 рядов клеток. В паренхимных клетках сердцевины встречаются друзы оксалата кальция. Сосуды располагаются рядами. Древесинная паренхима в основном сосредоточена на границе с сердцевиной. Периферийная часть ксилемы представлена в основном либриформом. Сердцевинные лучи однорядные, узкие (рис. 3.9 А).
Черешки листьев округло-треугольного сечения, покрыты эпидермой с тонкой гладкой кутикулой (рис. 3.9 Б). Под эпидермой расположены 2-4 ряда пластинчатой колленхимы.
Устьица, погружённые с аномоцитным околоустьичным аппаратом, стенки клеток слабо извилистые. В жилках преобладают сосуды спирального типа. В мезофилле многочисленные друзы группами или только вдоль главных жилок (рис. 3.11). Кристаллическая обкладка из крупных друз сильно выражена у манжетки голой (A. glabra Neyg.) и слабо у манжетки неправильной (A. irregularis Alech.).
По краю гипантия расположен нектароносный диск почти округлый или четырёхгранный, который прерывается 4 тычинками. К центру от тычинок закрывает вход в гипантии плоский или слегка выпуклый торальныи нектарник по краю с густым опушением одно или двуклеточными волосками, слегка согнутыми внутрь полости (рис. 3.12).
Разработка и валидация методики количественного определения суммы флавоноидов
Определение проводили по разработанной нами методике дифференциальной спектрофотометрии [87], валидация которой проводилась по характеристикам: специфичность, линейность и прецизионность [11, 60]. Метод основан на реакции комплексообразования с алюминия хлоридом, который вызывает батохромный сдвиг длинноволновой полосы поглощения флавоноидов травы манжетки [105, 164, 165, 170].
Для определения аналитической длины волны изучали спектры флавоноидов травы 20 видов рода Alchemilla, травы манжетки смешанных образцов, и рабочего стандартного образца (РСО) рутина. На кривой светопогло-щения извлечения из травы манжетки в области характерной для флавоноидов максимумов не обнаружили, вследствие чего использование прямой спектрофотомерии для оценки качества сырья не представляется возможным (рис. 5.1).
Дифференциальные спектры светопоглощения комплекса флавоноидов в извлечениях из травы манжетки всех исследованных видов с алюминия хлоридом совпадают и характеризуются чётко выраженным максимумом поглощения при длине волны 405 ± 5 нм (рис. 5.2).
При изучении влияния условий экстракции на выход флавоноидов из травы манжетки установили, что наиболее полный выход определяемых веществ наблюдается при экстрагировании 70% этиловым спиртом сырья с размером частиц 0,5 1,0 трехкратной экстракцией по 30 минут каждая (табл. 5.2).
При изучении влияния условий проведения реакции комплексообразова-ния с алюминия хлоридом, установили, что наиболее полно реакция протекает при соотношении объёмов извлечения и реактива 1:2. Стабильность реакции наступала через 30 минут с момента получения комплекса, сохранялась в течение часа и незначительно изменялась через 1,5 и 2 часа (табл. 5.3).
Специфичность методики количественного определения флавоноидов в траве манжетки. Реакция комплексообразования с алюминия хлоридом является селективной для флавоноидов за счёт батохромного сдвига спектра продукта реакции, позволяющего отделить их от группы сопутствующих веществ фенольной природы. Использование в качестве раствора сравнения извлечение без реактива при измерении оптической плотности исключает влияние окрашенных, а также других соединений, содержащихся в растительном сырье [46, 47, 84].
Линейность методики отражает пропорциональность увеличения оптической плотности при возрастании количества флавоноидов в анализируемых образцах манжетки. С целью проверки подчинения поглощения окрашенных продуктов закону Бугера-Ламберта-Бера измеряли оптическую плотность на 7 уровнях концентраций 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 % (рис. 5.3).
Коэффициент корреляции линейного регрессионного графика составил г = 0,994, уравнение регрессии у = Ь-х + а, при b =0,015 , а = - 0,1074. На основании полученных данных можно утверждать, что соблюдается линейная зависимость между величинами оптической плотности и содержанием флавоноидов в извлечениях из травы манжетки в интервале 25 — 150% от номинального значения определяемой величины.
Этот интервал определяет аналитическую область методики.
Правильность методики. Отсутствие систематической ошибки определяли методом добавок различных концентраций РСО рутина непосредственно в извлечение из травы манжетки. Результаты показали, что ошибка анализа находится в пределах ошибки единичного определения (2,59%) (табл. 5.5). Это свидетельствует об отсутствии систематической ошибки разработанной методики (табл. 5.4)
Прецизионность. Проверка повторяемости (сходимости) результатов методики, проведённая на одном образце в 10 повторностях показала, что степень согласованности результатов измерений, характеризующаяся величиной относительного стандартного отклонения (R.SD) = 2,75%, не превышает допустимые 10% (табл. 5.4).
Относительная ошибка определения при доверительной вероятности 95% составила 2,59 % (табл. 5.5).
Внутрилабораторную прецизионность методики определяли на 3 образцах сырья в 3х кратной повторности на спектрофотометрах СФ-2000 и СФ-46 (табл. 5.6). Результаты определения подтверждают прецизионность методики в условиях внутрилабораторной воспроизводимости.
Межлабораторную воспроизводимость валидируемой методики оценивали по результатам испытаний, проведённых в лабораториях 1 - кафедры фармакогнозии и 2 - РИЦ «Фарматест» ГОУ ВПО ПГФА Росздрава (приложение). Величина относительного стандартного отклонения составила 2%, это не превышает допустимые 15% и указывает на прецизионность разработанной методики в условиях межлабораторной воспроизводимости результатов (табл. 5.7).
В ходе исследований установлено, что методика обладает точностью и прецизионностью, т.е. позволяет объективно оценивать качество травы манжетки.
Методика. Аналитическую пробу травы манжетки измельчают до величины частиц, проходящих через сито с отверстиями размером 1 мм. Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 100 - 150 мл, прибавляют 30 мл 70 % этилового спирта.
Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 минут, с момента закипания экстрагента, периодически встряхивая для смывания частиц сырья со стенок. Горячее извлечение фильтруют через бумажный складчатый фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл, фильтр с попавшими на него частицами сырья помещают в колбу для экстрагирования. Экстракцию повторяют еще дважды в тех же условиях, фильтруя извлечение в ту же мерную колбу. После охлаждения объем извлечения доводят до метки 70 % этиловым спиртом и перемешивают (раствор А).
В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 1 мл раствора А, прибавляют 2 мл 2 % раствора алюминия хлорида в 95 % этиловом спирте, 1 каплю разведенной уксусной кислоты и доводят объем раствора до метки 95% этиловым спиртом (раствор Б). Через 40 минут измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при длине волны 405 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют: 1 мл извлечения (раствор А) помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1 каплю разведенной уксусной кислоты и доводят объем раствора 95% этиловым спиртом до метки.
Параллельно измеряют оптическую плотность раствора ГСО (РСО) рутина, приготовленного аналогично испытуемому раствору.
Гипогликемическая активность экстракта травы манжетки сухого
У крыс с аллоксановым диабетом уровень глюкозы в крови был в 2,2-2,3 раза выше, чем у интактных контрольных крыс (табл.7.6).
Водный экстракт травы манжетки сухой оказывал гипогликемическое действие (табл. 7.6). Оно проявилось достоверным снижением уровня глюкозы в крови у крыс с экспериментальным диабетом. О специфичности фармакологического эффекта экстракта травы манжетки сухой свидетельствует до-зозависимое снижение уровня глюкозы у опытных животных.
В следующей серии опытов было исследовано влияние сухих спиртовых экстрактов травы манжетки на уровень глюкозы у крыс с аллоксановым диабетом (табл. 7.7).
Установлено, что сухие спиртовые экстракты, полученные при использовании в качестве экстрагента этиловый спирт, в дозе 50 мг/кг не проявили существенной гипогликемической активности (табл. 7.7).
Данные, представленные в таблице 7.7, свидетельствуют о том, что водный экстракт травы манжетки сухой по гипогликемической активности превосходит сухие спиртовые экстракты травы манжетки.
Влияние экстракта травы манжетки сухого на уровень глюкозы у интактных крыс
У контрольных крыс уровень глюкозы в крови не изменялся, о чем свидетельствует отсутствие достоверных отличий во все сроки наблюдения (табл. 7.8).
Сухой водный экстракт травы манжетки, приготовленный в различных концентрациях, не изменял уровня глюкозы в крови интактных крыс во все сроки наблюдения. Об этом свидетельствует отсутствие достоверных отличий показателей.
Влияние экстракта травы манжетки на уровень глюкозы у крыс с сахарной нагрузкой
У лабораторных животных, подвергавшихся сахарной нагрузке, уровень глюкозы в крови повышался. Об этом свидетельствует достоверное увеличение глюкозы в крови во все сроки наблюдения по сравнению с уровнем сахара интактных крыс (табл. 7.9). Следует отметить, что к концу наблюдения уровень глюкозы у группы крыс, которым была введена глюкоза, достоверно снижался по сравнению с фоновым уровнем. Установлено, что водный экстракт травы манжетки сухой достоверно снижал уровень глюкозы в крови (табл. 7.9). Гипогликемический эффект водного экстракта травы манжетки сухого проявлялся уменьшением сахара крови по сравнению с фоном во все сроки наблюдения. О наличии у водного экстракта травы манжетки сухого гипогликемического действия свидетельствуют достоверные отличия между уровнем глюкозы в крови контрольных (нагрузка глюкозы) и опытных (экстракт травы манжетки сухой + нагрузка глюкозы) животных.
Гипогликемическое действие водного экстракта травы манжетки сухого имеет дозозависимый характер.
Характеристика гипогликемической активности экстракта травы манжетки в зависимости от тяжести экспериментального диабета
У интактных крыс уровень глюкозы в наблюдаемые сроки не имел достоверных отличий (рис. 7.2). Моделирование аллоксанового диабета сопровождалось повышением уровня глюкозы в крови, причем он зависел от тяжести экспериментального диабета (рис. 7.2) Об этом свидетельствуют достоверные отличия в изменении уровня глюкозы в крови в динамике. Если на третий день развития аллоксанового диабета уровень глюкозы повышался в 2,3 раза, то на 14 день экспериментального диабета он возрастал в 4 раза.
Экстракт травы манжетки сухой оказал гипогликемическое действие во все сроки наблюдения, т.е. испытуемый фитопрепарат проявлял соответствующую активность независимо от тяжести экспериментального диабета. Об этом свидетельствуют достоверные отличия полученных результатов.
Гипогликемическое действие экстракта травы манжетки сухого во все сроки наблюдения имеет дозозависимый характер.
Сравнительная оценка гипогликемической и гиполипидемической активности экстракта травы манжетки и настоя черники
Развитие аллоксанового диабета сопровождалось достоверным увеличением уровня глюкозы, общего холестерина и триглицеридов (табл. 7.10). Экстракт травы манжетки сухой у крыс с аллоксановым диабетом снижал уровень глюкозы, общего холестерина и триглицеридов причем эти сдвиги были дозозависимыми (табл. 7.10).
Настой черники оказал гипогликемическое и гиполипидемическое действие (табл. 7.10). Это проявилось снижением уровня глюкозы, общего холестерина и триглицеридов.
Сравнительный анализ влияния обоих фитопрепаратов на аллоксановый диабет показал, что экстракт травы манжетки сухой в дозе 50 мг/кг по выраженности гипогликемического действия уступает настою черники. Об этом свидетельствует отсутствие достоверных отличий в уровне глюкозы в наблюдаемые сроки. Экстракт травы манжетки сухой в дозе 50 мг/кг превосходил настой черники по влиянию на уровень общего холестерина. Об этом свидетельствуют достоверные отличия в соответствующих сериях опытов. Аналогичная ситуация наблюдалась и в отношении снижения уровня триглицеридов. И в этом случае экстракт травы манжетки сухой в дозе 50 мг/кг превосходил настой черники. Так, если экстракт травы манжетки сухой снижал уровень триглицеридов в 3,2 раза, тогда как настой черники - лишь в 2,1 раза СР o,ooi).
Влияние различных фракций экстракта травы манжетки сухого на уровень глюкозы и липидов у крыс с аллоксановым диабетом
Установлено, что фракция водного экстракта травы манжетки сухого №1 снизила уровень глюкозы, общего холестерина и триглицеридов у крыс с аллоксановым диабетом (табл. 7.11). По выраженности этих эффектов фракция водного экстракта травы манжетки сухого №1 уступала экстракту травы манжетки сухому. Об этом свидетельствуют достоверные отличия между сравниваемыми группами серий опытов.
Фракции водного экстракта травы манжетки сухие №2, №3 и №4 повышали уровень глюкозы у крыс с аллоксановым диабетом. Что же касается уровня общего холестерина, то он соответствовал уровню, выявляемому крыс с экспериментальным диабетом. Вместе с тем, фракции водного экстракта травы манжетки сухие №2, №3 и №4 снижали уровень триглицеридов у опытных животных. Об этом свидетельствуют достоверные отличия между сравниваемыми группами.
Фракция водного экстракта травы манжетки сухого №5, проявила гипогликемическую активность. Это проявлялось достоверным снижением уровня глюкозы, общего холестерина и триглицеридов.
