Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы.
1.1. Биологические особенности растения амарант 10
1.2. Химический состав растения амарант 12
1.3. Физиологические особенности амаранта 13
1.4. Характеристика и способы получения масла семян амаранта 15
1.5. Выделение фосфолипидов из растительного сырья. 20
1.6. Методы определения фосфолипидов в растительном сырье и фармпрепаратах 28
1.7. Фармакологическая активность фосфолипидов 45
Глава 2. Материалы и методы исследования.
2.1. Характеристика объекта исследования 46
2.2. Методика получения фосфолипидного комплекса 46
2.3. Характеристика сорбентов и методика их подготовки для фракционирования фосфолипидов 47
2.4. Методика подготовки образцов для проведения ИК-спектроскопического анализа 50
2.5. Методика газохроматографического определения состава жирных кислот липидной фракции масла семян амаранта 51
2.6. Методика определения физико-химических показателей качества масла 52
Глава 3. Методика выделения фосфолипидов растительных масел .
3.1. Выбор сорбентов для разделения и фракционирования фосфолипидов и определение их обменной емкости 59
3.2. Построение изотерм сорбции 62
3.3. Количественное определение фосфолипидов методом УФ-спектрофотометрии 73
3.4. Выделение и фракционирование фосфолипидов масла семян амаранта методом колоночной хроматографии 77
3.5. Разделение и определение фосфолипидов методом зонального высоковольтного электрофореза на бумаге 81
Глава 4. Изучение физико-химических свойств и состава масла семян амаранта
4.1. Определение физико-химических характеристик качества масла семян амаранта 91
4.2. Определение состава жирных кислот липидной фракции масла 95
4.3. Анализ липидной фракции масла семян амаранта 98
4.4. Разработка методики определения фосфолипидов 99
4.5. Сравнительная характеристика методик определения фосфолипидов 113
Глава 5. Стандартизация масла семян амаранта
5.1. Описание масла семян амаранта 115
5.2. Определение физических констант 116
5.3. Определение химических показателей качества 118
5.4. Определение жирнокислотного состава масла 118
5.5. Определение степени чистоты масла семян амаранта 119
5.6. Количественное определение биологически активных веществ 124
Общие выводы 129
Список литературы 131
Приложения 147
- Методы определения фосфолипидов в растительном сырье и фармпрепаратах
- Характеристика сорбентов и методика их подготовки для фракционирования фосфолипидов
- Количественное определение фосфолипидов методом УФ-спектрофотометрии
- Определение состава жирных кислот липидной фракции масла
Введение к работе
Масла большинства дикорастущих растений и культурных сортов принадлежат к числу весьма ценных лекарственных средств, давно используемых в лечебной практике. Они применяются как самостоятельные лекарственные препараты для лечения ожогов и ран, так и в качестве вспомогательных веществ для приготовления инъекционных растворов, мазевых и суппозиторных основ. Кроме того, растительные масла и отходы их производства могут служить источником получения новых лекарственных средств, обладающих уникальным комплексом фармакологических свойств. Лечебный эффект жирных растительных масел обусловлен наличием целого комплекса биологически активных соединений, таких как, токоферолы, эссенциальные фосфолипиды, полиненасыщенные жирные кислоты, фитостерины и др.
В последние годы наблюдается тенденция расширения сырьевой базы за счет внедрения новых нетрадиционных растений и отходов пищевой промышленности. В Воронежском госуниверситете разработана и запатентована методика получения масла из семян амаранта гибридного (Oleum Amaranthacta). Новый способ экстракции и очистки позволяют получить масло с максимально возможным содержанием биологически активных веществ. В настоящее время в России организовано промышленное производство масла семян амаранта, которое активно внедряется на фармацевтический рынок в качестве биологически активной добавки.
В связи с этим возникает необходимость подробного изучения химического состава, совершенствования способов извлечения биологически активных веществ и методов стандартизации жирных растительных масел.
Одним из основных компонентов липидной фракции масла являются фосфолипиды, которые обладают гепатопротекторным, иммуномоделирующим, антиоксидантным и регенерирующим действием. Содержание фосфолипидов в растительных маслах в соответствии с требованиями нормативной документации приводится в суммарном виде. Однако, не все фосфолипиды обладают одинаковым фармакотерапевтическим эффектом. Поэтому весьма актуальным представляется изучение фосфолипидного состава масел, используемых в фармации, а также разработка современных методов разделения и анализа этой группы веществ.
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
Целью диссертационной работы явились исследования по разработке унифицированных методик разделения, идентификации и количественной оценки фосфолипидов масла семян амаранта с последующей стандартизацией изучаемого объекта по всем параметрам качества.
Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
- исследовать и оценить физико-химические показатели качества масла семян амаранта;
- установить жирнокислотный состав липидной фракции масла семян амаранта;
- изучить возможности сорбционного выделения фосфолипидов из липидного комплекса масла семян амаранта сорбентами различной природы;
- выбрать оптимальные параметры для фракционирования и идентификации фосфолипидов методом зонального высоковольтного электрофореза на бумаге;
- разработать методику количественного определения фосфолипидов в изучаемых объектах;
- предложить способ стандартизации масла семян амаранта.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА
Проведена оценка качества масла из семян амаранта по физико-химическим показателям, регламентируемым нормативной документацией.
Методом газожидкостной хроматографии установлен жирнокислотный состав липидной фракции масла семян амаранта. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что изучаемое масло идентично растительным маслам линолевой группы с высокой долей пальмитиновой и олеиновой кислот.
Изучен состав липидной фракции масла семян амаранта и установлено наличие следующих компонентов: сквален, стерины, токоферолы, фитостерины, фосфолипиды, свободные жирные кислоты и глицериды жирных кислот.
Изучена сорбционная активность фосфолипидов по отношению к аниониту АВ-17-2П, катиониту КРС, неионогенному сорбенту Стиросорб и высказано предположение о механизме сорбции. Результаты исследования положены в основу выделения и фракционирования фосфолипидов из масла семян амаранта. Приоритетность данного исследования подтверждена патентом на изобретение № 2169734 РФ по заявке № 99125174 от 30.11.1999.
Разработаны методики количественного определения фосфолипидов, в основе которых лежат современные физико-химические методы анализа, такие как хроматография в тонком слое сорбенте, высоковольтный электрофорез, спектрофотометрия в УФ-области. По разработанным методикам в масле, полученном из семян амаранта, впервые установлен качественный и количественный состав фосфолипидного комплекса.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
Найден новый перспективный источник получения ценных биологически-активных веществ, обладающих гепатопротекторным, иммуномоделирующим и противоожоговым действием.
Определены физико-химические показатели качества масла семян амаранта.
Показана возможность использования сорбционных методов для выделения и фракционирования фосфолипидов с помощью сорбентов различной природы. Изучен механизм сорбции фосфолипидов ионогенными и неионогенными сорбентами. Результаты исследования позволили усовершенствовать метод выделения и фракционирования фосфолипидов из масла семян амаранта
Разработаны новые методики идентификации и количественного определения биологически-активных компонентов масла семян амаранта -фосфолипидов с помощью современных физико-химических методов.
Проведена сравнительная оценка хроматографических, спектральных и электрохимических методов анализа, позволяющих вести контроль за содержанием фосфолипидов в различных растительных объектах.
Разработанные способы фракционирования и методики анализа фосфолипидов могут быть использованы на фармацевтических и пищевых предприятиях для получения лечебно-профилактических препаратов и их стандартизации.
ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИКУ
Проведено внедрение разработанных методик выделения, идентификации и количественного определения фосфолипидов в растительных маслах в ЗАО «Инновационные системы ОКБМ» г.Воронежа (акт о внедрении от 25.05.2004); при проведении учебных и научно-исследовательских работ на кафедре органической химии и в «Лаборатории инструментальных методов пищевой химии» Воронежской Государственной Технологической Академии (Акт о внедрении от 24,03,2003 г.), а также на Фармацевтическом факультете Воронежского Госуниверситета (Акт № 5 от 17.0.1..2002).
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫДВИГАЕМЫЕ НА ЗАЩИТУ
- результаты определения основных физико-химических показателей качества амарантового масла;
- данные по составу высших жирных кислот в липидной фракции масла семян амаранта;
- методики сорбционного выделения фосфолипидов из фосфолипидного комплекса;
- методика разделения и идентификации фосфолипидов методом зонального высоковольтного электрофореза;
- выбор оптимальных параметров для разделения фосфолипидов в тонком слое сорбента и разработанная на основе этих данных методика количественного определения фосфолипидов;
- изучение качественного и количественного состава фосфолипидов масла семян амаранта.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ
Основные результаты исследования доложены на:
- Всероссийской конференции «Химический анализ веществ и материалов» (г. Москва, 2000 г);
- IV Международном симпозиуме "Новые нетрадиционные растения и перспективы их использования" (г. Москва, 2001 г);
- IX и X Российском национальном конгрессах "Человек и лекарство" (г. Москва, 2002,2003 гг);
- IX Международной конференции по теоретическим вопросам адсорбции и адсорбционной хроматографии (г. Москва, 2002 г );
- Всероссийском симпозиуме «Современные проблемы хроматографии» (г. Москва, 2002 г);
- Всероссийской конференции «Фагран-2002» (г. Воронеж).
ГОП5ЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 18 работ, в том числе 7 статей, 10 тезисов, 1 патент.
Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста, содержит 22 рисунка, 27 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, общих выводов, библиографического указателя, включающего 186 источников и Приложений.
Методы определения фосфолипидов в растительном сырье и фармпрепаратах
Классический метод определения фосфолипидов — гравиметрия [56]. В настоящее время этот метод широко используется в аналитической практике фосфолипидов и рекомендован ГОСТ [41] для определения массовой доли фосфорсодержащих веществ в нерафинированных, гидратационных и рафинированных маслах. Сущность метода заключается в сухом сжигании навески масла с оксидом магния (адсорбент) при температуре 800-1000 С и последующем определении фосфорсодержащих веществ весовым методом в пересчете на Р2О5. К недостаткам этого метода следует отнести прежде всего то, что он не дает информации о фосфолипидном составе липидного комплекса масла. Кроме того, метод является длительным и трудоемким.
Оптические методы анализа, как показала практика, являются весьма полезными при идентификации фосфолипидов и в настоящее время они широко применяются при изучении этого класса веществ.
Функциональные группы фосфолипидов, содержащие атомы с неподеленной электронной парой (карбонильные и аминогруппы), двойные связи, сопряженные двойные связи, сильно поглощают в УФ-области спектра. В связи с этим, для идентификации фосфолипидов можно использовать метод спектрофотометрии в ультрафиолетовой и видимой областях спектра [55].
Максимумы поглощения некоторых хромофорных групп в УФ-спектрах фосфолипидов приведены в [55, 148]. Однако, следует отметить, что в ультрафиолетовой области спектра поглощают функциональные группы, входящие в состав практически всех фосфолипидов (сложноэфирная, фосфатная, аминогруппы, двойные связи ненасыщенных жирных кислот).. Поэтому использование метода прямой спектрофотометрии в УФ-области возможно только после предварительного разделения фосфолипидного комплекса на индивидуальные фосфолипиды и совершенно недопустимо при идентификации и количественном определении их суммы.
Одним из способов, позволяющих повысить селективность спектрофотометрических методик и избежать постороннего влияния ряда факторов на результаты количественного определения, является получение специфически окрашенных соединений на основе химических реакций. Алленом [156] предложена фотоколориметрическая методика определения суммы фосфолипидов, которая по сути является сочетанием гравиметрического метода со спектрофотометрическим окончанием. Эта модифицированная методика легла в основу ГОСТа по определению массовой доли фосфорсодержащих веществ в растительных маслах фотоколориметрическим методом [41]. Подготовка пробы масла проводится аналогично способу, описанному в гравиметрической методике. После проведения минерализации оксид магния удаляют растворением остатка в серной кислоте. Затем к очищенному минерализату добавляют молибденовый реагент (раствор молибдата аммония и гидразинсульфата в воде) и измеряют оптическую плотность анализируемых растворов в области 630-750 нм. Массовую долю фосфорсодержащих веществ в анализируемом образце рассчитывают по градуировочному графику.
Модифицированный микрометод Бартлера [159] также основан на фотоколориметрическом определении суммы фосфолипидов после обработки минерализата амидоловым реагентом (раствор дихлоргидрата 2,4-диаминофенола в 20 % растворе бисульфита натрия) при 830 нм.
В работе [185] сообщается о возможности определения фосфолипидов по их способности образовывать гидрофобные комплексы с ферротиоцианатом аммония. Достоинством метода является то, что определяют фосфолипиды как таковые, а не их составные части. В работе показано, что молярные коэффициенты экстинкции комплекса фосфолипид-ферротиоцианат для разных классов фосфолипидов близки между собой. Предложенный метод отличается высокой специфичностью и воспроизволдимостью. Вся процедура определения фосфолипидов (без их экстракции) занимает 10 мин.
Авторы работы [100] предлагают упрощенный вариант методики [185] определения фосфолипидов путем объединения процедуры экстракции липидов и их определения. Для экстракции липидов к биологическому материалу добавляют смесь хлороформ-метанол (1:4) из расчета 20 объемов смеси на 1 объем биоматериала. Затем смесь выпаривают на водяной бане досуха, сухой остаток растворяют в хлороформе и добавляют ферротиоцианат аммония. Пробы фотометрируют и рассчитывают содержание фосфолипидов по градуировочному графику.
Таким образом, спектрофотометрия в УФ-области позволяет проводить идентификацию и количественное определение фосфолипидов только после их предварительного отделения от других компонентов. В видимой области спектрофотометрирование проводится только после получения специфически окрашенных производных фосфолипидов путем химических реакций.
Характеристика сорбентов и методика их подготовки для фракционирования фосфолипидов
Неионогенный макропористый сорбент Стиросорб (1-МХДЭхЮО) представляет собой полистирольные сетки, которые по своей химической природе близки к сополимерам стирола и дивинилбензола, но обладающие принципиально иной структурой и поэтому называются сверхсшитыми. Их получают сшиванием цепей полистирола бифункциональными соединениями, образующими в конечной сетке мостики жесткой структуры. В качестве сшивающих агентов используют 4,4-бисхлор-метил-дифенил, ксилендихлорид или монохлордиметиловый эфир. При этом между полистерольными цепями образуются мостики [138]. Структурное звено сорбента представлено на рис. 2.1.
При содержании сшивающих мостиков более 40 % сетки получают название "сверхсшитые" полимеры. Сверхсшитые полимеры стирола в сухом состоянии обладают пониженной плотностью и резко выраженной способностью увеличивать свой объем до набухшего состояния, в котором была сформирована трехмерная сетка полимера. Поэтому сверхсшитый полистирол интенсивно поглощает органические вещества из паровой фазы и водных растворов, увеличивая объем и проявляя высокую сорбционную емкость, намного превышающую емкость известных органических сорбентов. Степень сшивки сорбента Стиросорб составляет 100 %, а это означает, что каждое бензольное кольцо полистирольной цепи вовлечено в образование сшивающего мостика. Внутренняя удельная поверхность этого сорбента составляет 440 м /г.
Для проведения исследования из товарного сорбента выделяли рабочую фракцию с диаметром гранул 0,5-1,0 мм ситовым способом, затем заливали сорбент 96 % этиловым спиртом и выдерживали 10-15 мин до набухания. Когда сорбент перестал увеличиваться в объеме, его трижды промывали этанолом. Степень отмывки контролировали спектрофотометрически на приборе СФ-46 при длине волны 210 нм. Подготовленный таким образом сорбент хранили под слоем спирта в набухшем состоянии.
Анионит АВ-17-2П имеет пористую структуру. В качестве ионогенных групп выступают четвертичные аминогруппы - NHV Строение элементарного звена анионита представлено на рис. 2.2.
Анионит получается сополимеризацией стирола и дивинилбензола с последующим хлорметилированием и аминированием триметиламином. Анионит является сильноосновным монофункциональным ионитом полимеризационного типа, химически и термостоек, механически прочен. Пористость достигается введением порообразователя при полимеризации с дальнейшим его вымыванием органическими растворителями. Размер пор анионита составляет 500-2500 А0, а удельная поверхность сорбента - 30-300 м /г. Пористая структура способствует хорошим сорбционным характеристикам по крупным органическим молекулам [123].
Подготовку анионита к работе проводили по известной методике [125]. Поскольку все работы проводились со спиртовыми растворами фосфолипидов, анионит дополнительно отмывали 96-% этанолом.
Катионит КРС представляет собой продукт сульфирования сополимера стирола с дивинилбензолом. Содержание дивинилбензола составляет 2 %. Это сильнокислотный макропористый катионит [74]. Строение элементарного звена представлено на рис. 2.3.
Количественное определение фосфолипидов методом УФ-спектрофотометрии
Изучение процессов сорбции ФХ на сорбентах различной природы было невозможным без отработки методики его количественного определения.
Наличие в молекулах фосфолипидов функциональных групп, содержащих неподеленные электронные пары (карбонильные и фосфатные), аминогруппы, а также двойные и сопряженные двойные связи, позволило высказать предположение о возможности их определения спектральными методами, в частности, УФ-спектрофотометрией.
Анализ данных литературы показал, что поглощение в ультрафиолетовой и видимой областях спектра обусловлено возбуждением валентных электронов и переходом их на более высокие энергетические уровни [55]. Сопряженная линолевая кислота в этаноле дает характеристический максимум поглощения в области 231 нм, а сопряженная линоленовая кислота - три максимума при 258, 268 и 279 нм. Основание холина в том же растворителе имеет максимум поглощения в диапазоне 202 210 нм. Следует заметить, что значение Xmwi может меняться в зависимости от применяемого растворителя.
Кроме того, следует учитывать тот факт, что спектрофотометрическая методика в УФ-области не является специфичной, поскольку в используемом диапазоне длин волн поглощают те функциональные фрагменты и группы, которые входят в состав практически всех фосфолипидов. Поэтому для анализа фосфолипидного комплекса необходимо проводить предварительное фракционирование фосфолипидов. Использование метода прямой спектрофотометрии в количественном анализе допустимо только для индивидуальных веществ.
Поскольку изучение процессов сорбции на сорбентах различной природы проводилось на фосфатидилхолине, содержание которого доминирует в фосфолипидном комплексе любого растительного масла, нами была разработана спектрофотометрическая методика количественного определения фосфатидилхолина (ФХ) в УФ-области.
Изучение спектральных характеристик ФХ в спиртовом растворе. Обзорные спектры ФХ в ультрафиолетовой области снимали на спектрофотометре СФ-56. ФХ не растворим в воде, растворим в этиловом спирте, хлороформе и эфире. Анализ УФ спектров названных растворителей показал, что все они также поглощают в УФ-области, но наиболее оптимальным растворителем для этих целей с учетом наименьшей интенсивности поглощения, токсичности и летучести оказался этанол. Поэтому стандартные растворы ФХ для спектрофотометрических определений готовили с использованием именно этого растворителя.
УФ-спектр стандартного раствора ФХ в этаноле с концентрацией 2 мг/см представлен на рис. 3.6. Как видно на рисунке максимум поглощения спиртового раствора ФХ составляет 202 нм. Построение градуировочной зависимости оптической плотности от концентрации ФХ в спиртовом растворе. Градуировочная зависимость, построенная на основании результатов измерения оптической плотности стандартных растворов ФХ, представлена на рис. 3.7. Предел обнаружения ФХ в спиртовом растворе данным методом составляет 1 мг/см3. Подчинение закону Бугера-Ламберта-Бера наблюдается в диапазоне концентраций 2-20 мг/см . Растворы с большей концентрацией перед определением необходимо разбавлять. Для облегчения перехода от оптической плотности растворов к их концентрации нами был рассчитан градуировочный коэффициент, который имеет размерность мг/см и представляет собой концентрацию раствора ФХ при оптической плотности А=1. Значение градуировочного коэффициента составило 0,45 мг/см3. Изучение влияния рН растворителя на спектральные характеристики ФХ. Как уже упоминалось выше, фосфатидилхолин, имея в молекуле положительно заряженную аминогруппу и отрицательно заряженную фосфатную группу, при различных значениях рН может существовать в различных ионных формах. В связи с этим нами было проведено изучение влияния рН на спектральные характеристики спиртовых растворов ФХ. Для этого раствор ФХ в этаноле с концентрацией 2 мг/ см3 подкисляли 2 М раствором хлороводородной кислоты до величины рН, равной 1,5; 2,5 и подщелачивали 2 М раствором гидрооксида натрия до рН, равной 8,0; 9,0. Установление величины рН проводилось потенциометрическим методом. УФ-спектры спиртовых растворов ФХ при различных значениях рН показаны на рис. 3.8. Анализ УФ-спектров рис. 3.8 показал, что ни в кислой, ни в щелочной среде смещения максимума поглощения на кривой не наблюдается. Следовательно, величина рН раствора ФХ в этиловом спирте не влияет на величину
Определение состава жирных кислот липидной фракции масла
Жирные растительные масла, полученные из семян и мякоти плодов лекарственных растений, содержат 95-97 % смеси триглицеридов высших насыщенных и ненасыщенных жирных кислот и небольшие количества свободных жирных кислот [107].
Высыхающие растительные масла, например, льняное, конопляное -содержат главным образом триглицериды кислот с двумя и тремя двойными связями (линолевой, линоленовой, элеостериновой); полувысыхающие, например, подсолнечное, соевое, маковое — триглицериды кислот с одной и двумя двойными связями (олеиновой, линолевой); невысыхающий, например, кокосовое, пальмовое, - преимущественно триглицериды насыщенных кислот (лауриновой, пальмитиновой, стеариновой) и мононенасыщенной олеиновой. Кроме того наличие и соотношение насыщенных и ненасыщенных жирных кислот существенным образом влияет на фармакологическую активность масла [14].
С этой точки зрения представляется весьма интересным и полезным изучение жирнокислотного состава липидов масла семян амаранта.
Жирные кислоты в растительных маслах существуют в виде триглицеридов жирных кислот и их определение в нативном виде не представляется возможным. Поэтому предварительно проводится переведение триглицеридов кислот в метиловые (этиловые) эфиры жирных кислот с последующим газохроматографическим анализом.
Определение состава жирных кислот липидов масла семян амаранта проводили по методике, описанной в п. 2.5. Хроматограмма метиловых эфиров жирных кислот приведена на рис. 4.1. Идентификационные характеристики и массовые доли жирных кислот в изучаемых объектах представлены в табл. 4.2.
Состав жирных кислот, приведенных в табл. 4.2. показывает идентичность масла семян амаранта растительным маслам линолевой серии (группа 7), но с высокой долей пальмитиновой и олеиновой кислот. Преобладание линолевой кислоты позволяет отнести данное масло к серии полувысыхающих растительных масел, что хорошо согласуется с величиной йодного числа (п. 4.1). Значительно увеличен по сравнению с нормативными данными уровень насыщенных жирных кислот [40].
В результате установлено, что в масле семян амаранта в большем количестве (около 75 %) содержатся ненасыщенные жирные кислоты, в том числе незаменимые (эссенциальные) — линолевая и линоленовая.
Липиды — жироподобные вещества, производные высших жирных кислот, спиртов или альдегидов. Липидная фракция растительных масел включает в себя свободные жирные кислоты, глицериды жирных кислот, воски, фосфолипиды, токоферолы, углеводороды и др.
Изучение липидного состава масла проводили методом ТСХ в следующих условиях: элюирующие системы №1 (петролейный эфир-диэтиловый эфир-уксусная кислота в соотношении 45:5:1) и №2 (и хлороформ, метанол вода в соотношении 40:15:1); хроматографическая пластина марки "Сорбфил" размером 10x10; стандартные растворы липидов фирмы Сигма; время элюирования 60 мин; объем наносимой пробы 5, 10 мкл; детектирование пластин осуществляли 5 % спиртовым раствором ФМК. Идентификацию липидов проводили по величине Rf. Полученные экспериментально величины сравнивали с литературными данными. Проверку воспроизводимости методики, описанной в работе [56] проводили на стандартных растворах а-токоферола и метилового эфира стеариновой кислоты. Совпадение величин Rf, полученных экспериментально (0,20 для токоферола и 0,67 метилового эфира стеариновой кислоты) с аналогичными величинами, приведенными в работе [56] (0,19 и 0,65 соответственно), позволило проводить идентификацию липидных фракций данным способом. Количественную оценку липидной фракции проводили методом внутренней нормализации.
