Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Систематическое положение и ботанико-географическая характеристика видов рода Geranium флоры северо-запада Европейской России 12
1.2. Основные группы биологически активных веществ видов рода Geranium флоры северо-запада Европейской России 21
1.3. Биологическая активность видов рода Geranium флоры северо-запада Европейской России и их применение в медицине 35
Глава 2. Материалы и методы исследования 38
2.1. Материалы исследования 38
2.2. Методы исследования 38
2.2.1. Методы фитохимического анализа 38
2.2.2. Методы ресурсоведческих исследований 42
2.2.3. Методы фармакологического анализа 43
2.2.4. Методы микробиологического анализа 43
2.2.5. Методы товароведческого анализа 43
Глава 3. Предварительный скрининг видов рода geranium флоры северо-запада европейской России 44
3.1. Сравнительное изучение содержания дубильных веществ 44
3.2. Сравнительное микробиологическое исследование 48
Глава 4. Сравнительное изучение g pratense, g sylvaticum, g. palustre 51
4.1. Фитохимическое исследование 51
4.1.1. Общий фитохимический анализ G. pratense, G sylvaticum, G. palustre на основные группы биологически активных веществ 51
4.1.2. Определение содержания экстрактивных веществ и динамика их накопления в сырье G pratense, G sylvaticum, G palustre 54
4.1.2.1. Определение содержания экстрактивных веществ в зависимости от фенофазы 55
4.1.2.2. Определение содержания экстрактивных веществ в зависимости от размера сырьевой части растения 56
4.1.3. Изучение фенольных соединений G pratense, G sylvaticum, G. palustre 59
4.1.3.1. Исследование компонентного состава флавоноидов и фенольных кислот G. pratense, G sylvaticum, G palustre 59
4.1.3.2. Изучение динамики накопления фенольных компонентов в сырье G prateme 73
4.1.3.3. Количественное определение суммы флавоноидов в надземной части G. prateme, G. sylvaticum, G. palustre 75
4.1.3.4. Изучение дубильных веществ 76
4.1.3.4.1. Разработка методики количественного определения суммы дубильных веществ в сырье G. prateme 77
4.1.3.4.2. Количественное определение суммы дубильных веществ в надземной и подземной части G prateme, G. sylvaticum, G. palustre 80
4.1.4. Изучение углеводного состава G. prateme, G. sylvaticum и G. palustre 81
4.1.4.1. Изучение состава и динамики накопления свободных моносахаров в надземной и подземной части G. prateme, G. sylvaticum и G palustre 83
4.1.4.2. Изучение состава и динамики накопления водорастворимых полисахаридов в надземной и подземной части G prateme, G sylvaticum и G. palustre 86
4.1.4.2.1. Выделение водорастворимых полисахаридов 86
4.1.4.2.2. Мономерный состав водорастворимых полисахаридов 89
4.1.4.2.3. Количественное содержание водорастворимых полисахаридов 92
4.1.4.3. Выделение и анализ полисахаридной фракции-2 92
4.1.5. Изучение аминокислотного состава G. prateme, G. sylvaticum и G palustre 97
4.1.5.1. Исследование аминокислот надземной части G. prateme, G. sylvaticum и G. palustre 97
4.1.5.2. Исследование аминокислот подземной части G. prateme 103
4.1.6. Изучение минерального состава G prateme, G. sylvaticum,
G. palustre 105
4.2. Сравнительное исследование острой токсичности G prateme, G sylvaticum, G palustre 112
4.3. Определение урожайности сырья G. prateme, G sylvaticum, G palustre 117
Глава 5. Изучение антимикробной активности G.PRATENSE 119
Глава 6. Установление показателей подлинности и качества травы герани луговой и корневищ с корнями герани луговой 122
6.1. Морфологические диагностические признаки сырья G. prateme.. 122
6Л. 1. Морфологические признаки травы G pratense 122
6.1.2. Морфологические признаки корневищ с корнями G pratense.. \ 24
6.2. Микроскопические признаки сырья G. pratense 124
6.2.1. Микроскопические признаки травы G. pratense 124
6.2.2. Микроскопические признаки корневищ с корнями G pratense.. 131
6.3. Качественные реакции 134
6.4. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в траве G pratense и ее валидация 135
6.5. Валидационная оценка разработанной методики определения содержания дубильных веществ в сырье G pratense 145
6.6. Определение предельных значений содержания действующих веществ в сырье G. pratense 152
6.6.1. Определение предельных значений содержания суммы флавоноидов и дубильных веществ в траве G pratense 152
6.6.2. Определение предельных значений содержания суммы дубильных веществ в корневищах с корнями G pratense 154
6.7. Определение товароведческих показателей 155
6.8. Установление срока хранения сырья 158
Основные результаты и выводы 161
Список сокращений и условных обозначений 163
Список литературы
- Основные группы биологически активных веществ видов рода Geranium флоры северо-запада Европейской России
- Методы ресурсоведческих исследований
- Общий фитохимический анализ G. pratense, G sylvaticum, G. palustre на основные группы биологически активных веществ
- Микроскопические признаки сырья G. pratense
Введение к работе
Актуальность темы. Одной из многочисленных задач современной фармацевтической науки является поиск растительных источников биологически активных веществ (БАВ) для создания на их основе препаратов различного фармакологического действия. Многолетний опыт исследования лекарственных растений свидетельствует об их многостороннем воздействии на организм человека и низкой токсичности по сравнению с синтетическими лекарственными средствами.
Перспективными источниками для создания фитопрепаратов являются представители рода герань - Geranium L. Герань пятнистая - G maculatum L. (трава и корни) включена в Британскую травяную Фармакопею. Герань каролинская - G carolinianum L. (трава) и герань Уилфорда - G wilfordii Maxim, (трава) входят в Государственную Фармакопею Китайской Народной Республики, а герань Тунберга - G thunbergii Siebold et Zucc. (трава) - в Японскую Фармакопею. Данные виды рекомендованы к использованию в качестве вяжущих, гемостатических, антимикробных и противовоспалительных средств. Однако, родина гераней пятнистой и каролинской - Северная Америка, в России они в диком виде не встречаются. Герани Тунберга и Уилфорда произрастают на Дальнем Востоке. Из видов, произрастающих на северо-западе Европейской России, лишь герань Роберта - G robertianum L. (трава) включена во Французскую Фармакопею.
На северо-западе Европейской России произрастает 12 видов рода Geranium, среди которых некоторые находят применение в народной медицине при болезнях пищеварительной системы (диарея, гастриты, колиты, энтероколиты), при воспалительных заболеваниях ротовой полости, кровотечениях различного генеза, при подагре, ревматизме.
Для видов этого рода характерно наличие комплекса полифенольных соединений в надземных и подземных органах. Однако, для большинства представителей рода сведения, касающиеся состава фенольного комплекса и других групп БАВ, фрагментарны.
Вышеприведенные факты указывают на целесообразность подробного исследования компонентного состава биологически активных соединений и фармакологической активности представителей рода Geranium с целью введения их в научную медицину.
Диссертационная работа была выполнена на кафедре фармакогнозии Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии (СПХФА) в соответствии с планом научно-исследовательских работ СПХФА по теме «Мониторинг перспективных лекарственных растений флоры России» (номер Государственной регистрации 01200852355). Фармакологические и микробиологические исследования проводились на базе лаборатории фармакологических исследований СПХФА и на кафедре микробиологии СПХФА. Исследования с использованием приборных хроматографических и спектроскопических методов выполнены в лаборатории аналитических методов НИУ академии, лаборатории экологии растительных сообществ Ботанического института им. В. Л. Комарова Российской Академии Наук и лаборатории «ООО Аналит Продактс».
Цели и задачи исследования. Целью работы является оценка возможности использования в качестве источников биологически активных веществ видов рода Geranium, произрастающих на северо-западе Европейской России, а также комплексное фармакогностическое изучение наиболее перспективных представителей данного рода.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Провести сравнительное изучение некоторых видов рода Geranium, произрастающих на северо-западе Европейской России, по содержанию дубильных веществ и антимикробной активности и выявить наиболее перспективные объекты для дальнейших исследований;
Провести сравнительное фитохимическое исследование отобранных на первом этапе видов рода Geranium;
Оценить острую токсичность водных извлечений из выявленных перспективных представителей рода; изучить их антимикробную активность;
Определить урожайность сырьевой фитомассы перспективных видов рода герань на конкретных зарослях на территории Ленинградской области;
Установить макро- и микроскопические признаки наиболее перспективного сырья; провести товароведческий анализ для установления норм качества лекарственного растительного сырья; разработать проект нормативного документа (проект фармакопейной статьи - ФС) на сырье.
Научная новизна. Впервые определены содержание дубильных веществ и антибактериальная активность 7 дикорастущих видов рода Geranium флоры северо-запада Европейской России (G. pratense L., G sylvaticum L., G palustre L., G sanguineum L., G. sibiricum L., G. robertianum L., G. pusillum L.) и культивируемого вида G lividum L' Her. С помощью современных физико-химических методов (ВЭЖХ, ГЖХ, спектрофотометрии) изучен химический состав основных групп БАВ (флавоноидов, фенольных кислот, углеводов, аминокислот) надземной и подземной части G pratense, G sylvaticum, G palustre. Изучен компонентный состав, динамика накопления БАВ в сырье указанных видов в разные фазы развития растений. Методом атомно-абсорбционной спектроскопии определен набор макро- и микроэлементов надземной и подземной частей G pratense, G sylvaticum, G palustre.
Экспериментально определен уровень острой токсичности водных извлечений из надземной и подземной частей G pratense, G sylvaticum, G palustre.
Проведено определение урожайности G pratense, G sylvaticum, G palustre в естественных условиях произрастания в Ленинградской области.
Практическая значимость. Разработана методика количественного определения суммарного содержания флавоноидов в надземной части G pratense. Определены сроки и оптимальная фаза вегетации растения для заготовки сырья, а также оптимальный размер сырьевой части, подлежащей заготовке. Установлены критерии, позволяющие оценить подлинность и доброкачественность сырья G pratense. Результаты работы использованы при
разработке проектов нормативных документов - ФС - на предлагаемые новые виды лекарственного сырья «Герани луговой трава» и «Герани луговой корневища с корнями». Экспериментально установлено, что водные извлечения из надземной и подземной части G. pratense обладают низкой токсичностью; также показана антибактериальная активность сухих экстрактов растения. Результаты фитохимического и фармакологического исследований надземной и подземной частей G pratense могут быть использованы для введения этих видов сырья в практику научной медицины, а также при целенаправленном создании новых фитопрепаратов. Методика качественного и количественного определения флавоноидов и фенольных кислот методом ВЭЖХ в надземной и подземной частях G pratense, G sylvaticum, G palustre введена в лекционный курс по дисциплине «Фармакогнозия» для студентов фармацевтического факультета.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на: Межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета поколений», посвященная 90-летию СПХФА (Санкт-Петербург, СПХФА 2009); Научно-методической конференции «Гаммермановские чтения - 2011» (Санкт-Петербург, СПХФА, 2011); 66-й региональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2011 г.); 11-ой Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего» (Санкт-Петербург, СПХФА, 2012); II Международной научно-практической конференции «Современная медицина и фармацевтика: анализ и перспективы развития» (Москва, 2012); Международной научно-методической конференции «Сандеровские чтения» (Санкт-Петербург, СПХФА, 2012); XVI Международном съезде «Фитофарм» (Санкт-Петербург, 2012); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященная 30-летию фармацевтического факультета ЯГМА «Инновационные процессы в лекарствоведении» (Ярославль, 2012).
Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 12 работах, в том числе 4 статьи в рецензируемых научных изданиях.
Основные положения, выносимые на защиту.
Результаты сравнительного изучения восьми видов рода Geranium по содержанию дубильных веществ и антимикробной активности;
Исследование динамики накопления и компонентного состава основных групп БАВ (флавоноидов, фенольных кислот, дубильных веществ, углеводов, аминокислот), а также минерального состава надземной и подземной частей G pratense, G sylvaticum, G palustre;
Результаты изучения острой токсичности водных извлечений из надземной и подземной частей G pratense, G sylvaticum, G palustre;
Критерии оценки качества и подлинности видов сырья «Герани луговой трава» и
«Герани луговой корневища с корнями» по результатам товароведческого анализа и
их стандартизация.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 235 страницах машинописного текста, иллюстрирована 76 рисунками и 70 таблицами. Диссертация состоит из введения, 6 глав (обзор литературы, материалы и методы и четыре главы, содержащие результаты экспериментальных исследований), основных результатов и выводов, списка литературы, включающего 128 источников, из них 52 на иностранных языках и 5 приложений.
В первой главе рассмотрены систематическое положение, химический состав и биологическая активность некоторых видов рода Geranium. Во второй главе приведены основные материалы и методы исследований, использованные в экспериментальной работе. В третьей главе приведены результаты сравнительного изучения восьми видов рода Geranium по содержанию дубильных веществ и антимикробной активности. В четвертой главе приведены результаты сравнительного фитохимического и фармакологического анализа надземной и подземной частей G pratense, G sylvaticum, G palustre, а также результаты определения урожайности сырья G pratense, G sylvaticum, G palustre на конкретных зарослях на территории Ленинградской области. В пятой главе отражены результаты исследования антимикробной активности сухих экстрактов, полученных на основе надземной и подземной части G pratense. Шестая глава посвящена вопросам стандартизации сырья «Герани луговой трава» и «Герани луговой корневища с корнями», проведению товароведческого анализа, разработке критериев подлинности, нормативов доброкачественности и определению сроков годности сырья. В разделе «Основные результаты и выводы» приведены заключительные результаты и выводы по проделанной работе. Приложение А включает список исследованных образцов видов рода Geranium; Приложение Б - проект ФС на сырье «Герани луговой трава» и пояснительную записку к нему; Приложение В - проект ФС на сырье «Герани луговой корневища с корнями» и пояснительную записку к нему; Приложение Г - фотографии исследованных видов рода Geranium, сделанные автором во время экспедиций в июне-августе 2009 года; Приложение Д - Акт о внедрении результатов диссертационной работы.
Автор выражает признательность администрации СПХФА в лице ректора академии профессора И. А. Наркевича за предоставленную возможность для выполнения диссертационной работы. Автор выражает глубокую благодарность сотрудникам отдела гербария БИН РАН Конечной Г. Ю. и Ефимову П. Г. за помощь в заготовке образцов сырья видов рода Geranium, заведующей лаборатории фармакологических исследований Бурякиной А. В., доценту кафедры микробиологии Караваевой А. В. и сотруднику лаборатории аналитических методов Сипкиной Н. Ю. за помощь в проведении химических и биологических экспериментов.
Основные группы биологически активных веществ видов рода Geranium флоры северо-запада Европейской России
Ниже мы приводим данные по географическому распространению и экологии 12 видов рода герань, присутствующих в составе флоры северо-запада Европейской России (то есть в тех областях, откуда происходит большая часть изученного нами материала). Эти данные приводятся на основании данных литературы [9, 24, 74].
G. pratense L. широко распространена в Европейской части России, в Предкавказье, в Западной и Восточной Сибири, на Дальнем Востоке (как заносное) и в Средней Азии. В Ленинградской, Псковской и Новгородской областях встречается часто, за исключением северных районов, где редка. Встречается на лесных опушках и лугах, в светлых лесах, среди кустарников, на лугах.
G. palustre L. также широко распространена в Европейской части России и на Кавказе. В Ленинградской, Псковской и Новгородской областях весьма обычна. Обитает на болотистых лугах и лесных полянах, в болотистых лесах, среди кустарников, по берегам водоемов.
G. sylvaticum L. произрастает на большей части территории Европейской части, на Кавказе, в Западной и Восточной Сибири, а также в Средней Азии в районе оз. Зайсан. В Ленинградской, Псковской и Новгородской областях весьма обычна. Лесной и опушечный вид, избегающий полностью открытых местообитаний. G. sanguineum L. довольно широко распространена в Европейской части и на Кавказе. На северо-западе Европейской России крайне редка, преимущественно Рисунок 1 - Типы высвобождения семян из созревших плодов и соответствующая им внутриродовая классификация Geranium [77, 128J: А - подрод Geranium; Б - подрод Robertium; В - подрод Erodioidea встречается в южных районах Псковской области, а также отмечена на крайнем западе Ленинградской области; внесена в Красную книгу природы Ленинградской области. Растет в сосновых борах и по их опушкам, вдоль дорог.
G sibiricum L. встречается в Европейской России (в западных районах -только как заносное), на Кавказе, в Западной и Восточной Сибири, в Средней Азии (как заносное). На северо-западе Европейской России встречается только как заносное на железнодорожных насыпях, по обочинам дорог, в населенных пунктах.
G rotundifolium L. встречается в некоторых районах Европейской России, на Кавказе, в Средней Азии, на Дальнем Востоке (как редкий занос). На северо-западе Европейской России очень редко отмечается как заносное у дорог и в населенных пунктах в Ленинградской и Псковской областях.
G bohemicum L. встречается в Европейской России и на Кавказе. Спорадически отмечается в Ленинградской, Псковской и Новгородской областях на лесных пожарищах и кострищах, на вырубках, иногда по обочинам лесных дорог.
G phaeum L. очень редко встречается в Европейской России. На северо-западе Европейской России обнаружена только в пределах Ленинградской области по рекам Мга и Винокурка на полянах, опушках и по береговым склонам, по-видимому как одичавшее. Из состава G phaeum некоторые авторы выделяют особый вид G. lividum L Her. (иногда он рассматривается как подвид - G phaeum subsp. lividum (L Her.) Pers.).
G. pusillum L. встречается во многих районах Европейской России, на Кавказе и в Средней Азии. В Ленинградской, Псковской и Новгородской областях встречается изредка как сорное на полях и огородах и как заносное вдоль путей сообщения, причем преимущественно в более южных районах.
G pyrenaicum Burm.f. в Европейской части наиболее распространена в южных районах (и в Крыму), севернее встречается редко и только как заносное в парках и вдоль дорог; в Ленинградской и Псковской областях отмечалась эпизодически.
G. divarication Ehrh. распространена в ряде районов Европейской России, на Кавказе, в Западной Сибири и Средней Азии. На северо-западе Европейской России единично отмечена как заносное в торговом порту Санкт-Петербурга.
G robertianum L. широко распространена в Европейской России (кроме некоторых северных районов), на Кавказе, в Западной Сибири и Средней Азии. Относительно нередко встречается в областях северо-запада Европейской России, более обычна в местах выхода известняка или гранита, где произрастает под пологом тенистых лиственных, реже смешанных лесов, в кустарниковых зарослях, иногда в парках.
Таким образом, можно видеть что из рассмотренных видов, на северо-западе Европейской России наиболее часто встречаются G pratensey G palustre и G. sylvaticum [24, 74]. Остальные виды (G sanguineum, G sibiricum, G. rotundifolium, G bohemicum, G phaeum, G pusillum G pyrenaicum, G divaricatum, G. robertianum) более или менее редки, a G. lividum встречается (редко) только в культуре.
Из вышеприведенных данных видно, что различные виды рода Geranium флоры северо-запада Европейской России имеют выраженные отличия друг от друга по экологической приуроченности. Также они хорошо различаются и по морфологическим признакам [9, 24, 74], что можно видеть из таблицы 1.
Многолетнее травянистое растение с толстыми корневищами, 20-80 см высотой. Корневище короткое, увенчанное темно-бурыми прицветниками базальных листьев. Стебли немногочисленные или одиночные, вверху разветвленные, бороздчатые. Стебель прямостоячий. Стебель и черешки прикорневых листьев довольно густо покрыты волосками. Прикорневые листья на длинных черешках, 7-раздельные, доли перистораздельные по крайней мере до половины ширины. Стеблевые листья пятиразде ьные, верхние сидячие трехраздельные. Многолетнее травянистое растение с толстыми
Цветоножки до начала цветения, как и при плодах, поникающие, во время цветения вверх стоящие. Цветоножки покрыты простыми и железистыми волосками. Венчик синий, но в сухом состоянии розовеющий. Лепестки во время цветения горизонтально расположенные. Нити наружных тычинок в нижней части сильно и внезапно расширенные. При вскрывании плода мерикарпии остаются в соединении с носиком. Цветоносы обычно расставленные по стеблю и не образуют компактного соцветия. Цветоножки при плодах не отгибающиеся книзу. Цветоножки покрыты только простыми волосками. Лепестки 1,5 см длиной. Венчик пурпурный. Лепестки книзу не отклоненные. Тычиночные нити постепенно книзу расширенные. При вскрывании плода мерикарпии остаются в соединении с носиком.
Методы ресурсоведческих исследований
На основании полученных хроматограмм (рисунки 23-28) можно заключить, что водорастворимые полисахариды из надземной и подземной частей G pratense, G. sylvaticum и G palustre построены из остатков нейтральных моносахаридов: маннозы, глюкозы, галактозы, рамнозы, арабинозы, ксилозы - и кислоты галактуроновой. В составе водорастворимых полисахаридов образцов надземной части G pratense, G sylvaticum и G. palustre преобладает манноза и галактуроновая кислота (рисунки 23-25). Основным мономерным звеном водорастворимых полисахаридов подземной части G. pratense, G. sylvaticum и G. palustre является глюкоза. Для подземной части G palustre следует отметить кроме того высокое содержание галактуроновой кислоты (рисунок 28).
Количественное содержание водорастворимых полисахаридов Определение динамики накопления водорастворимых полисахаридов проводили в образцах надземной и подземной частей G. pratense, G sylvaticum и G. palustre, заготовленных в различные фазы вегетации в 2010 году в Ленинградской области. Определение их количественного содержания в очищенном шроте-2 (рисунок 15) проводили спектрофотометрическим методом после реакции с фенолом и кислотой серной концентрированной в пересчете на галактозу [48, 70].
Данные по количественному содержанию водорастворимых полисахаридов в сырье представлены в таблицах 23, 24.
Для всех образцов сырья максимальное накопление водорастворимых полисахаридов отмечалось в фазу цветения, минимальное содержание водорастворимых полисахаридов отмечалось в фазу цветения-плодоношения. Выделение и анализ полисахаридной фракции-2
Шрот-3, оставшийся после выделения полисахаридной фракции-1 (рисунок 15), экстрагировали подкисленным раствором аммония оксалата 0,5% при 80С. Полученное извлечение упаривали на роторно-пленочном испарителе при 60С. Полисахаридную фракцию-2 (ПФ-2) осаждали путем добавления трёхкратного по объему количества спирта этилового 95% и отстаивания в течение 1 часа.
Состав моносахаридов, входящих в структуру комплексов ПФ-2 устанавливали с помощью ГЖХ-анализа ТМС-производных мономерных единиц, полученных после гидролиза ПФ-2 раствором кислоты трифторуксусной 20% [50]. Таблица 24 - Содержание водорастворимых полисахаридов в корневищах с корнями G pratense, G sylvaticum и G pa lustre
При изучении мономерного состава полисахаридной фракции-2 всех образцов установлено присутствие нейтральных (арабиноза, глюкоза, галактоза и рамноза) моносахаров. В составе комплексов ПФ-2, выделенных из образцов надземной части G. pratense, G sylvaticum и G palustre, обнаружен также кислый моносахарид (галактуроновая кислота) (таблица 25). Анализируя полученные хроматограммы, можно заключить, что в составе полисахаридной фракции-2 образцов надземной части G pratense, G sylvaticum и G palustre преобладает галактоза (рисунки 29-31). Для комплексов ПФ-2, изолированных из образцов подземной части G pratense, G sylvaticum и G palustre основным мономерным звеном является глюкоза (рисунки 32-34).
Хроматограмма, полученная при проведении ГЖХ-анализа ТМС-производных продуктов гидролиза ПФ-2 из корневищ с корнями G. palustre (образец № 34)
В результате изучения углеводов получены данные о составе свободных моносахаридов и их содержании в надземной и подземной части G. pratense, G. sylvaticum и G. palustre. Установлены мономерный состав выделенных полисахаридных комплексов: полисахаридной фракции-1 и полисахаридной фракции-2. Полученные результаты дополняют литературные сведения о БАВ данного рода.
Для анализа свободных аминокислот использовались следующие образцы сырья, заготовленные в фазу цветения-начала плодоношения в июле-августе 2011, согласно Приложению А: образец № 9 надземной части G. pratense, образец № 32 надземной части G. palustre, образец № 47 надземной части G. sylvaticum.
Для исследования аминокислотного состава методами БХ и ВЭЖХ из высушенного измельченного до размера частиц 2 мм сырья G. pratense, G sylvaticum, G. palustre были получены сухие извлечения на спирте этиловом 40%. Извлечения готовили методом 3-кратной мацерации при соотношении сырья и экстрагента 1:10 в режиме нагревания на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 1 часа. Объединенные отфильтрованные через бумажный фильтр извлечения концентрировали под вакуумом до густого остатка, а затем сушили над безводным кальция хлоридом при пониженном давлении и температуре 50-60С. Полученный сухой остаток измельчали до получения сыпучего порошка коричневого, зеленовато-коричневого или темно-желтого цвета.
Предварительное обнаружение аминокислот проводили методом восходящей одномерной БХ в системе растворителей БУВ (4:1:2) с использованием приема двойного разгона растворителей. Проявитель - раствор нингидрина в ацетоне 2% [73],
Перед нанесением на хроматографическую бумагу около 0,5 г сухого извлечения, полученного вышеописанным способом, растворяли в 2 мл спирта этилового 40%. Полученный раствор наносили на линию старта в количестве 10 мкл и хроматографировали в вышеописанных условиях.
В результате бумажно-хроматографического исследования качественного состава аминокислот в надземной части G. praten.se обнаружены 9 аминокислот: лизин, аргинин, серии, треонин, аланин, пролин, валин, лейцин, изолейцин (таблица 26), в надземной части G. sylvaticum и G. palustre обнаружены 7 аминокислот: аргинин, серии, аланин, пролин, валин, лейцин, изолейцин (таблица 26).
Для анализа образцов на общий состав аминокислот методом ВЭЖХ около 100 мг (точная навеска) сухого извлечения растворяли в 5 мл спирта этилового 40% и отбирали аликвоту 0,1 мл. Аликвоту полученного раствора переносили в пробирку. Проводили дериватизацию фенилизотиоцианатом [36, 53, 122], отфильтровывали и вводили в хроматограф. Все аминокислоты, кроме триптофана и суммы цистин и цистеин определяли описанным способом. Таблица 26 - Идентификация аминокислот надземной части G prateme, G sylvaticum a G palustre методом БХ
Общий фитохимический анализ G. pratense, G sylvaticum, G. palustre на основные группы биологически активных веществ
Кроме органических веществ, в любом растительном объекте присутствуют неорганические вещества, которые входят в так называемый «минеральный состав» растения. Общеизвестно, что минеральные вещества играют огромную роль в поддержании нормального физиологического состояния растительного организма и регуляции процессов метаболизма. Столь мощное воздействие минеральных веществ на биологические процессы не является удивительным, если учесть теснейшее взаимодействие между ними и такими органическими веществами, как гормоны, витамины, белки и ферменты [43]. В связи с этим в мировой практике проводятся систематические исследования элементного состава растений, знание которого дает возможность использовать их в медицине для коррекции элементного статуса человека [63, 125, 126]. Минеральные вещества представлены в растениях макро- и микроэлементами. К макроэлементам относятся калий, натрий, кальций, магний, фосфор и хлор. К микроэлементам относятся железо, марганец, медь, цинк, йод, кобальт, молибден и др. [6].
Склонность определенных видов к избирательной аккумуляции макро- и микроэлементов необходимо принимать во внимание при использовании растительного сырья для приготовления галеновых лекарственных препаратов, т.к. известно, что степень перехода минеральных компонентов в фитопрепараты может достигать 50% [17, 33]. При этом отмечается, что в водные извлечения эссенциальные микроэлементы переходят в большем количестве, чем в спиртовые извлечения и экстракты [17].
Изучение макро- и микроэлементов исследуемых видов рода Geranium проводили на базе лаборатории экологии растительных сообществ Федерального государственного бюджетного учреждения науки Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН.
Определение макро- и микроэлементов (в 2 повторностях) проводили по следующей методике: около 2,0 (точная навеска) сухого измельченного сырья с размером частиц 2 мм озоляли в муфельной печи при температуре 450С в кварцевых чашках в течение 12 ч. Золу растворяли в 6 мл кислоты азотной (1 моль/л) при нагревании на электрической плитке с закрытой спиралью в течение 2 мин. После охлаждения в каждую чашку прибавляли по 5 мл воды дистиллированной и все содержимое фильтровали в мерную колбу на 25 мл через бумажный фильтр (красная лента), несколько раз промывая фильтр водой дистиллированной. Доводили раствор до метки водой дистиллированной. Из фильтрата путём разбавления получали растворы с соотношением 1:10 (для определения микроэлементов) и 1:100, 1:500 (для определения макроэлементов). Определение макро- и микроэлементов проводили атомно-абсорбционным методом на спектрофотометре «Квант-АФА» [45]. Ошибка определения для аналитических повторностей не превышала 5%. В сырье определяли 3 макроэлемента (К, Са, Mg) и 6 микроэлементов (Fe, Mn, Си, Zn, Со, Ni), относящихся к группе эссенциальных, т.е. жизненно необходимых для организма человека [17, 67].
Анализ элементного состава подземной и надземной частей С. palustre, G. pratense и G sylvaticum выявил существенные различия аккумулирующей способности отдельных видов (таблицы 29, 30). Отметим, что содержание Со во всех объектах исследования оказалось ниже предела обнаружения.
Содержание К в траве изучаемых видов рода Geranium колеблется от 10,8 до 17,0 мг/г, а в корневищах с корнями - от 3,70 до 7,02 мг/г. Максимальное содержание К характерно для травы G sylvaticum, а минимальное - для корневищ с корнями G. palustre.
G. sylvaticum,подземная часть(образец № 53) 21,7±0,8 32,6±1,0 250±4 3,94±0,03 1,61 ±0,01 108 При этом концентрация указанных микроэлементов в подземных органах G. sylvaticum в несколько раз (от 2 до 10 раз в зависимости от микроэлемента) выше концентрации их в корневищах с корнями G. pahistre и G. pratense. В надземной части исследуемых видов Geranium концентрация упомянутых микроэлементов возрастает в ряду G. pahistre - G pratense - G sylvaticum и находится в интервале 10,0-17,5 мкг/г для Fe, для Мп - 2,53 6,2, для Zn - 21,9-36,0 мкг/г. В подземных органах эти показатели увеличиваются в ряду G pratense - G. palustre - G. sylvaticum и достигают для Fe - 4,02-21,7 мкг/г, для Мп - 2,40-32,6 и для Zn - 69,9-250 мкг/г.
Содержание Си в ряду исследуемых объектов варьирует незначительно, в надземной части анализируемых гераней колеблется от 3,59 до 4,87 мкг/г, а в подземной части - от 2,67 до 3,94 мкг/г. Наибольшее содержание Си отмечено для травы G palustre и корневищ с корнями G sylvaticum, наименьшее - для корневищ с корнями G palustre и травы G. sylvaticum.
Концентрация Ni в надземной части G. pratense 0,49 мкг/г сопоставима с содержанием данного элемента в траве G sylvaticum (0,56 мкг/г). Содержание Ni в подземных органах G sylvaticum почти в 3 раза превышает содержание данного элемнта в надземной части растения и составляет 1,61 мкг/г. Концентрация Ni в надземной и подземной части G palustre, и кроме того в корневищах с корнями G pratense оказалась ниже предела обнаружения.
Таким образом, G. palustre и G pratense накапливают в надземной и подземной части макроэлементы Са и Mg в большей степени по сравнению с G sylvaticum. Напротив, G. sylvaticum характеризуется значительно большим накоплением микроэлементов Fe, Мп и Zn в траве и корневищах с корнями по сравнению с G palustre и G pratense. Вероятно, это обусловлено, особенностью состава почв в районах произрастания видов и особенностями механизмов поглощения ионов металлов из почвы. Известно, что G pratense и G palustre -виды-кальцефилы [4], и, действительно, район заготовки сырья обоих видов, п. Пудость, известен своими карбонатными почвами [11]. Кроме того, в литературе приводятся сведения о том, что Са и Mg являются главными конкурентами микроэлементов в процессе поглощения растениями: например, в повышенных
Микроскопические признаки сырья G. pratense
Для установления нормативных показателей содержания суммы флавоноидов и дубильных веществ в траве G. pratense необходимо оценить их предельное содержание в сырье. Для этого было проанализировано семь образцов сырья, собранного в разных районах в фазы цветения - начала плодоношения. Определение количественного содержания суммы флавоноидов и дубильных веществ проводили с использование разработанных спектрофотометрических методик (см. разделы 4.1.3.4. и 6.4.). Полученные данные представлены в таблице 57.
Минимальное значение содержания суммы флавоноидов (для образца №61) составило 2,15%, дубильных веществ (для образца № 8) - 9,74%. Принятое в практике анализа лекарственного растительного сырья предельное значение содержания веществ (Хпрсл, в %) определяется по следующей формуле:
Величина предельного значения содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин составила: Хфед = 2,15 - 2 0,119 = 1,91%, или приблизительно 1,9%. Величина предельного значения содержания дубильных веществ в пересчете на кислоту галловую составила: Х1ред = 9,74 - 2 х 0,148 = 9,44%, или приблизительно 9,4%. Таким образом, в траве G. pratense, предлагаемой нами для использования в научной медицине, содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин должно составлять не менее 2,0%, содержание дубильных веществ в пересчете на кислоту галловую - не менее 9,5%.
Определение предельных знамений содержания суммы дубильных веществ в корневищах с корнями G. pratense
Проанализировано восемь образцов сырья, собранного в разных районах в фазы цветения - плодоношения. Определение количественного содержания суммы дубильных веществ проводили с использование разработанной спектрофотометрической методики (см. раздел 4.1 .ЗА). Полученные данные представлены в таблице 58. Минимальное значение содержания суммы дубильных веществ (для образца № 14)- 13,83%.
Величина предельного значения содержания дубильных веществ в пересчете на кислоту галловую составила: Х1ред - 13,83 - 2 0,710 = 12,41%, или приблизительно 12,4%.
При проведении фармакогностических исследований надземной части G. pratense определены следующие показатели для 5 партий цельного и измельченного сырья: содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин; содержание дубильных веществ в пересчете на кислоту галловую; потеря в массе при высушивании; содержание золы общей и золы, нерастворимой в растворе кислоты хлористоводородной 10%, измельченность сырья; наличие специфических (стеблей, в т. ч. отделенных при анализе; частиц сырья, изменивших окраску и поврежденных вредителями) и неспецифических (минеральной и органической) примесей [58].
Анализ проводили в образцах сырья №№ 4, 7, 11, 12, 13, приведенных в Приложении А.
Определения проводили согласно методикам, приведенным в ГФ XI [15, 16]. Результаты представлены в таблице 59 и включены в проект фармакопейной статьи на сырье «Герани луговой трава».
При проведении фармакогностических исследований подземной части С pratense определены следующие показатели для 5 партий цельного и измельченного сырья: содержание дубильных веществ в пересчете на кислоту галловую; потеря в массе при высушивании; содержание золы общей и золы, нерастворимой в растворе кислоты хлористоводородной 10%, измельченность сырья; наличие специфических (старых отмерших корневищ и корней и корневищ, почерневших на изломе) и неспецифических (минеральной и органической) примесей.
Для установления срока хранения сырья, были проанализированы образцы, заготовленные в период с 2009 по 2010 год, хранившиеся в стандартных условиях. Для них определяли содержание основных классов БАВ - флавоноидов и дубильных веществ по методикам, приведенным выше, а также влажность. Все измерения проводили в трехкратной повторности. Результаты представлены в таблицах 61, 62.
В процессе хранения в сырье наблюдали снижение значения содержания флавоноидов и дубильных веществ. По показателю «Влажность» существенных различий выявлено не было. На основании полученных результатов установлен срок хранения травы и корневищ с корнями герани луговой - 3 года.
Таким образом, для предлагаемого вида лекарственного растительного сырья были определены показатели подлинности (морфологические и анатомические признаки сырья и качественные реакции на основные группы биологически активных соединений, содержащихся в нем) и показатели качества (содержание действующих веществ, содержание золы общей и нерастворимой в растворе кислоты хлористоводородной 10%, пределы измельченности сырья, содержание специфических примесей, а также минеральной и органической примеси).
