Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Ботаническая, фармакогностическая и медико-биологическая характеристика чернушки дамасской 13
1.1 Характеристика рода Чернушка (Nigella) 13
1.2 Химический состав 21
1.3 Применение чернушки в традиционной и научной медицине 22
1.4 Культивирование и агротехника чернушки дамасской 24
Заключение по главе 1 26
ГЛАВА 2 Объекты и методы исследования 27
2.1 Объекты исследования 27
2.2 Методы исследования углеводов
2.2.1 Свободные моносахариды 27
2.2.2 Олиго- и полисахариды 28
2.2.3 Выделение полисахаридов из растительного сырья 28
2.2.4 Кислотный гидролиз 29
2.2.5 Хроматографический анализ углеводов 29
2.2.6 Газожидкостная хроматография (ГЖХ) 30
2.2.7 Спектрометрия в инфракрасной области 30
2.2.8 Количественное определение галактуронидов 30
2.2.9 Определение физико-химических характеристик пектинов 31
2.3 Методы исследования липидов 31
2.3.1 Выделение липидов из растительного сырья 31
2.3.2 Определение физико-химических показателей жирного масла 31
2.3.3 Газожидкостная хроматография (ГЖХ) 32
2.3.4 Газожидкостная хромато-масс-спектрометрия (ГХ-МС) 32
2.4 Методы исследования белков, пептидов, аминокислот 33
2.4.1 Качественное обнаружение аминокислот 33
2.4.2 Выделение и очистка пептидного комплекса 33
2.4.3 Выделение аминокислот и определение аминокислотного состава 34
2.4.4 Исследование пептидов методом электрофореза 34
2.4.5 Исследование пептидов методом ВЭЖХ 35
2.5 Методы исследования эфирных масел з
2.5.1 Газожидкостная хроматография (ГЖХ) 35
2.6 Методы исследования ферментной активности 36
2.6.7 Определениелиполитической активности 36
2.6.2 Определение протеолитической активности 36
2.7 Методы исследования макро- и микроэлементного состава 37
2.8 Общие методики стандартизации сырья 2.8.1 Методы отбора проб для анализа 38
2.8.2 Морфолого-анатомические исследования 38
2.8.3 Определение числовых показателей качества сырья 38
2.8.4 Определение микробиологической чистоты сырья 38
2.8.5 Определение содержания радионуклидов 38
2.8.6 Определение сроков хранения сырья 39
2.8.7 Статистическая обработка данных 39
2.8.8 Валидация методик количественного определения 39
2.9 Методы токсико-фармакологических исследований 40
2.9.1 Исследование «острой» токсичности 40
2.9.2 Изучение антибактериальной активности 41
2.9.3 Изучение ранозаживляющей активности 42
2.9.4 Изучение гиполипидемической активности 42
2.9.5 Изучение гепатозащитной активности 43
2.9.6 Изучение желчегонной активности 44
2.9.7 Изучение диуретической активности 44
2.9.8 Оценка биохимического профиля сыворотки крови лабораторных животных 44
2.9.9 Определение биохимических показателей в гомогенате печени лабораторных животных 47
ГЛАВА 3. Морфолого-анатомические исследования семян чернушки дамасской 48
3.1 Морфологическая характеристика семян чернушки дамасской 48
3.2 Анатомическая характеристика семян чернушки дамасской 49
выводы по ГЛАВЕ 3 56
ГЛАВА 4. Фотохимическое изучение растительного сырья 57
4.1 Исследование углеводов 57
4.1.1 Выделение полисахаридов 57
4.1.2 Изучение химического состава углеводных фракций 58
4.1.2.1 Групповые качественные реакции на углеводы 58
4.1.2.2 Изучение мономерного состава углеводных фракций методом хроматографии на бумаге 59
4.1.2.3 Изучение мономерного состава углеводных фракций методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) 61
4.1.2.4 Изучение углеводных фракций методом ИК-спектроскопии 61
4.1.2.5 Изучение физико-химических характеристик пектинов 64
4.2 Исследование липидов 65
4.2.1 Выделение липидов 65
4.2.2 Определение физико-химических показателей эюирного масла 67
4.2.3 Определение жирнокислотного состава 68
4.2.4 Определение компонентного состава жирного масла 70
4.2.5 Хроматографическое изучение липидов 72
4.3 Белки, пептиды, аминокислоты 73
4.3.1 Качественное обнаружение аминокислот 73
4.3.2 Количественное определение белка и пептидов 74
4.3.3 Определение аминокислот методом жидкостной хроматографии на аминокислотном анализаторе 74
4.3.4 Электрофоретический анализ пептидов 75
4.3.5 Изучение пептидов методом ВЭЖХ 76
4.4. Эфирные масла 77
4.4.1 Определение содержания эфирного масла 78
4.4.2 Определение подлинности эфирного масла 78
4.4.3 Изучение эфирного масла методом ГЖХ 80
4.4.4 Изучение эфирного масла методом ВЭЖХ 82
4.5 Ферменты 89
4.5.1 Определение липолитической активности 89
4.5.2 Определение протеолитической активности 90
4.5.3 Выделение фермента липазы
4.6 Разработка методики подлинности семян чернушки дамасской 91
4.7 Макро- и микроэлементный состав, тяжелые металлы, радионуклиды
4.7.1 Определение макро- и микроэлементного состава 95
4.7.2 Определение содержания тяжелых металлов 97
4.7.3 Определение содержания радионуклидов 98
4.8 Определение числовых показателей 100
4.9 Определение микробиологической чистоты 100
4.10 Обоснование норм качества «Чернушки дамасской семена» 101
Выводы по главе 4 104
Глава 5. Изучение фармакологической активности 107
5.1 Изучение «острой» токсичности 107
5.2 Изучение антибактериальной активности 113
5.3 Изучение ранозаживляющей активности 114
5.4 Изучение гиполипидемической активности 116
5.5 Изучение гепатозащитной активности 118
5.6 Изучение желчегонной активности 122
5.7 Изучение диуретической активности 124
Выводы по главе 5 125
Общие выводы 127
Список литературы
- Применение чернушки в традиционной и научной медицине
- Выделение полисахаридов из растительного сырья
- Анатомическая характеристика семян чернушки дамасской
- Определение аминокислот методом жидкостной хроматографии на аминокислотном анализаторе
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Несмотря на достаточно высокие
темпы развития мировой фармацевтической индустрии, для России остается острым вопрос внедрения в медицинскую практику отечественных препаратов. Одним из путей решения данной проблемы, является развитие фитохимиче- ских производств, для которых необходимо наращивать научный потенциал в сфере получения и расширения сведений о химическом составе лекарственного растительного сырья (ЛРС), фармакологической активности и развития сырьевой базы.
Пищеварительные ферменты - одна из наиболее часто используемых в гастроэнтерологии групп лекарственных средств. Нарушения процессов пищеварения различной степени выраженности выявляют практически при всех заболеваниях пищеварительного тракта [Охлобыстин А.В., 2012].
Применение препаратов, содержащих панкреатин, на первый взгляд, кажется более физиологичным. Но по некоторым данным преимуществом лекарственных препаратов растительного происхождения является отсутствие в составе животного белка и компонентов желчи, что делает возможным назначение данных ферментных препаратов при аллергиях, а также в тех случаях, когда присутствие желчных кислот крайне нежелательно [Сереброва С.Ю., 2006].
Нигедаза - ферментный препарат липолитического действия, полученный из семян чернушки дамасской (Nigella damascena L.), используется, как в отечественной, так и в зарубежной медицинской практике. Однако, после распада СССР, сырьевая база чернушки дамасской осталась в Украине и в настоящее время производство данного препарата в России затруднено из-за дефицита сырья. Перспективным направлением увеличения заготовок отечественного сырья является расширение его сырьевой базы. Поэтому Ставропольским НИИ сельского хозяйства, проведены интродукционные исследования по введению чернушки дамасской в промышленную культуру в регионе Ставропольского края.
Для фармацевтического производства необходимо предусматривать внедрение малоотходных технологий, что будет способствовать повышению рен-
табельности и снижению себестоимости фитопрепаратов. Это возможно за счет выявления дополнительных групп биологически активных соединений (БАС) и расширения возможности медицинского применения [Орловская Т.В., 2011].
В мировой литературе есть достаточно сведений о фармакологической активности различных групп БАС, в частности, жирного масла, углеводов, компонента эфирного масла - тимохинона, но химические исследования данных групп БАС носят фрагментарный характер, так как в большей мере проводились только в отношении ферментов.
В тоже время, с учетом возможности получения из данного сырья различных комплексов биологических веществ, необходимо разработать нормативную документацию, учитывающую различные пути использования и современные требования, предъявляемые к стандартизации ЛРС.
Таким образом, углубленное фитохимическое изучение семян Nigella damascena является актуальным и позволит расширить рамки их медицинского использования.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось комплексное фитохимическое исследование и установление фармакологической активности различных фармацевтических субстанций, полученных из семян Nigella damascena.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Проанализировать современное состояние исследований по химическому составу, биологическим и фармакологическим свойствам Nigella damascena.
-
Изучить химический состав семян Nigella damascena, выращенной в Ставропольском крае по группам биологически активных соединений: углеводы, липиды, пептиды, эфирные масла, ферменты, а также макро- и микроэлементы.
-
Определить критерии оценки подлинности и качества семян Nigella damascena для включения их в нормативную документацию.
-
Провести фармакологический скрининг фракций, полученных из семян Ni-
gella damascena.
-
Разработать нормативную документацию на лекарственное сырье «Чернушки дамасской семена».
Научная новизна. В результате проведенных исследований экспериментально подтверждена возможность использования семян Nigella damascena в качестве источника трех целевых групп БАС: ферментов, жирного и эфирного масел, что доказывает перспективу расширения ее использования в медицинской практике.
Впервые с помощью современных физико-химических методов (ВЭЖХ, ГЖХ, ГХ-МС, электрофореза и др.) проведено систематическое фитохимиче- ское изучение семян Nigella damascena, выращенных в Ставропольском крае. Данные исследования показали возможность комплексного использования сырья при его промышленной переработке.
Впервые определен качественный и количественный состав углеводов (выход углеводов составил около 3,55%). Проведен анализ физико-химических характеристик пектинов.
Изучен липидный комплекс семян Nigella damascena (содержание составляет до 30 %), выращенной в Ставропольском крае, методами ГЖХ, спектро- фотометрии и ГХ-МС и определены физико-химические показатели жирного масла.
В результате анализа пептидных фракций (содержание составило от 0,84% до 1,94%) методом эксклюзионной ВЭЖХ идентифицированы пептиды и определено их количество.
Методом ГЖХ и физико-химическими методами установлены показатели подлинности эфирного масла (содержание составляет до 3%). Разработана методика определения тимохинона в эфирном масле методом ВЭЖХ.
Подтверждена липолитическая активность (~9,5 ЛЕ/мг) и впервые установлена протеолитическая активность белков семян Nigella damascena (~17,6 ЕД/мг).
Методом атомно-абсорбционной спектроскопии определен набор макро- и микроэлементов в семенах Nigella damascena (27 элементов).
На основании морфолого-анатомического исследования определены анатомические признаки, позволяющие проводить диагностику семян Nigella damascena (цельное сырье, порошок).
Разработаны числовые показатели, регламентирующие качество сырья.
Проведены фармакологические скрининговые исследования различных субстанций на основе исследуемого сырья, результаты которых могут быть использованы при получении новых фитопрепаратов, обладающих антибактериальным, ранозаживляющим, гиполипидемическим, гепатозащитным, желчегонным и диуретическим действиями.
Теоретическая и практическая значимость. Теоретическая значимость исследования вытекает из новизны полученных результатов и заключается в получении новых сведений о химическом составе и фармакологической активности различных групп БАС, выделенных из семян Nigella damascena. В результате проведенной работы показана возможность использования исследуемого вида растительного сырья в комплексных малоотходных технологиях получения современных лекарственных фитопрепаратов. Данные, полученные в ходе фармакологических исследований, являются экспериментальным обоснованием для дальнейшего углубленного изучения различных фармацевтических субстанций.
Практическая значимость исследования заключается в том, что в результате фитохимического и фармакологического исследования доказана возможность использования отечественного сырья Nigella damascena для производства ферментного препарата «Нигедаза», а также в качестве источников эфирного и жирного масел, обладающих антибактериальной, ранозаживляющей, гиполи- пидемической, гепатозащитной и желчегонной активностями.
Предложен новый вид ЛРС для включения в Государственную фармакопею России XII издания.
Разработаны нормы качества и методики стандартизации семян Nigella damascena в соответствии с современными требованиями и пути использования, которые включены в проект фармакопейной статьи (ФС).
Для определения подлинности и качества семян Nigella damascena разработаны и предложены методики ТСХ-анализа, ГЖХ и спектрометрии.
Разработана методика ВЭЖХ для количественного определения тимохи- нона в эфирном масле семян Nigella damascena и проведена валидационная оценка по параметрам специфичность, линейность, прецизионность.
Результаты комплексного фитохимического исследования Nigella damascena, выращенной на базе Ставропольского НИИ сельского хозяйства позволили подготовить для передачи в Государственную комиссию по испытанию и охране селекционных достижений РФ новый сорт этой культуры.
На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:
-
Фармакопейная статья (ФС) «Чернушки семена» (проект для включения в Государственную фармакопею России XII издания);
-
Инструкция по сбору и сушке «Чернушки семена» (утверждена ГНУ ВИЛАР Россельхозакадемии 27.07.2012 г.);
Результаты диссертационных исследований используются в учебных процессах на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России и кафедрах фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России и ГБОУ ВПО ДВГМУ Минздрава России.
Методологическая основа, объекты и методы исследования. Методологической основой настоящей диссертационной работы послужили научные подходы к расширению номенклатуры отечественного официального ЛРС с использованием ресурсосберегающих технологий на основе комплексного фито- химического изучения.
Объектом исследования служили высушенные, измельченные семена чернушки дамасской (Nigella damascena L.) семейства лютиковых -
Ranunculaceae, заготовленные в период их полного созревания (2006-2010 гг.)
от растений, выращенных на территории Ставропольского края (ГНУ «Ставропольский НИИСХ» РАСХН, г. Михайловск).
Фитохимические исследования проводились с использованием комплекса различных физико-химических методов: хроматография колоночная (КХ), тонкослойная (ТСХ), бумажная (БХ), газожидкостная (ГЖХ), газожидкостная хро- мато-масс-спектрометрия (ГХ-МС), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), электрофорез, спектрометрия в УФ, видимой и ИК- областях, атомно-абсорбционная спектроскопия (ААС) и др.
Скрининговые микробиологические и фармакологические исследования включали изучение антибактериальной, ранозаживляющей, гиполипидемиче- ской, гепатозащитной, желчегонной и диуретической активностей.
Положения, выносимые на защиту: на защиту выносятся следующие положения, характеризующиеся научной новизной:
-
-
Результаты фитохимического исследования семян Nigella damascena, выращенной в Ставропольском крае по группам биологически активных соединений: липиды, эфирные масла, углеводы, пептиды, ферменты, а также макро- и микроэлементы.
-
Результаты по разработке критериев подлинности и показателей качества растительного сырья.
-
Результаты скринингового фармакологического исследования биологически активных комплексов семян чернушки дамасской.
Степень достоверности и апробация результатов. Оценка степени достоверности научных результатов определяется большим объемом проанализированной информационной базы, комплексностью и детальностью исследования, использованием большого количества современных физико-химических методов анализа, математико-статистической обработкой полученных результатов.
Материалы исследования доложены и обсуждены на региональных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической
продукции» (г. Пятигорск, 2011 г., 2012 г.).
Публикации. Основные положения диссертации отражены в 10 научных работах, в том числе 5 статьях в журналах, входящих в перечень рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций, рекомендованных ВАК РФ.
Связь задач исследований с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно- исследовательских работ ПМФИ - филиала ВолгГМУ Минздрава России по зарегистрированной теме: «Фармакогностическое исследование дикорастущих и культивируемых растений с целью расширения сырьевой базы и внедрения в медицинскую практику» (№ Гос. регистрации 01201354514).
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 145 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Объекты и методы исследования», трех глав экспериментальной части, общих выводов, списка литературы и приложения. В тексте содержится 31 таблица, 32 рисунка. Список цитируемой литературы включает 187 источника, из них - 39 на иностранных языках.
В первой главе рассмотрены ботаническая, фармакогностическая и медико-биологическая характеристика рода Nigella. Во второй главе приведены основные материалы и методы исследований, используемые в экспериментальной работе. В третьей главе приведены результаты морфолого-анатомического исследования исследуемого сырья. В четвертой главе отражены результаты фито- химического анализа семян Nigella damascena. Пятая глава посвящена изучению фармакологической активности некоторых фитосубстанций, полученных из семян Nigella damascena. В разделе «Основные результаты и выводы» приведены заключительные результаты и выводы по проделанной работе. Приложение включает проект ФС на сырье «Чернушки дамасской семена», Инструкцию по сбору и сушке «Чернушки семена», акты о внедрении результатов диссертационной работы и материалы изучения «острой» токсичности.
Применение чернушки в традиционной и научной медицине
Наиболее полно изучен химический состав чернушки посевной [79]. Методом ГЖХ изучен состав различных углеводных фракций. Установлены наиболее важные характеристики пектинов: рН 1 % водных растворов, содержание свободных и этерифицированных карбоксильных групп, полигалактуроновой кислоты. В результате изучения хлороформно-метанольной фракции методом ГХ-МС идентифицировано 36 компонентов, помимо жирных кислот, присутствуют ретинолы, токоферолы, ситостерины [61]. Методом гель-электрофореза определены молекулярные массы пептидов, в результате чего зафиксированы низкомолекулярные пептиды от 250 кДа до 11 кДа [63]. Семена ее содержат тимохинон [151], макро-и микроэлементы: кальций, железо, медь, фосфор, калий, магний, марганец, цинк, молибден, хром, селен, стронций, бор и йод, стероиды: кампестерин, ситостерин, стигмастерин, альфа-спинастерин [78, 79]. В семенах содержится липаза [16].
Выделены и охарактеризованы биоактивные пептиды семян чернушки посевной, относящиеся к классу дефензинов и липидпереносящим белкам [41].
Семена чернушки дамасской содержат 40-44 % жирного масла, в состав которого входят ненасыщенные жирные кислоты [53, 187]; до 1,5 % эфирного масла [160, 161, 163, 178, 180], витамин Е, тритерпеновые сапонины [166], кумарины [165], хиноны: тимохинон [184, 185, 186], клетчатку, калий, кальций, марганец, цинк и медь, стероиды: кампестерин, ситостерин, стигмастерин, холестерин, альфа-спинастерин. В стеблях, листьях, цветках и семенах содержится алкалоид да-масценин до 0,3 % [99]. В семенах идентифицировано фенольное соединение — 1-0-(2,4-дигидрокси)фенилацетилглицерол [150].
В семенах чернушки накапливается очень важный фермент липолитическо-го действия - липаза [42, 84]. В кристаллическом нигеллоне, выделенном из растения, содержатся 15 аминокислот, протеины [159]. Фосфолипиды представлены фосфатидилхолином и фосфатидилинозитолом. Семена содержат жирное масло, фермент - липазу, тритерпеновые сапонины, кумарины, тимохинон и следы алкалоидов [99]. Из гидролизата надземной части чернушки полевой выделено три вещества флавоноидной природы и идентифицированы как кемпферол, кверцетин и рамноцитрин [150].
Химический состав надземной части представлен кумаринами, флавонои-дами: кверцетином, рамноцином и кемпферолом, витамином С.
В траве чернушки посевной и дамасской методом ВЭЖХ идентифицированы пигменты: лютеин, зеаксантин, (3-криптоксантин, а-каротин, [3-каротин, неок-сантин и каротиноиды [177].
Чернушка железистая, как и другие виды, содержит флавоноиды, эфирное масло, сесквитерпеновые углеводороды, стероиды, алкалоиды, витамины, жирное масло и ферменты [87].
В народной медицине семена чернушки применяются достаточно разнообразно. Растертая чернушка с виноградным уксусом помогает при болях в суставах [28]. Настой семян чернушки дамасской обладает мочегонным, желчегонным, общеукрепляющим и глистогонным действием [67], способствует увеличению лактации у кормящих матерей, нормализует менструальный цикл, уменьшает метеоризм и нормализует стул при наличии запоров [7]. Отвар семян эффективен при бронхиальной астме, бессоннице, связанной с тревогой, женских заболеваниях, почечнокаменной болезни, гепатите, некоторых кожных заболеваниях [181]. При местном наружном применении масло чернушки используют для косметических масок, компрессов, массажа [14, 112, 158].
Из семян чернушки дамасской получен препарат «Нигедаза», содержащий фермент липолитического действия. «Нигедаза» - препарат, рекомендованный в качестве средства, возмещающего недостающую или полностью отсутствующую липолитическую активность дуоденального сока, обусловленную патологией органов пищеварения (панкреатиты, холецистопанкреатиты, хронические гепатиты, хронические гастриты, энтероколиты и т. д.), а также при возрастном снижении липолитической активности [100, 102, 103]. Следует отметить, что «Нигедаза» является препаратом растительной липазы, используемым как в отечественной, так и в зарубежной медицинской практике [48, 59, 121].
В эксперименте бутанольный экстракт надземной части и семян, эфирное масло проявляют антибактериальную активность [154], спиртовой экстракт семян - эстрогенподобную [152, 157, 164], что связано с наличием фенольных соединений [165]. Мазь на основе жирного масла обладает ранозаживляющим действием [38].
Жирное масло чернушки имеет множество показаний для применения, как высокоэффективное мочегонное, желчегонное, мягкое слабительное, как иммуностимулирующее средство, к тому же оно дает результаты в лечении различных дерматологических заболеваний, связанных с нейрогуморальными и гистамин-ными нарушениями в организме [30, 158, 170].
Благодаря наличию ряда медиаторных веществ, масло чернушки стимулирует секрецию гистаминазы (антагониста биогенных аминов) и выработку проти-вогистаминных антител. К тому же поставка в ткани циклооксигеназы обеспечивает высокий коэффициент антисеротонинной активности. При клинических испытаниях на пациентах с аллергическими заболеваниями (аллергический ринит, бронхиальная астма, атопическая экзема) после лечения, проведенного маслом чернушки в капсулах в дозе 40-80 мг/кг/сут, было выявлено, что субъективные аллергические ощущения уменьшались у всех пациентов [170]. Отмечено снижение содержания триацилглициридов в плазме и повышение уровня липопротеидов высокой плотности, в то время как количество эозинофилов, кортизола и адрено-кортикотропинов не изменилось [166].
Препараты чернушки стимулируют синтез иммуномодуляторов, что позволяет быстро нейтрализовать инфекционную агрессию, и оказывают противовоспалительное действие на местном и системном уровне, устраняя симптомы простуды [158].
Выделение полисахаридов из растительного сырья
Принцип метода основан на том, что продукты перекисного окисления ли-пидов в присутствии ортофосфосфата образуют с тиобарбитуровой кислотой окрашенный комплекс, экстрагируемый бутанолом, интенсивность которого, измеряемая на СФ-2000 при длинах волн 535 и 570 нм, пропорциональна концентрации МДА [188]. Для расчета использовали коэффициент молярной экстинции МДА - 1,56х105М см" . Результаты выражали в мкмоль МДА /л.
Определение fi- и пре- /5 липопротеидое сыворотки крови проводили турби-диметрически по Бурштейну и Самай [126], остальные показатели сыворотки крови определяли на автоматическом биохимическом анализаторе BS-120 (Mindray) с использованием стандартных жидких реактивов фирмы Diasis (Германия).
Для определения содержания общего и прямого билирубина в сыворотке крови использовали фотометрический тест с использованием стандартного набора реактивов «DiaSys».
Принцип определения: в кислой среде в присутствии диазотированного 2,4-дихлоранилина билирубин образует азосоединение красного цвета. Специфическая смесь детергентов делает возможным надежное и точное определение общего и прямого билирубина. Содержание общего и прямого билирубина выражали в мкмолях на 1 л сыворотки. Содержание непрямого билирубина определяли расчётным методом.
Количество холестерина в сыворотке крови (ммоль/л) измеряли ферментативным фотометрическим тестом CHODPAP с использованием стандартного набора реактивов «DiaSys».
При гидролизе эфиров холестерина холестеринэстеразой образуется свободный холестерин. Образовавшийся в результате гидролиза и имеющийся в пробе холестерин окисляется кислородом воздуха под действием холестериноксида-зы с образованием эквимолярных количеств перекиси водорода. Под действием пероксидазы перекись водорода окисляет хромогенные субстраты с образованием окрашенного соединения, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации холестерина в пробе и измеряется фотометрически. Содержание триглщеридов (ТРГ) определяли ферментативным колориметрическим методом с использованием стандартного набора реактивов «DiaSys» и выражали в ммоль/л.
Принцип метода основан на катализе липазой реакции гидролиза ТРГ с образованием жирных кислот и эквимолярного количества глицерина. Глицерин при наличии АТФ, гексокиназы и глицерофосфатоксидазы окисляется кислородом воздуха с образованием эквимолярного количества перекиси водорода. Перокси-даза катализирует окисление хромогенных субстратов перекисью водорода в присутствии хлорфенола с образованием окрашенного продукта, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации ТРГ в пробе и измеряется фотометрически.
Активность АлАт в сыворотке крови определяли методом оптимизированного УФ теста в соответствии с реакциями IFCC (Международная Федерация Клинической Химии и Лабораторной Медицины). Использовали стандартный набор реактивов «DiaSys». Принцип определения: L-Алании +2 Оксоглутарат АЛТ L- Глутамат+Пируват Пируват+ НАДН+Н+ АЛТО-Дактат+ НАД По убыли НАДН в среде инкубации судили об активности АлАт. Активность фермента выражали в Е/л.
Активность ЩФ в сыворотке крови определяли кинетическим, оптимизированным, стандартным методом в соответствии с рекомендациями DGKC (Германское Общество Клинической Химии). Использовался стандартный набор реактивов «DiaSys». Мерой каталитической концентрации фермента являлось количество освобождённого 4-нитрофенола, который определяли фотометрически методом постоянного времени после остановки ферментативной реакции ингибитором ЩФ. Активность фермента выражали в Е/л. 2.9.9 Определение биохимических показателей є гомогенате печени лабораторных животных
Определение содержания ТБК-активных продуктов в гомогенате печени. Для определения ТБК-активных продуктов в печени крыс за основу был взят метод Ohkawa и соавт. [176], разработанный для гомогенатов ткани и других биологических образцов. Гомогенат печени готовили на 0,85 % растворе NaCl в соотношении 1:8 или на 100 мМ трис-НС1 буфере в соотношении 1:7. Метод основан на превращении гидроперекисей ПОЛ в малоновый диальдегид и окрашивании последнего с тиобарбитуровой кислотой. Спектры окрашенных бутанольных экстрактов измеряли на СФ-46. Расчет производили по разности экстинкций при 535 нм и 520 нм, используя коэффициент молярной экстинции МДА -1,56х105М"1см"1. Результаты выражали в нмоль на 1 мг белка в реакционной смеси. Белок определяли по методу Лоури в модификации Миллера [175].
Определение содержания ТРГ в печени. Количество триглицеридов в гомогенате печени (мкмоль/г) измеряли по Gottfrieds S.P., Rosenberg В. в модификации Сентебовой [113]. Стандартный раствор триолеина для определения содержания ТРГ содержал 80% воды для устранения ошибки экстрагирования [113]. Гомогенат печени готовили на 0,85 % растворе NaCl в соотношении 1:8 или на 100 мМ трис-HCl буфере, рН 7,4 в соотношении 1:7.
Анатомическая характеристика семян чернушки дамасской
Углеводы являются одним из наиболее распространенных классов химических соединений, встречающихся практически во всех растениях. Представления о биологической роли углеводов претерпели в последние годы значительную трансформацию от положения о том, что основная роль углеводов связана с их использованием в качестве энергетического субстрата («клеточного топлива»), до современной точки зрения на существенно более широкие физиологические функции углеводов.
Анализ литературных данных свидетельствует о том, что лекарственные растения, содержащие углеводы, могут использоваться как в качестве лекарственных средств, так и биологически активных добавок к пище [66]. При этом следует отметить низкую токсичность как лекарственных растений, содержащих углеводы, так и выделенных из них полисахаридных комплексов, и широкий спектр фармакологической активности. В частности, многочисленными исследованиями было установлено наличие у полисахаридов выраженных антигипоксического, отхаркивающего, противовоспалительного, иммунотропного, энтеросорбирующе-го, гепатопротекторного, гиполипидемического, противоопухолевого, общеукрепляющего эффектов [46, 52, 71, 86, 122]. В связи с этим задачей нашего исследования явилось изучение состава и содержания углеводов. Анализ проводили в соответствии с методиками, указанными в разделе 2.2.
Углеводы разделяли по методике, описанной в разделе 2.2.3, в результате чего выделены углеводные фракции: растворимые в холодной воде углеводы (ВРПС-Х); растворимые в горячей воде углеводы (ВРПС-Г); кислые углеводы (ПВ); щелочные углеводы (ГЦ). Результаты количественного определения различных фракций полисахаридов представлены в таблице 1. Таблица 1 - Физические свойства и технологические выходы углеводных фракций, выделенных из семян чернушки дамасской Фракции Технологическиевыходы,% к сырью Физические свойства фракций ВРПС-Х 0,37-0,57 Порошок серого цвета. Растворим в воде, образуя коллоидный раствор, минеральных кислотах, щелочах, нерастворим в органических растворителях ВРПС-Г 0,37-0,55 Порошок серого цвета. Растворим в воде, образуя коллоидный раствор, минеральных кислотах, щелочах, нерастворим в органических растворителях пв 0,38-0,52 Аморфный порошок светло-серого цвета. Растворим в горячей воде, образуя вязкий раствор, нерастворим в органических растворителях ГЦ 2,97-3,37 Порошок коричневого цвета. Растворим в щелочах, нерастворим в воде. Водный раствор полисахаридов с йодом дает положительную реакцию, это позволяет предположить присутствие полисахаридов глюканового типа. Гравиметрический анализ свидетельствует о преобладании гемицеллюлоз.
Групповые качественные реакции на углеводы Для установления наличия отдельных групп углеводов использованы универсальные реакции, подтверждающие присутствие углеводов, в том числе крахмала, полиуронидов, а также восстанавливающих Сахаров. Для обнаружения полисахаридов применены реакции осаждения спиртом этиловым 96 % [123], ацетоном [70]; восстанавливающих Сахаров (после предварительного кислотного гидролиза полисахаридов) - с реактивом Фелинга [26], кислотой пикриновой в ще 59 лочной среде [85]; крахмала - с раствором йода [139]; галактуронидов — со спиртовым раствором карбазола в сернокислой среде [33].
Результаты качественного анализа углеводов в выделенных из различных растительных объектов фракциях приведены в таблице 2.
Во всех углеводных фракциях, выделенных из семян чернушки дамасской, идентифицированы полисахариды и восстанавливающие сахара. Во всех фракциях обнаружены галактурониды, за исключением гемицеллюлозной, крахмал - в водорастворимых и кислых фракциях. Углеводные фракции после кислотного гидролиза, проведенного, как описано в разделе 2.2.4, были подвергнуты хроматографированию на бумаге {раздел 2.2.5).
По появлению на хроматограммах красных и красно-коричневых пятен с соответствующими величинами подвижности веществ (Rf) оценивали углеводный состав фракций. Во всех фракциях полисахаридов идентифицированы: галактоза, глюкоза, арабиноза, ксилоза.
Основным углеводом в водорастворимых фракциях является глюкоза, арабиноза, галактоза, в кислых фракциях - арабиноза и глюкоза, в гемицеллюлозных фракциях - ксилоза.
Определение аминокислот методом жидкостной хроматографии на аминокислотном анализаторе
Из оставшегося шрота после выделения нейтральных липидов смесью растворителей хлороформ-метанол (2:1) выделяли сумму глико- и фосфоли-пидов. Экстракт очищали от углеводов промывкой 0,5 % раствором кальция хлорида (водным) с последующим хроматографированием на колонке. Липи-ды вымывали смесью растворителей хлороформ-метанол-вода (90:10:1).
Разделение фосфолипидов и гликолипидов осуществляли колоночной хроматографией на силикагеле L 100/250. Остатки нейтральных липидов элюировали хлороформом, гликолипидов - ацетоном, фосфолипидов - метанолом.
Сумму нейтральных липидов разделили на отдельные классы колоночной хроматографией также на силикагеле. Элюирование классов нейтральных липидов осуществляли гексаном с постепенно увеличивающейся концентрацией диэтилового эфира (0, 10, 20, 30, 40, 50, 100 %).
Содержание каждой группы устанавливали гравиметрически после удаления растворителя [79].
Качественный состав нейтральных липидов устанавливали методом ТСХ на пластинках «Silufol» и силикагеля (с 10 % кальция сульфата) в различных системах растворителей: для нейтральных липидов: гексан-эфир диэтиловый (4:1; 1:1); для гликолипидов: хлороформ-ацетон-метанол-кислота уксусная-вода (65:20:10:10:3).
Фосфолипиды анализировали двумерной ТСХ на силикагеле в системах растворителей: 1) хлороформ-метанол-25 % аммиак (13:7:1) и 2) хлороформ-метанол-кислота уксусная-вода (14:5:1:1). Для детектирования зон адсорбции на хроматограммах нейтральных липидов использовали 50 % водный раствор кислоты серной с последующим нагреванием пластинок, для гликолипидов - растворы а-нафтола и кислоты хлорной, для фосфолипидов -реактивы Васьковского, Драгендорфа и раствор нингидрина [79].
Идентификацию различных групп липидов проводили в сравнении со стандартными образцами и по величине Rf.
Выявлены следующие классы липидов, % от массы: углеводороды -1,2 %, сложные эфиры стеролов и тритерпенолов с жирными кислотами -0,5 %, триацилглицериды - 28 %, свободные жирные кислоты - 0,6 %, свободные стеролы и тритерпенолы - 0,7 %.
Качественные реакции на наличие белков и аминокислот (раздел 2.4.1) дали положительные результаты, как с биуретовым реактивом, так и с нин-гидрином (сине-фиолетовое окрашивание), что свидетельствует о наличии свободной аминогруппы, принадлежащей предположительно белкам, пептидам, аминокислотам.
Качественный состав свободных аминокислот в исследуемом сырье определяли методом БХ (раздел 2.4.1).
Для идентификации аминокислот использовали стандартные образцы (СО) аминокислот, которые хроматографировали одновременно с исследуемым извлечением. По характерной окраске и Rf аминокислот, сравнением с СО, нами обнаружены во всех исследованных образцах не менее 10 аминокислот, из которых идентифицировали аргинин (і?/-0,20), гистидин (І О О), лизин (Rf-Q,\2), глутаминовую кислоту (Я/-0,30), аланин (7?/-0,45), триптофан (i?/-0,55), аспарагиновую кислоту (0,24), валин (0,60), глицин (0,26), лейцин (0,75), изолейцин (0,72), тирозин (0,45), треонин (0,35), серии (0,27), фенила-ланин (0,68). Среди обнаруженных аминокислот особый интерес представляют незаменимые аминокислоты: треонин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, лизин. Свободные, или несвязанные, аминокислоты представляют собой наиболее удобную форму. Они обладают более высокой биологической доступностью, абсорбируясь непосредственно в кровоток. После приема внутрь всасываются очень быстро и, как правило, не вызывают аллергических реакций.
Характеристику образцов начинали с определения количественного содержания суммарного белка по содержанию азота, используя метод Кьельда-ля [23]. Выход белка составил 20,03±0,02 %.
Выделение пептидных экстрактов проводили по разработанной методике, указанной в литературе [79, 120] {раздел 2.4.2).
Количественное определение пептидов в полученных экстрактах проводили спектрофотометрическим методом (метод Каар-Каля), который основан на способности ароматических аминокислот (триптофана и тирозина) поглощать ультрафиолетовый свет с максимумом поглощения при 280 нм [63].
Содержание пептидного комплекса в семенах чернушки дамасской составляет в среднем от 0,84 до 1,94 %.
Все пептидные экстракты охарактеризованы методом аминокислотного анализа. Данная методика позволяет получать пептидные экстракты с воспроизводимым компонентным составом. Результаты представлены в таблице 9. В семенах чернушки дамасской идентифицированы по 6 незаменимых аминокислот, что в сумме составляет 14,23 % (34,50 % от общей суммы).
Основными по содержанию в семенах чернушки дамасской являются глутамин, аспарагин и лейцин (в порядке убывания). Как следует из результатов исследования, аминокислотный состав пептидных экстрактов представлен всеми незаменимыми аминокислотами, в различном количественном соотношении; отличается сбалансированностью по заменимым аминокислотам, одинаков по сумме доминирующих компонентов.
Содержание триптофана определить не удалось в связи с его разрушением при кислотном гидролизе [23], отсутствие цистеина свидетельствует о том, что в сумме пептидов отсутствуют дисульфидные связи, т.е сумма не содержит в своем составе цистеинсодержащие пептиды. Таблица 9 —Аминокислотный состав пептидных гидролизатое
Похожие диссертации на Фармакогностическое изучение семян чернушки дамасской (Nigella damascena L.), выращенной в условиях Ставропольского края
-
