Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Краткая ботанико-фармакогностическая характеристика видов багульника 13
1.1. Ботаническое описание и систематика рода Багульник 13
1.1.1. Багульник-подбел - Ledum hypoleucum Кот 13
1.1.2. Багульник стелющийся - Ledum decumbens (Ait.) Lodd. ex Stend 14
1.1.3. Багульник крупнолистный - Ledum macrophyllum Tolm 15
1.2. Багульник болотный - L. palustre L 16
1.2.1. Ареал 17
1.2.2. Экология 17
1.2.3. Ресурсы 18
1.2.3.1. Центр европейской части РФ 18
1.2.3.2. Северо-Запад РФ 20
1.2.3.3. Предуралье и Урал 21
1.2.3.4. Западная Сибирь 22
1.2.3.5. Восточная Сибирь 24
1.2.3.6. Дальний Восток 24
1.2.4. Химический состав 25
1.2.5. Заготовка 30
1.2.6. Фармакологическая активность и применение в медицине 31
Глава 2. Качественный анализ и количественное определение веществ первичного обмена видов рода Багульник 39
2.1. Аминокислоты 39
2.1.1. Качественное обнаружение 39
2.1.2. Количественное определение 40
2.2. Углеводы 41
2.3. Макро- и микроэлементы 46
2.3.1. Изучение модельного вида сырья багульника болотного для экологической оценки качества лекарственного растительного сырья 48
2.3.1.1. Элементный состав сырья багульника болотного, произрастающего на территории Ярославской области 48
2.3.1.2. Элементный состав сырья багульника болотного, произрастающего в других регионах РФ 50
2.3.1.3. Элементный состав азиатских видов багульника 52
2.3.1.4. Элементный состав разновидностей багульника болотного 54
2.3.2. Атомно-адсорбционный анализ 54
2.3.3. Элементный состав сборов с багульником болотным 57
Глава 3. Качественное обнаружение, количественное определение, изучение сезонной и суточной динамики накопления фенольных соединений багульника болотного 63
3.1. Качественное обнаружение 63
3.1.1. Фенольные соединения 63
3.1.2. Кумарины 66
3.1.3. Гидроксикоричные кислоты 66
3.1.4. Флавоноиды 67
3.2. Количественное определение фенольных соединений 68
3.2.1. Содержание фенольных соединений в побегах багульника в зависимости от степени измельченности . 68
3.2.2. Содержание фенольных соединений в побегах багульника в зависимости от соотношения сырья к
экстрагенту 68
3.2.3. Разработка методики количественного определения
суммы гидроксикоричных кислот 69
3.2.3.1. Определение удельного показателя поглощения хлорогеновой кислоты 69
3.2.3.2. Выбор оптимальной концентрации
экстрагента 70
3.2.3.3. Выбор оптимальных условий экстрагирования 71
3.2.3.4. Методика количественного определения суммы кислот 71
3.2.4. Разработка методики количественного определения флавоноидов 72
3.2.4.1. Выбор оптимальной концентрации спирта для экстрагирования суммы флавоноидов из
побегов багульника 72
3.2.4.2. Выбор оптимальных условий экстрагирования флавоноидов 73
3.2.4.3. Определение дифференциальных спектров поглощения раствора гиперозида и суммы флавоноидов багульника с алюминия хлоридом в уксусно-уротропиновом буфере 73
3.2.4.4. Определение удельного показателя поглощения комплекса гиперозид - алюминия
хлорид 75
3.2.4.5. Методика количественного определения флавоноидов 75
3.2.5. Разработка методики количественного определения арбутина 76
3.2.5.1. Определение удельного показателя поглощения арбутина 78
3.2.5.2. Выбор оптимальной концентрации экстрагента 79
3.2.5.3. Выбор оптимальных условий экстракции . 79
3.2.5.4. Методика спектрофотометрического определения арбутина 80
3.2.6. Полифенольные соединения 81
3.2.6.1. Количественное определение окисляемых соединений 81
3.2.7. Количественное определение фенольных соединений в различных частях багульника 82
3.2.8. Количественное определение фенольных соединений в побегах багульника из разных мест произрастания 83
3.2.9. Количественное определение фенольных соединений в побегах видов и разновидностей рода Багульник, произрастающих в Сибири и на Дальнем Востоке 85
3.2.10. Количественное определение фенольных соединений в сырье багульника, реализуемом в аптечной сети 91
3.3. Сезонная динамика 92
3.4. Суточная динамика 95
Глава 4. Фитохимический анализ гомеопатических настоек и мазей на основе багульника 105
4.1. Фитохимический анализ матричных настоек 107
4.1.1. Приготовление матричной настойки 107
4.1.2. Обнаружение отдельных групп фенольных соединений 108
4.1.2.1. Качественные реакции 108
4.1.2.2. Хроматографический анализ 108
4.1.3. Количественный анализ матричных настоек 115
4.1.3.1. Сесквитерпеновые спирты 115
4.1.3.2. Флавоноиды 116
4.1.3.3. Арбутин 117
4.1.3.4. Гидроксикоричные кислоты 118
4.1.3.5. Полифенольные окисляемые соединения . 119 4.2. Фитохимический анализ гомеопатических мазей 120
4.2.1. Приготовление гомеопатической мази 120
4.2.2. Получение извлечения из мази 120
4.2.3. Качественный анализ 120
4.2.4. Хроматографический анализ 121
4.2.5. Количественное определение ФАВ 123
4.2.5.1. Сесквитерпеновые спирты 124
4.2.5.2. Флавоноиды 124
4.2.5.3. Арбутин 125
4.2.5.4. Гидроксикоричные кислоты 125
4.2.5.5. Полифенольные окисляемые соединения . 126
4.2.6. Качественный анализ промышленных мазей 126
4.2.7. Количественный анализ промышленных мазей 127
Общие выводы 129
Литература
- Багульник стелющийся - Ledum decumbens (Ait.) Lodd. ex Stend
- Изучение модельного вида сырья багульника болотного для экологической оценки качества лекарственного растительного сырья
- Гидроксикоричные кислоты
- Обнаружение отдельных групп фенольных соединений
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Заболевания сердечно-сосудистой, нервной, пищеварительной и других систем прогрессируют в современном обществе, что нередко связано с ухудшением экологической обстановки. В связи с этим важным направлением фармацевтической науки является поиск безопасных, экологически чистых, не вызывающих побочных эффектов и привыкания препаратов. В этом аспекте заслуживают внимания лекарственные растения, т.к. они не обладают теми недостатками, которые свойственны многим средствам синтетического происхождения. Одно из таких растений - багульник болотный, широко распространенный в РФ. Запасы его сырья огромны (Г.И. Олешко и др., 1984-1989; В.Ф. Левинова и др., 1986; В.Н. Косицын, 1996-1998; В.Д. Белоногова и др., 2005 и др.). Кроме него, в народной медицине находят разнообразное применение и другие виды этого рода (А.Л. Бу-данцев, Е.Е. Лесиовская, 2001). Отдельные фармакологические эффекты багульника болотного, проявляющиеся умеренным местным раздражающим действием на слизистые оболочки, усилением секреции бронхиальных желез и спазмолитическим действием на гладкую мускулатуру бронхов, связывают с наличием в нем эфирного масла, состав и накопление которого довольно глубоко исследованы. Побеги багульника болотного - источник противокаш-левого и бронхолитического препарата «Ледин», созданного на основе сеск-витерпенового спирта ледола (A.M. Задорожный и др., 1988). Вместе с тем многие виды терапевтического действия багульников, в частности диурети-
-8-ческий, противовоспалительный, кардиотонический, желчегонный, обусловлены также содержанием богатого комплекса фенольных соединений, макро-и микроэлементов, однако недостаточно изученных (М.В. Белоусов, 2004). Кроме того, багульник болотный широко применяется в гомеопатии в локальной терапии опорно-двигательного аппарата. На его основе отечественной фармацевтической промышленностью выпускаются оподельдок и мазь «Ледум», стандартизация которых не разрешена до настоящего времени.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью работы явилось сравнительное фармакогностическое изучение видов багульника (Ledum L.) флоры России (б. болотного - L. palustre, б. крупнолистного - L. macrophyllum Tolm., б. стелющегося - L. decumbens (Ait.) Lodd. ex Stend., б. подбела - L. hypoleucum Кот.), а также углубленное изучение багульника болотного из различных мест произрастания на территории европейской и азиатской час- тей страны, разработка методов стандартизации сырья и препаратов на его основе.
Для выполнения поставленной цели следовало решить следующие задачи:
провести критический анализ данных литературы по современному состоянию морфолого-анатомических и химико-фармакологических исследований багульников;
предпринять сравнительное изучение их химического состава, в частности веществ первичного (аминокислот, моно- и полисахаридов, макро- и микроэлементов) и вторичного обмена (арбутина, гидроксикоричных кислот, флавоноидов, полифенольных окисляемых соединений);
выявить с помощью рентгенофлуоресцентного и атомно-адсорбционного анализа степень экологической чистоты сырья;
проанализировать сезонную и суточную динамику накопления фенольных соединений для определения оптимальных сроков заготовки побегов багульника;
разработать методики количественного определения арбутина, гид-
-9-роксикоричных кислот и флавоноидов в сырье, гомеопатической матричной
настойке и мази «Ледум» для возможной их стандартизации;
- составить нормативную документацию (ФСП, дополнения к ФС) на побеги и гомеопатические лекарственные формы багульника.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Впервые предпринят фармакогно-стический анализ 4-х видов багульника (б. болотного, б. крупнолистного, б. стелющегося и б. подбела), произрастающих в европейской и азиатской частях РФ. С использованием современных методов (рентгенофлуоресцентного и атомно-адсорбционного) изучен их макро- и микроэлементный состав.
Проведены исследования по стандартизации побегов багульника, в результате чего разработаны методики количественного определения арбутина и гидроксикоричных кислот (методом прямой спектрофотометрии), флавоноидов (методом спектрофотометрии по реакции комплексообразова-ния с алюминия хлоридом).
Впервые определено содержание фенольных соединений в сырье багульника болотного, заготовленном в различных регионах РФ, в Украине и Беларуси, а также реализуемом в аптечных учреждениях.
На основании аналитических исследований подготовлены дополнения к фармакопейной статье №1 ГФ XI «Побеги багульника болотного».
Впервые изучены сезонная и суточная динамики накопления фенольных соединений в побегах багульника.
Разработаны методики качественного и количественного анализа гомеопатических лекарственных форм на основе багульника.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Предложены методики стандартизации сырья багульника, позволяющие объективно оценивать их доброкачественность. Результаты качественного обнаружения и количественного определения основных групп ФАВ внедрены и используются в учебном процессе Курского государственного медицинского университета (акт о внедрении №224 от 16.02.2005, №227 от 2.09.2005), а также в работе Вологодского областного центра контроля качества и сертификации лекарст-
-10-венных средств (акт об апробации от 16.10.2005).
Результаты исследований положены в основу изменений к фармакопейной статье №1 ГФ XI «Побеги багульника болотного», ФСП «Настойка багульника гомеопатическая», ФСП «Ледум мазь гомеопатическая» (Ивановская фармацевтическая фабрика, акт о внедрении от 10.10.2005).
Токсико-экологическое значение тяжелых металлов нашло отражение в опубликованном учебном пособии для преподавателей и студентов «Экологическая оценка техногенного загрязнения Ярославской области».
Разработаны сборы с условными названиями «Вера», «Исцеление» и «Себавал», показанные на основании испытаний на кафедре терапии педиатрического факультета ЯГМА (зав. кафедрой проф. А.А. Зотов) в лечении гипертонической болезни и других заболеваний сердечно-сосудистой системы.
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
итоги изучения химического состава веществ первичного и вторичного обмена побегов багульника болотного и других видов этого рода,
результаты рентгенофлуоресцентного и атомно-адсорбционного анализов элементного состава сырья упомянутых видов растений,
экспериментальные данные по обоснованности замены фармакопейной методики количественного определения арбутина на спектрофото-метрическую, более точную и достоверную; по стандартизации и разработке нормативной документации на гомеопатические лекарственные формы багульника.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения работы доложены и обобщены: на научно-практической конференции, посвященной 85-летию высшего образования на Урале (Пермь, 2001), научно-практических конференциях «Актуальные проблемы экологии Ярославской области» (Ярославль, 2002, 2005), научной конференции студентов и молодых ученых (Курск, 2002), конгрессе молодых ученых «Науки о человеке» (Томск, 2002), X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2003); научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава
«ВУЗЫ И РЕГИОН» (Пермь, 2003), научной конференции, посвященной 100-летию образования фармацевтического факультета Запорожского государственного медицинского университета (Запорожье, 2004), научной конференции, посвященной 50-летию Алтайского государственного медицинского университета (Барнаул, 2004), на ежегодных научных конференциях студентов и молодых ученых Ярославской государственной медицинской академии (Ярославль, 2002-2005); на совместном заседании кафедры фармакогнозии, фармацевтической химии, управления и экономики фармации, фармацевтической технологии фармацевтического факультета ЯГМА (Ярославль, 2005).
ПУБЛИКАЦИИ МАТЕРИАЛОВ ИССЛЕДОВАНИЯ. По теме диссертации опубликовано 39 работ, из них 12 в журналах. Составлено и издано учебное пособие для преподавателей и студентов на тему «Экологическая оценка техногенного загрязнения Ярославской области», предназначенное для подготовки к занятиям по экологии.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Ярославской государственной медицинской академии (номер гос. регистрации 01.20.0211931).
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Работа изложена на 156 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (3 главы), общих выводов, списка литературы и приложения; иллюстрирована 49 рисунками и 76 таблицами. Список литературы включает 263 источника, из них 21 на иностранных языках.
Во введении обоснована актуальность выбранной темы, определены цели и задачи исследования, показана научная и практическая значимость работы.
В обзоре литературы (первая глава) отражено современное состояние химико- фармакологического изучения четырех видов багульника и их применение в медицине.
Во второй главе приведены результаты изучения состава и количест-
-12-венного определения аминокислот, полисахаридов и ряда химических элементов багульников.
В третьей главе изложены материалы по качественному обнаружению и количественному определению фенольных соединений четырех видов багульника, в частности фенологликозидов, гидроксикоричных кислот, флавоноидов и полифенольных окисляемых соединений, по изучению сезонной и суточной динамики накопления действующих веществ в побегах багульника болотного.
Четвертая глава посвящена фитохимическому анализу и разработке методик стандартизации гомеопатической настойки багульника и мази «Ледум».
Приложение включает дополнение к ФС №1 ГФ XI издания «Побеги багульника болотного», проекты ФСП «Настойка багульника гомеопатическая («Ledum ID»)», ФСП «Ледум мазь гомеопатическая» и другие материалы, подтверждающие практическую значимость проведенных исследований.
Багульник стелющийся - Ledum decumbens (Ait.) Lodd. ex Stend
Род Багульник (Ledum L.) относится к семейству вересковые (Ericaceae Juss.) и включает в себя 10 видов, распространенных в основном в арктической и субарктической зонах северного полушария [85,262]. На территории России произрастают следующие 4 вида этого рода [170]: багульник-подбел (L. hypoleucum Кот.), б. стелющийся (L. decumbens (Ait.) Lodd. ex Stend.), 6. крупнолистный (L. macrophyllum Tolm.) и б. болотный (L. palustre L.) [166].
Багульник болотный - полиморфный вид, у которого выделяют четыре разновидности [105,208]: обыкновенную - L. palustre L. var. palustre (var. vul-gare Lebed.), широколистную - L. palustre L. var. dilatatum Wahlenb., узколистную - L. palustre L. var. angustum E. Busch, неопушенную — L. palustre L. var. glabratum Kryl. Разновидность широколистная распространена в Финляндии, Швеции, в России - на севере европейской части, в бассейне р. Обь, Алтайском, Приморском и Хабаровском краях; разновидность узколистная -в основном в Восточной Сибири (Саха-Якутия, Бурятия) [24,105,166].
Виды багульника различаются между собой набором хромосом [246]. Багульник-подбел - Ledum hypoleucum Кот. Багульник-подбел - вечнозеленый кустарник с прямыми ветвями, 50-110 см высотой; молодые веточки покрыты густым ржавым железистым войлоком, с возрастом постепенно исчезающим. Листья продолговато-овальные, 1,7-8 см длиной, 0,5-2 см шириной с завернутым краем, кожистые, на коротких черешках, сверху темно-зеленые, блестящие, снизу коротко беловойлочные, с блестящими мелкими железками. Цветки многочисленные, собранные в щитки на концах ветвей. Плод - овальная, железистая, пятигнездная коробочка; семена мелкие, узкие, крылатые сверху и снизу [166].
Багульник-подбел обитает на Дальнем Востоке (Приморье, северный Сихоте-Алинь, Амурская область, средняя часть о. Сахалин) [138,229]. Он растет в подлеске пихтово-еловых, каменноберезовых, лиственничных лесов, -14-в зарослях кедрового стланика, на сфагновых болотах, каменистых осыпях и образует сплошные заросли в разреженных древостоях (особенно в лиственничниках), долинах рек и на горных склонах, на вырубках и горельниках, где отмечена наибольшая продуктивность надземной фитомассы [138].
На Дальнем Востоке соприкасаются ареалы L. hypoleucum Кот. и L. palustre L. var. dilatatum Wahlenb. и, по-видимому, существует гибридизация между ними. У промежуточных форм белое опушение имеет на себе пучки рыже-бурых волосков в большем или в меньшем количестве. У настоящего L. palustre L. var. dilatatum белого опушения под рыже-бурым никогда не обнаруживается, но оно имеется в местах, где оба вида сталкиваются [166].
Химический состав багульника-подбела представлен эфирным маслом (0,54%), в составе которого фенолы (3,38%), кислоты (3,94%), в том числе пеларгоновая и ундекановая [23], ледол (2,15%), а-пинен, (3-пинен, Л -карен, лимонен, цинеол, п-цимол, аскаридол, ar-турмерон, {3-бисаболен, селина-3,7(11)-диен и а-селинен [82,83,236]; кумаринами (умбеллиферон, эскулетин, скополетин) [921] и дубильными веществами (до 8,9%) [170].
В Приамурье отвары и окуривание дымом от сжигаемых ветвей багульника-подбела используют как успокаивающее и снотворное [197]. Кроме того, отвары применяют в качестве отхаркивающего и противокашлевого средства при бронхитах и пневмонии, при лечении нервных заболеваний и туберкулеза легких; наружно - для обмывания при диатезах, дерматомико-зах, как болеутоляющее [170], при мышечном и суставном ревматизме, подагре, обморожениях, гриппозных ринитах [138]. Настои и отвары цветков растения находят также применение при коклюше, удушье, стенокардии, заболеваниях дыхательных путей [109]. В эксперименте установлено высокое противовоспалительное действие его эфирного масла [81].
Багульник стелющийся - Ledum decumbens (Ait.) Lodd. ex Stend. Багульник стелющийся - приземистый вечнозеленый кустарник. Его листья очередные, линейные, с сильно завернутым краем, 8-14 мм длиной, 1-1,5 мм шириной, сверху темно-зеленые, блестящие, снизу покрыты ржаво -15-бурым войлоком. Цветки многочисленные, собраны щитком на концах ветвей; цветоножки 5-15 мм длиной, густо покрытые ржаво-бурым пушком и железками. Плод - овальная, железистая, пятигнездная коробочка [166].
Багульник стелющийся встречается в Восточной Сибири (Якутия, Таймыр, Ямал), на Чукотке, Камчатке, в Магаданской области, в северной части острова Сахалин [146,180,229].
Основные места обитания - гольцы, стелющиеся кедровники, песчаные холмы и сухие еловые леса [166].
В багульнике стелющемся отмечено наличие эфирного масла (до 1,1%), в его составе фенолов (2,99%), кислот (1,68%), в том числе пеларговой и ка-приновой [23], ледола (0,76%), а-пинена, р-пинена, А -карена, лимоноена, цинеола, п-цимола [83, 236]; кумаринов (умбеллиферона, эскулетина, скопо-летина) [80], флавоноидов (кверцетин-З-р-О-(б-р-кумароил)-галактозида, кверцетин-З-р-В-(б-р-гидрокси-бензоил)-галактозида) [243] и восков (до 0,4%) [58].
Изучение модельного вида сырья багульника болотного для экологической оценки качества лекарственного растительного сырья
Предыдущие исследования элементного состава растений, в том числе и багульника, показали, что в зависимости от географических, почвен-но-климатических, экологических условий произрастания растения содержание макро-и микроэлементов в сырье варьировало [62,63,79,137].
Нами исследован элементный состав 6 образцов, собранных в районах Ярославской области (см. табл. 2.7, см. приложение 1). Проанализировали содержание 5 макро- (К, Са, S, Р, С1) и 25 микроэлементов (Ва, Br, V, Fe, I, Cd, Со, La, Mn, Mo, As, Nd, Ni, Rb, Pb, Se, Sr, Sn, Sb, Ті, Cr, Ce, Zn, Zr). При этом выявили следующие диапазоны концентраций: макроэлементы (в %): К 0,263-1,320, Са 0,345-0,744, S 0,159-0,460, Р 0,231-0,385, С1 0,083-0,413; микроэлементы (в мг/кг): Ва 47,500-169,000, Вг 4,190-9,230, V 0,344-0,642, Fe 93,000-415,000, I 0,061-0,261, Cd 0,208-0,381, Со 0,020-0,096, La 0,210-0,963, Mn 68,000-597,000, Си 1,112-2,680, Mo 1,610-3,950, As 0,049-0,164, Nd 0,690-0,799, Ni 0,128-0,835, Sn 0,072-0,152, Rb 7,860-22,410, Pb 0,791-1,420, Se 0,075-0,122, Sr 21,000-36,200, Sb 0,016-0,198, Ті 5,270-22,100, Cr 0,136-1,320, Ce 1,119-1,296, Zn 34,000-45,000, Zr 0,791-5,660.
Наибольшие концентрации макроэлементов (в %) определили для калия, серы, фосфора - в образце из Переславского (1,320, 0,460, 0,385 соответственно), кальция — Ростовского (0,744), хлора - Некрасовского (0,413) районов. Максимальные концентрации отдельных микроэлементов (в мг/кг) нами отмечены в следующих образцах: Ва - в образце из Ростовского (169,000), Вг — Переславского (9,230), V — Переславского (0,642), Fe — Рыбинского (415,000), I - Ростовского (0,261), Cd - Некрасовского (0,381), Со - Переславского (0,096), La - Ростовского (0,963), Мп - Ростовского (597,000), Си -Ростовского (2,680), Мо - Переславского (3,950), As - Переславского (0,164), Nd - Ростовского (0,799), Ni - Ростовского (0,835), Sn - Ростовского (0,152), Rb - Ростовского (22,410), Pb - Ростовского (1,420), Se - Некрасовского (0,122), Sr - Переславского (36,200), Sb - Ростовского (0,198), Ті - Ростовского (22,100), Cr - Любимского (1,320), Се - Ростовского (1,296), Zn - Ростовского (45,000), Zr - Ростовского (5,660).
Минимальные концентрации (в %) калия (0,263), серы (0,159), фосфора (0,231) и хлора (0,083) нами выявлены в образце из Даниловского, кальция (0,345) - из Переславского района.
Наименьшие концентрации микроэлементов (в мг/кг) равнялись: для Ва - в образцах из Некрасовского (47,500), Вг - Даниловского (4,190), V -Некрасовского (0,344), Fe — Некрасовского (93,000), I - Некрасовского (0,061), Cd - Любимского (0,208), Со - Некрасовского (0,020), La - Некрасовского (0,210), Мп - Некрасовского (68,000), Си - Некрасовского (1,112), Мо -Даниловского (1,610), As - Некрасовского (0,049), Nd - Даниловского (0,690), Ni - Переславского (0,128), Sn - Некрасовского (0,072), Rb - Некрасовского (7,860), РЬ - Рыбинского (0,791), Se - Переславского (0,075) и Даниловского (0,075), Sr - Любимского (21,000), Sb - Переславского (0,016), Ті - Переславского (5,270), Сг - Некрасовского (0,496), Се - Даниловского (1,119), Zn - Переславского (34,000), Zr - Переславского (0,791) районов.
Мы не обнаружили лантан, неодим и церий в образцах из Переславского, неодим и церий - в образцах из Некрасовского районов.
Следовательно, главным образом максимумы концентраций макроэлементов содержались в сырье из Переславского района, микроэлементов - в образцах из Ростовского района, а большинство минимальных концентраций - в сырье из Некрасовского и Даниловского районов.
Оценивая экологическую чистоту, выявили, что содержание Cd, РЬ и Zn завышено во всех исследуемых образцах. Концентрации As и Си не превышали допустимых значений. Сырье из Рыбинского района оказалось наименее загрязнено свинцом.
Для сравнительного рентгенофлуоресцентного анализа мы использовали 29 образцов багульника (табл. 2.8, 2.9, см. приложение 1), заготовленного в различных местах произрастания (5 из Республики Коми, по 2 из Костромской и Вологодской областей, по одному из Карелии, Архангельской, Нижегородской, Ивановской, Кировской и Тверской областей, т. е. европейского происхождения, 10 из Томской области, по одному из Сахалинской и Амурской областей, Приморского края, Республики Саха, т. е. азиатского происхождения) [214,215]. Результаты определений нами обобщены в таблицах 2.8. и 2.9 (см. приложение 1). При этом мы определили содержание 5 макро-(K,Ca,S,P,Cl) и 25 микроэлементов (Ва, Br, V, Fe, I, Cd, Со, La, Мп, Си, Мо, As, Nd, Ni, Sn, Rb, Pb, Se, Sr, Sb, Ті, Cr, Ce, Zn, Zr). В результате РФ А среди образцов европейского происхождения вы явили следующие диапазоны концентраций: макроэлементы (в %) - К 0,150 1,740, Са 0,157-0,730, S 0,145-0,911, Р 0,103-0,685, С1 0,118-1,220; микроэле менты (в мг/кг): Ва 26,400-75,100, Вг 3,690-12,800, V 0,096-0,679, Fe 75,000 940,000, I 0,063-0,300, Cd 0,148-0,717, Со 0,018-0,316, La 0,100-0,447, Мп 53,800-455,000, Си 0,844-5,710, Мо 1,050-4,610, As 0,041-0,505, Ni 0,488 3,840, Sn 0,031-0,230, Rb 6,070-14,270, Pb 0,412-2,013, Se 0,057-0,870, Sr 19,700-38,400, Sb 0,012-0,263, Ті 3,290-25,700, Cr 0,216-0,876, Zn 27,800 61,300, Zr 0,790-2,960.
Максимальное содержание макроэлементов (в %) выявили: калия - в образце из Кировской (1,740), кальция - Вологодской (0,730), серы - Вологодской (0,911), фосфора - Костромской (0,685), хлора - Вологодской (1,220) областей.
Гидроксикоричные кислоты
Важное значение при экстрагировании лекарственного растительного сырья имеет степень его измельченности.
Образцами для исследования служили побеги багульника разной степени измельченности. Их механически измельчали и просеивали через сита с размером ячеек соответствующего диаметра. Результаты анализа обобщены в таблице 3.7.
Исходя из данных, приведенных в таблице 3.7, видно, что максималь ное содержание флавоноидов и гидроксикоричных кислот наблюдалось в сырье, проходящим через сито диаметром 1 мм, арбутина - в образцах, проходящих через сито диаметром 2 мм, полифенольных окисляемых соединений (ПОС) - в сырье, проходящим через сито диаметром менее 1 мм.
Условия экстракции оказывают большое влияние на полноту извлечения действующих веществ из ЛРС, на точность и достоверность анализа. Нами проведены исследования влияния соотношения сырье - экстрагент на выход фенольных соединений из побегов багульника (табл. 3.8) и найдено, что их максимальный выход наблюдался при соотношении сырья к экстрагенту 1:100.
Гидроксикоричные кислоты и их эфиры являются непременными компонентами высших растений, [11]. Наиболее распространенной среди них является кофейная кислота, которая встречается в природе чаще всего в виде сложных эфиров с хинной кислотой (хлорогеновая, неохлорогеновая и другие кислоты). Они обладают желчегонным, иммуностимулирующим, антиок-сидантным и другими видами действия [50,112]. Для их количественного определения используют различные методы [11,61,88].
Одной из основных гидроксикоричных кислот багульника, согласно данным литературы [170] и результатам, полученным нами в результате хро-матографического анализа, является хлорогеновая кислота. Максимумы поглощения спиртового извлечения из побегов багульника и хлорогеновой кислоты находились в пределах 320-325 нм. Поэтому сумму гидроксикоричных кислот определяли в пересчёте на эту кислоту. 0,1000 г хлорогеновой кислоты — стандарта производства фирмы "Fluka" (Германия) помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в 70% спирте этиловом и доводили этим же спиртом объем колбы до метки. 4 мл 0,1% раствора кислоты переносили в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводили объем колбы до метки 70% спиртом этиловым. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 мл полученного раствора помещали в мерные колбы вместимостью 25 мл и доводили объем колбы 70% спиртом этиловым до метки. Оптическую плотность полученных растворов измеряли на спектрофотометре СФ -46 ЛОМО при Х= 325 нм в кювете с длиной рабочего слоя 1см. В качестве раствора сравнения использовали 70% спирт этиловый. .
Удельный показатель поглощения хлорогеновой кислоты рассчитывали по известной формуле. Результаты определений приведены в таблице 3.9. . Выбор оптимальной концентрации экстрагента Для экстрагирования суммы гидроксикоричных кислот из растительного сырья применяют спирты и спирто-водные растворы [61,87,88].
Мы провели. изучение выбора оптимальной концентрации этилового спирта. Как следует из полученных нами данных (табл. 3.10), максимальное извлечение гидроксикоричных кислот из побегов багульника происходило при использовании 70% спирта этилового. Выбор оптимальных условий экстрагирования
В результате проведенных нами исследований отмечено, что полное извлечение суммы гидроксикоричных кислот из побегов достигалось при однократном экстрагировании в течение 30 минут (табл. 3.11). Дальнейшая экстракция сырья к увеличению содержания суммы гидроксикоричных кислот в извлечении не приводила. 3.2.3.4. Методика количественного определения суммы кислот 1,0 г (точная навеска) сырья, проходящего через сито диаметром 1 мм, заливали 50 мл 70% спирта этилового и нагревали в колбе с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 30 минут. Вытяжку охлаждали, фильтровали в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводили объем извлечения 70% этанолом до метки. 1 мл извлечения вносили в мерную колбу на 25 мл и доводили объем раствора 70% спиртом этиловым до метки. Далее определяли оптическую плотность раствора на спектофотометре СФ-46 ЛОМО при длине волны 325 нм в кювете с длиной рабочего слоя 1 см. В качестве раствора сравнения использовали 70% спирт этиловый.
Содержание суммы гидроксикоричных кислот (табл. 3.24, см. приложение 1) в пересчете на хлорогеновую кислоту вычисляли по следующей формуле: Dx ДхВ х,% = —: -,гДе Et х а х Ь Х,%- количественное содержание суммы гидроксикоричных кислот, %; D оптическая плотность исследуемого раствора; А - объем мерной колбы, используемой для сбора извлечения, мл; В - объем мерной колбы, используемой для разведения и анализа, мл; b - объем извлечения, взятый для разведения и анализа, мл; " - удельный показатель поглощения хлорогеновой кислоты при А,.= 325нм, равный 504,425; а - навеска сырья, г.
Обнаружение отдельных групп фенольных соединений
Одним из основных компонентов эфирного масла багульника является ледол. Сумму сесквитерпеновых спиртов в матричной настойке мы определяли спектрофотометрическим методом [115,179], модифицированным нами.
В делительную воронку вместимостью 50 мл помещали 10 мл матричной настойки, прибавляли 10 мл н-гексана и встряхивали в течение 5 мин. Гексановое извлечение сливали в круглодонную колбу вместимостью 50 мл. Экстракцию проводили повторно таким же количеством гексана. Извлечения объединяли и отгоняли на вакуум-выпарном ротационном аппарате при температуре не выше 40С досуха. Остаток растворяли в 5 мл 96% спирта этилового, количественно переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили до метки 96% спиртом этиловым.
0,5 мл полученного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли по стенке 3 мл свежеприготовленного 1 % раствора п-диметиламинобензальдегида в кислоте серной концентрированной, перемешивали и оставляли стоять в течение 30 мин. Оптическую плотность раствора измеряли на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 440±5 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.
В качестве раствора сравнения использовали смесь 0,5 мл спирта этилового 96% с 3 мл 1% раствора п-диметиламинобензальдегида в кислоте серной концентрированной в мерной колбе на 25 мл, доведенного до метки кислотой серной концентрированной.
Содержание суммы сесквитерпеновых спиртов (табл. 4.11) в пересчете на ледол в настойке в процентах (X) вычисляли по формуле: D х 25 х 25 X, % = , где 71,7 хЮх 0,5 D - оптическая плотность испытуемого раствора; 71,7 - удельный показатель поглощения конденсированного соединения ледола с п-диметиламинобенз альдегидом в кислоте серной концентрированной; 10 - объем настойки, взятый для анализа; 0,5 - аликвота извлечения, мл.
Среднее содержание сесквитерпеновых спиртов в матричных настойках составило 0,863±0,025%, минимальное — 0,673±0,019%. В связи с этим предлагаем включить в НД показатель «суммы сесквитерпеновых спиртов» не менее 0,6%.
Гиперозид является одним из основных флавоноидов, содержащихся в побегах багульника болотного, максимум его поглощения совпадает с максимумом поглощения извлечения из исследуемого растения, поэтому мы предлагаем в качестве вещества-стандарта использовать данный флавоноид.
Для количественного определения флавоноидов в матричной настойке багульника использовали спектрофотометрический метод по реакции ком-плексообразования с алюминия хлоридом (см. п. 3.3.4.5.). 0,5 мл настойки помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли 10 мл 96% спирта этилового, 0,5 мл 33% кислоты уксусной, 1,5 мл 10 % раствора алюминия хлорида, 2 мл 5% раствора гексаметилентетрамина, доводили объем раствора до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивали. Через 40 минут определяли оптическую плотность раствора на спектрофотометре СФ-46 ЛОМО при длине волны 410 нм в кювете с длиной рабочего слоя 1 см. В качестве раствора сравнения использовали раствор, содержащий 0,5 мл настойки, 10 мл 96% спирта этилового, 0,5 мл 33% кислоты уксусной и воды до 25 мл. Содержание суммы флавоноидов (табл. 4.12) в пересчете на гиперозид рассчитывали по формуле: D х 25 Х,% = : -,ГДЄ EZ х 0,5 D - оптическая плотность исследуемого раствора; Е, - удельный показатель поглощения.комплекса гиперозида с алюминия хлоридом при длине волны 410 нм, равный 291,09; 25 - объем мерной колбы, мл; 0,5 — объем настойки, взятой для анализа, мл.
Среднее содержание флавоноидов в матричных настойках составило 0,078±0,00073 8%, минимальное - 0,038±0,000304%. В связи с этим предлагаем включить в НД показатель «суммы флавоноидов» не менее 0,03%.
Количественное определение арбутина проводили методом спектрофо-тометрии (см. п. 3.2.5.4). 0,3 мл настойки помещали в колонку с алюминия оксидом и элюирова-ли 15 мл 70% спирта этилового. Элюат собирали в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводили объем до метки 70% спиртом этиловым и перемешивали. Оптическую плотность элюата измеряли на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 285 нм в кювете с толщиной рабочего слоя 1 см. В качестве раствора сравнения использовали 70% спирт этиловый, пропущенный через колонку с алюминия оксидом. Содержание арбутина (табл. 4.12) в настойке вычисляли по формуле: Dx 25 хк х= — гДе . /; о,з D - оптическая плотность исследуемого раствора; ЕЩ — удельный показатель поглощения арбутина, равный 72,23; 0,3 - аликвота, мл; К — коэффициент неполного элюирования, равный 1,14025.
Приготовление хроматографической колонки. 3,0 г алюминия оксида нейтрального для хроматографии, промытого водой очищенной до нейтральной реакции и высушенного, помещали в стеклянную колонку диаметром 1,5 см и высотой 25 см и промывали 5 мл 70% спирта этилового.
