Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Ботанико-фармакогстическое описание, химический состав и применение видов рода щирица 11
1.1. Таксономия рода Amaranthus L 11
1.2. Некоторые ботанико-физиологические особенности рода 13
1.3. Ботаническая характеристика амаранта печального (щирицы угрюмой). 16
1.4. Химический состав видов рода амарант 18
1.5. Способы получения и анализ компонентного состава амарантового масла 29
1.6. Методы анализа жирнокислотного состава 31
1.7. Особенности медицинского применения жирных масел 33
1.8. Некоторые хозяйственные аспекты использования видов амаранта 35
Выводы по главе 1 37
Глава 2. Материалы и методы исследования 38
2.1. Характеристика объектов исследования 38
2.2. Методы фармакогностического анализа 41
2.3. Методы фитохимического исследования 42
2.4. Методы хромато-масс-спектрометрии 46
2.5. Физико-химическое исследование жирного масла 48
2.5.1. Определение физико-химических показателей 48
2.5.2. Изучение жирнокислотного состава масла методом ВЭЖХ 49
2.5.3. Исследование жирного масла методом хромато-масс-спекрометрии .49
2.5.4 Определение а-токоферола в жирных маслах методом ТСХ 50
2.5.5. Определение фосфолипидов в жирных маслах методом ТСХ 50
2.6. Методы экспериментальных исследований фармакологической активности амарантового масла 51
2.6.1. Раздражающее действие 51
2.6.2. Острая токсичность 52
2.6.3. Хроническая токсичность 53
2.6.4. Гипохолестеринемическое действие 54
2.6.5 Определение содержания азота оксида в сыворотке крови 57
2.6.6. Антибактериальная активность 58
2.6.7. Противоожоговая активность 59
2.7. Методы статистической обработки данных 60
Глава 3. Изучение химического состава семян различных сортов амаранта печального и их шрота 61
3.1. Элементный состав 61
3.2. Углеводы и их производные 68
3.3. Аминокислоты 73
3.4. Липофильные вещества 81
3.5. Органические и оксикоричные кислоты 84
Выводы по главе 3 89
Глава 4. Физико-химическое исследование амарантового масла 91
4.1. Определение масличности семян 91
4.2. Показатели качества амарантового масла 92
4.3. ВЭЖХ - анализ жирнокислотного состава 99
4.4. ХМС - анализ липидной фракции 101
4.5. ТСХ - анализ токоферолов 106
4.6. ТСХ-анализ фосфолипидов 109
4.7. Определение стабильности и сроков хранения 114
4.8. Оценка практического использования амарантового масла 116
Выводы по главе 4 117
Глава 5. Разработка нормативной документации на семена амаранта печального 119
5.1. Состояние проблемы стандартизации 119
5.2. Морфолого - анатомическое изучение 120
5.3. Гистохимическое исследование 125
5.4. Товароведческий анализ 126
Выводы по главе 5 128
Глава 6. Определение токсичности и отдельных фармакологических свойств амарантового масла 129
6.1. Раздражающее действие 129
6.2. Острая токсичность 130
6.3. Хроническая токсичность 131
6.4. Гипохолестеринемическое действие 138
6.5. Определение азота оксида в сыворотке крови 142
6.6. Антибактериальная активность 145
6.7. Противоожоговое действие 146
Выводы по главе 6 148
Общие выводы 150
Список литературы 152
Приложения 176
- Химический состав видов рода амарант
- Элементный состав
- ТСХ-анализ фосфолипидов
- Гипохолестеринемическое действие
Введение к работе
Актуальность темы. Поиск растительных источников, содержащих различные биологически активные вещества и имеющих надежную сырьевую базу, является социально и экономически значимым направлением фармации.
Исследования видов рода Щирица (Амарант) свидетельствуют о том, что в них содержится уникальный сбалансированный комплекс БАВ (углеводы, белки, жирные кислоты, фосфолипиды, токоферолы). Отдельные представители рода достаточно изучены для нужд пищевой технологии (Е. Н. Офицеров, В. И. Костин, 1999; И. М. Магомедов, 2002.; Е. Г. Иоргачева, 2002;), в области селекции и интродукции (И. А. Чернов, 1992; П. Ф. Кононков, В. К. Гинс, М. С. Гинс, 2001; Т. И. Гопций, 2001; О. И. Криворученко, А.В. Железнов, Н. В. Бурмакина, 2009), биологии (Л. А. Мирошниченко, 2008). Вместе с тем они не являлись объектом углублённого фитохимического исследования для выявления возможностей их медицинского использования.
Семена различных сортов (Воронежский, Кизлярец, Кинельский, Крепыш, Янтарь) амаранта печального (A. hypochondriacus L.), интенсивно культивируемых в России, в том числе в Центральном федеральном округе, заслуживают внимания в качестве потенциального лекарственного растительного сырья, богатого природными БАВ, в частности, самым высококачественным растительным белком. Вместе с тем до настоящего времени в достаточной мере не изучено их качественное и количественное содержание, не исследован элементный состав, не определены физико-химические характеристики сырья и продуктов его переработки, в том числе жирного масла, реализуемого в качестве пищевой добавки. В связи с чем фармакогностическое изучение семян пяти сортов амаранта печального представляется весьма актуальным.
Цель и задачи исследования
Целью работы явился сравнительный анализ природных соединений 5 сортов амаранта печального с использованием современных методов, разработка нормативной документации на них и на мазь с амарантовым маслом.
Для достижения поставленной цели следовало решить следующие задачи:
провести изучение веществ первичного (углеводы, аминокислоты, жирные кислоты, витамины) и вторичного обмена (терпены, стерины, фенольные соединения, органические кислоты) 5 сортов амаранта печального;
сравнить элементный состав анализируемых образцов до и после экстракции жирного масла и оценить их экологическую чистоту;
определить масличность и компонентный состав жирного масла семян различных сортов амаранта и установить показатели его качества;
выявить характерные морфолого-анатомические признаки и провести определение товароведческих показателей семян пяти сортов;
предпринять изучение ряда фармакологических свойств масла амаранта;
разработать фармацевтическую модель мази с амарантовым маслом для наружного применения и оценить ее технологические и фармакологические свойства;
составить проекты ФСП на семена и мазь с маслом амаранта.
Научная новизна. С использованием современных физико-химических методов исследования (хромато-масс-спектрометрия (ГХ/МС), масс-спектрометрия (МС) с индуктивно связанной плазмой, капиллярный электрофорез, УФ-спектрофотометрия, ВЭЖХ и др.) впервые проведено сравнительное фитохимическое изучение семян амаранта печального. При этом в ходе их стандартизации выявлены микродиагностические признаки и дано описание внешних признаков. Наряду с этим показана перспективность использования семян амаранта как важного природного комплекса различных БАВ (углеводов, белков, отличительным признаком которых является значительное количество лизина, жирного масла с высоким содержанием эссенциальных жирных линолевой и линоленовой кислот, сквалена, фосфолипидов (фосфатидилхолина), стеринов, токоферолов и органических кислот).
Методом МС впервые определен 61 элемент в семенах 5 сортов амаранта печального, которые имеют определенное значение в экологическом, токсикологическом, медицинском и хемотаксономическом аспектах.
С использованием метода ГХ/МС впервые проанализирован состав этанольного извлечения из семян и шрота амаранта печального, в результате которого идентифицировано 67 соединений, из которых 57 до и 60 после экстракции жирного масла гексаном с пищевым нефрасом.
Методом ВЭЖХ определено содержание жирных кислот, фосфолипидов и сквалена в жирных маслах, полученных из анализируемого сырья.
Для качественного и количественного определения токоферолов и фосфолипидов в жирном масле семян амаранта адаптирован метод ТСХ.
Проведено изучение раздражающего действия, острой и хронической токсичности, исследовано гипохолестеринемическое действие и бактерицидная активность жирного масла из семян амаранта печального.
Практическая значимость. Результаты проведенных исследований положены в основу проектов ФСП «Амаранта семена» и «Мазь с маслом амаранта». Данные по товароведческому анализу семян амаранта печального использованы при разработке ТУ 9719-003-77872064-2011 «Зерно амаранта», введенных 24.10.2011, ООО «Русская олива».
Методики качественного и количественного анализа отдельных групп БАВ семян различных сортов амаранта внедрены в учебный процесс кафедры фармацевтической химии и клинической фармации ГБОУ ВПО «Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н. Бурденко» (акт о внедрении от 19.03.12 г.), кафедры фармацевтической химии и фармацевтической технологии ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет» (акт о внедрении от 04.05.12 г.), кафедры фармакогнозии и фармацевтической технологии ГБОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия» (акт о внедрении от 23.01.12 г.).
Впервые на доклиническом этапе исследований обоснована целесообразность использования амарантового масла в качестве гипохолестеринемического и противоожогового средства, что позволяет в известной мере реализовать возможность применения семян амаранта печального в медицине.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Данные сравнительного изучения веществ первичного и вторичного обмена пяти сортов амаранта печального.
-
Итоги определения элементного состава и оценки экологической чистоты анализируемого сырья до и после экстракции жирного масла.
-
Результаты изучения компонентного состава экстракционного амарантового масла и обоснования возможностей его применения в медицине.
-
Характеристика морфолого-анатомических признаков семян амаранта печального и их товароведческих показателей.
-
Особенности фармакологического действия амарантового масла.
-
Результаты исследования фармацевтической модели мази с маслом амаранта.
-
Разработанные нормативные документы - проекты ФСП «Амаранта семена» и «Мазь с маслом амаранта».
Апробация и публикация результатов исследования
Основные результаты исследований доложены и обобщены на следующих межрегиональных и международных научно-методических конференциях: «Пути и формы совершенствования фармацевтического образования» (ВГУ, Воронеж 2003, 2005, 2007, 2010 гг.), «Проблемы здоровьесбережения школьников и студентов. Новые научные тенденции в медицине и фармации» (ВГУ, Воронеж 2008, 2011), «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (ПГФА, Пятигорск 2010, 2011, 2012), «Науково-технiчний прогрес i оптимiзацiя технологiчних процесiв створення лiкарських препаратiв» (ТДМУ, Тернопiль 2011); «Moderni vymozenosti vedy» (Praha, 2012); «Бъдещите изследвания» (София, 2012); «Europejska nauka XXI powieka – 2012» (Przemysl)» (2012), на научных конференциях студентов и молодых учёных ГБОУ ВПО ЯГМА (2010 – 2012), на ежегодных научных сессиях ФГБОУ ВПО ВГУ в период 2005–2012 гг.
Связь задач исследований с проблемным планом. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ФГБОУ ВПО ВГУ (код по ГРНТИ: 31.23). Тема диссертационной работы утверждена на заседании Ученого совета фармацевтического факультета ВГУ (протокол № 09 от 27.10.05 г.).
Личный вклад автора. Автор непосредственно участвовал в проведении научных экспериментов, обработке и интерпретации экспериментальных данных по изучению элементного, углеводного, аминокислотного, липидного и фенольного состава семян 5 сортов амаранта печального, в проведении сравнительной характеристики их микродиагностических признаков, в исследовании отдельных фармакологических свойств амарантового масла, в апробации результатов исследования, в составлении 2 проектов ФСП и подготовке публикаций по выполненной работе.
Публикации материалов исследования. По теме диссертации опубликованы 42 научные работы, из них 10 в журналах, в том числе 8 в изданиях, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 175 страницах текста компьютерной верстки и состоит из «Введения», «Обзора литературы» (1 глава), «Экспериментальной части» (5 глав), выводов, списка литературы, включающего 244 источника, в том числе 46 на иностранных языках, и приложений. Диссертация содержит 51 таблицу, 31 рисунок, в том числе 15 фотографий.
Во введении раскрыта актуальность темы, определены цель и задачи исследования, сформулирована научная новизна и практическая значимость работы. В первой главе обобщены данные литературы по ботанической характеристике и химическому составу видов рода щирица (Amaranthus) семейства амарантовые (Amaranthaceae), их применению в медицине, а также дана характеристика, классификация, физико-химические свойства и методы анализа жирных масел. Вторая глава посвящена материалам и методам исследования. Третья глава включает результаты определения элементного состава и исследования веществ первичного и вторичного обмена 5 сортов семян амаранта печального. В четвертой главе отражены результаты изучения амарантового масла и характеристика его качества. Пятая глава содержит данные по стандартизации семян амаранта печального. В шестой главе приведены результаты по исследованию раздражающего действия, определению острой и хронической токсичности, по изучению противомикробного и гипохолестеринемического действия амарантового масла. Приложения включают отдельные масс-спектры идентифицированных веществ, проекты фармакопейных статей, приведены результаты по исследованию фармацевтической модели мази с маслом амаранта, а также материалы, подтверждающие практическую значимость проведенных исследований.
Химический состав видов рода амарант
Виды рода щирица (амарант) на 50-80 % съедобны [237]. Одной из их специфических особенностей является значительное количество белков (13 -19%). Оно больше, чем в зерне традиционных злаковых культур, в частности пшеницы, ржи, кукурузы, риса [223, 226, 233, 235]. Если принять пищевую ценность идеального белка за 100 условных единиц, то белок коровьего молока оценен в 72, сои -68, пшеницы - 57, а семян амаранта в 87 единиц [110].
Бекером с соавт. [202] с помощью анатомического препарирования и перемалывания установлено, что 65 % белка в Amaranthus cruentus L. находилось в зародыше и семенной оболочке, а 35 % - в крахмалистом перисперме.
Исследования распределения белковых фракций в семени не выявили различий в их распределении между видами и сортами амаранта независимо от последовательности фракционирования [206]. Альбумины в среднем составили 20,7 %, глобулины - 19,2 %, проламины - 2,2 %, глютелины - 46,5 %. При этом фракция альбуминов была представлена в основном: триптофаном, треонином и лизином; фракция глобулинов - серосодержащими аминокислотами и лизином; проламина — треонином и лейцином, а глютелины - триптофаном и лейцином. По другим данным [216] при экстракции и фракционировании белка пяти различных видов амаранта обнаружено, что в среднем он состоял из 65 % альбумина, 17 % глобулина, 11 % проламина и 7 % глютелина.
Изучение запасных глобулинов семян амаранта печального сорта К 343 показало, что они представляли собой двенадцатиугольники, которые состояли из двух кольцеобразных шестигранников, расположенных параллельно друг другу [229].
Из различий аминокислотного состава белков зерновых культур и амаранта, содержащего в большом количестве лизин, треонин, валип, следует возможность повышения их биологической ценности в результате смешивания и совместного потребления белков, дополняющих друг друга по аминокислотному составу [187, 200]. Белок семян амаранта в смеси с другими зерновыми культурами может стать ценным пищевым продуктом в рационе питания, покрывающим дефицит белка и повышающим физиологическую и питательную ценность за счет взаимного обогащения белков.
Следует отметить, что белки амаранта имеют наиболее сбалансированный аминокислотный состав. Он представлен заменимыми (аспарагиновая кислота, аденин, гуанин, аргенин, глутаминовая кислота, гистамин, пролин, серии, тирозин, серотонин, орнитин, пантетоновая кислота, их производными, такими как пуриновые основания, гистамин, пируват, тиазол) и незаменимыми аминокислотами (валин, гистидин, изолейцин, лизин, метионин, лейцин, фенилаланин, триптофан, треонин). Причем в 100 г белка семян амаранта содержится 6,2 г лизина, то есть в таком количестве он не выявлен ни в одном другом растении. Содержание этой аминокислоты превосходит в 2 раза таковое у пшеницы [22]. По содержанию треонина, фенилаланина, тирозина и триптофана белки амаранта приравниваются к белкам женского молока [236, 242].
Соотношение десяти незаменимых для человека аминокислот, содержащихся в белке амаранта, имеет наибольшее совпадение с теоретически рассчитанным идеальным белком ФАО/ВОЗ (табл. 1.4.1).
A.M. Макеев с соавт. [110] отмечал, что в выделенных белково-липидно-крахмальных комплексах методом солевой экстракции осаждением в изоэлектрической точке содержание белка в светлых семенах составило в среднем 32,68 %.
При сравнительном анализе биохимического состава листьев амаранта выявлено высокое содержание протеина, особенно в фазу бутонизации (4,94-7,58 %), а также в период массового цветения [54]. Проросшее семя также характеризуется увеличением количества аминокислот, особенно лизина.
Амарант, как высокобелковая культура, довольно востребован, что в известной мере объясняется значительным дефицитом кормового и пищевого белка [188]. Протеиновая питательность зерна, используемого на фуражные и пищевые цели, обусловлена его аминокислотным составом. По данным И.М. Камышевой и сотрудников [75], в абсолютно сухих семенах амаранта может содержаться от 14 до 21% протеина. Кроме того, отмечалось, что зерно низкопротеиновых сортов амаранта имело аминокислотный состав протеина более близкий к составу зерна сои. При этом наиболее сбалансированным по кислотному составу являлся протеин, полученный из A. caudatus L. и А. hypochondriacus Ь.,что позволило включить их в селекционный процесс по выведению сортов зернового направления [158].
Особое внимание обращено на то, что семена амаранта содержат легко усваиваемые пищевые волокна. Содержание клетчатки в них находится в пределах 3,7-5,7 %. По содержанию пищевых волокон они превосходят пшеницу в 3 раза, кукурузу, рис, овес в 1,5 раза [192]. Известно, что пищевые волокна (клетчатка, пектин, гемицеллюлоза) уменьшают калорийность рациона, снижают отрицательное воздействие на обменные процессы потребляемых в избытке жиров и углеводов.
Содержание влаги, белка и жирного масла в некоторых видах амаранта приведено в таблице 1.4.2.
И.М. Камышевой [77] проведено изучение влияния окраски, сорта, видовой принадлежности семян амаранта на содержание клетчатки и установлено, что ее массовая доля в светлоокрашенных семенах колебалась от 3,9 до 4,9 %, а в темноокрашенных - от 14,3 % до 16,5 %. Суммарное количество водорастворимых углеводов в исследуемых образцах составляло 2,75 % - 4,0 %.
В семенах разных видов амаранта содержалось от 55 до 62 % крахмала, гранулы которого мелкие - 0,8-2,5 мкм (у картофеля 15-100 мкм) [201].
Для крахмала амаранта из-за малого размера гранул характерна повышенная набухаемость при низкой растворимости и пониженное субстратное сродство к ферменту а-амилазе [130]. Его семена содержат крахмал с зернами восковидного типа, с малым содержанием линейной амилозы (по сравнению с крахмалом пшеничной и ржаной муки). Он характеризуется высокой вязкостью и желатинизацией при высоких температурах [200]. Отмеченные особенности замедляют процесс черствения хлеба при использовании амарантовой муки в хлебопечении. Автолитическая активность семян амаранта также меньше, чем у пшеничной и ржаной муки, так как их крахмальные зерна имеют более плотную микрокристаллическую структуру и высокую температуру клейстеризации, препятствующих действию амилолитических ферментов [184].
Наряду с этим в крахмале семян амаранта обнаружены отдельные гранулы, в которых содержание амилозы превышало 1 %. Так, среднее содержание амилозы в крахмале A. retrqflexus L. составляло 4,9 %, а содержание амилозы в крахмале, полученной из Л. hypochondriacus L., равнялось 7,2 %.
Соотношение содержания амилозы и амилопектина является главной различительной составляющей гранул амарантового крахмала между различными разновидностями и в пределах генетически наследственных признаков тех же самых разновидностей.
Молекула амилозы представляет собой линейный полимер, состоящий из a-D-глюкопиранозных фрагментов, связанных между собой а (1—» 4) связями. Степень полимеризации составляет от 500 до 2000 глюкозидных остатков. Амилопектин в отличие от амилозы - разветвленный компонент крахмала, образованный цепями a-D-глюкопиранозиых остатков (длина от 17 до 25 единиц), соединенных между собой a (1—»6) связями [130, 208].
Элементный состав
Изучение элементного состав растений представляет научный интерес в связи с тем, что, во-первых, токсические вещества в настоящее время являются одним из основных загрязнителей окружающей среды. Определение элементного состава анализируемого сырья позволяет получить представление о его безопасности и предоставляет определенный срез экологического состояния региона возделывания данной культуры. Во-вторых, в организме человека существует относительно постоянное содержание элементов, примерно около 70. Доказана биогенность более 30 из них. Они являются незаменимыми нутриентами, не синтезируемыми в организме, значение которых сравнимо со значением витаминов. В случае содержания в сырье, используемом для получения одной дозы препарата, биогенных элементов в количестве сопоставимых с суточной потребностью организма, учитывается их биологическая активность [116, 126, 157].
Для исследования элементного состава нами использовано 5 сортов семян амаранта печального: Воронежский, Кинельский, Крепыш, Янтарь и Кизлярец, интенсивно культивируемых в Воронежской, Белгородской и Липецкой областях. Пробоподготовка и масс-спектрометрический анализ проведены согласно изложенным ранее методикам в глава 2 (п. 2.4.).
В результате исследований семян и шрота семян после экстракции жирного масла во всех образцах определено 7 макро- (А1, Са, К, Mg, Na, Р, Si), 54 микро- и ультрамикроэлемента (Ag, As, Au, В, Ва, Be, Bi, Br, Се, Cd, Co, Cs, Cr, Cu, Dy, Er, Eu, Fe, Ga, Gd, Ge, Mf, Hg, I, La, Li, Lu, Mn, Mo, Nb, Nd, Ni, Pb, Pr, Rb, Sb, Se, Sm, Sn, Sr, Та, Tb, Th, Ті, ТІ, Tm, U, V, W, Y, Yb, Zn, Zr), содержание которых приведено в таблицах 3.1.1 и 3.1.2.
При сравнительном анализе полученных данных оказалось, что в каждом образце обнаруживались индивидуальные особенности в накоплении отдельных элементов.
Больше всего первых (14) значений элементов (Si, As, Bi, Со, Но, La, Mo, Nb, Pb, Sn, Tb, Tl, Tm, U) преобладало в семенах сорта Янтарь, затем (13) сорта Кинельский (Na, Се, Er, Gd, Mn, Ni, Se, Sm, Sn, Ті, W, Y, Zn), no 12 — сорта Кизлярец (Mg, Au, Ag, Cd, Dy, Er, Eu, Ga, Rb, Sb, V, Yb) и сорта Крепыш (P, Ba, Cu, Ge, Hf, Hg, I, Li, Lu, Pr, Та, Th), меньше всего (11) — сорта Воронежский (А1, К, Са, В, Be, Br, Cs, Cr, Fe, Nd, Zr). Вторых значений после максимальных во всех сортах одинаково (по 12). Так, в семенах сорта Янтарь они отмечены для К, Са, Ag, Au, Dy, Ga, Hf, I, Lu, Pr, Zn, Zr; сорта Кинельский — P, As, Ba, Bi, Co, Cu, Hg, Ho, Rb, Та, U, V; сорта Кизлярец — Al, Na, Si, B, Cr, Gd, Nb, Ni, Sn, Th, ТІ, Tin; сорта Крепыш — Mg, As, Cd, Cs, Er, Eu, Fe, La, Mn, Mo, Nd, Y; сорта Воронежский — Се, Ge, Li, Pb, Sb, Se, Sin, Sr, Tb, Ті, W, Yb.
Минимальных значений больше всего (17) обнаружено в семенах сорта Крепыш (К, Na, Si, Ag, Be, Bi, Co, Ga, Gd, Mo, Ni, Pb, Rb, Sm, U, Yb, Zn), затем (14) - сорта Воронежский (P, As, Au, Ba, Cd, Mf, Fig, Mo, Pr, Sn, Tl, Tm, V, Y), 12 - сорта Янтарь (Al, Cr, Er, Eu, Fe, Ge, Hg, Mn, Nd, Та, Th, Ті), 11 - сорта Кинельский (Ca, Mg, В, Br, Cs, Dy, Li, Lu, Nb, Sb, Tb) и 9 - сорта Кизлярец (As, Се, Си, 1, La, Se, Sr, W, Zr). Вместе с тем в последнем больше всего отмечено вторых значений после минимальных (Р, Be, Bi, Br, Со, Cs, Fe, Ge, Fig, Li, Lu, Mn, Mo, Nd, Pr, Sm, Та, Tb, U, Y, Zn), затем (14) сорта Воронежский (Mg, Na, Si, Ag, Cu, Er, Ga, Ho, I, Nb, Ni, Rb, Та, Th), несколько меньше (11) сорта Кинельский (Al, К, Ag, Cd, Eu, Hf, La, Pb, Sn, Yb, Zr), ещё меньше (8) сорта Янтарь (В, Ва, Се, Gd, Sb, Sr, V, W) и особенно (7) сорта Крепыш (Ca, Cr, Dy, Se, Ті, ТІ, Tm).
По мере убывания максимальных и вторых после них значений элементов до экстракции гексаном сорта могут быть представлены следующим образом: Янтарь Кинельский Кизлярец Крепыш Воронежский; аналогично минимальных и вторых после них значений: Кизлярец Воронежский Крепыш Кинельский Янтарь.
Иные результаты при соответствующем анализе максимальных и минимальных значений элементов в шроте семян различных сортов после извлечения жирного масла. Они более наглядны по максимальным и особенно вторым после них значениям (табл. 3.1.2). Так, после экстракции гексаном ни одного максимума, ни одного второго значения после них в ряду анализируемых элементов не выявлено в семенах сорта Крепыш. Больше всего (19) максимальных значений отдельных элементов (К, Р, Si, As, Au, В, Ва, Be, Се, Cs, Си, Gd, Hg, La, Mn, Nb, Sr, Th, Yb) отмечено в шроте семян сорта Янтарь, на одно значение меньше (18) — сорта Кизлярец (Na, Ag, Bi, Br, Fe, НГ, Ho, Lu, Mo, Ni, Pb, Pr, Se, Tl, Tm, U, Zn, Zr), несколько меньше (14) — сорта Кинельский (Al, Mg, В, Eu, Ga, Ge, I, Li, Nd, Sm, Sn, Та, V, Y) и меньше всего (12) — сорта Воронежский (Ca, Au, Cd, Co, Cr, Dy, Er, Rb, Sb, Tb, Ті, W).
Вторых значений после максимальных больше всего (20) обнаружено в шроте семян сорта Кинельский (Са, As, Au, Ва, Cd, Cs, Си, Fe, Hf, Ho, La, Lu, Sb, Se, Sr, Tb, Th, Ті, Tm, U, Zr), затем (15) - Кизлярец (Si, As, B, Bi, Co, Dy, Er, Eu, Gd, Hg, Rb, Sm, W, Y, Yb), столько же, сколько и в предыдущем, - сорта Воронежский (К, Na, Ag, Се, Ga, Ge, Mn, Mo, Nb, Nd, Ni, Pr, Sn, Tl, Zn) и 10 (Al, Mg, Bi, Br, Cr, I, Li, Pb, Та, V) - сорта Янтарь.
При сравнительном анализе после экстракции гексаном больше всего (36) минимальных (К, Na, Р, Si, Ag, As, Be, Bi, Br, Co, Cs, Cr, Dy, Er, Eu, Ga, Gd, Hf, Hg, Ho, I, La, Li, Nb, Ni, Rb, Sb, Sm, Sn, Sr, V, W, Y, Yb, Zn, Zr) и вторых после них значений (18) выявлено в семенах сорта Крепыш (Al, Mg, Au, В, Се, Си, Ge, Lu, Mn, Nd, Pb, Pr, Se, Та, Th, Tl, Tin, U). Значительно меньше их в семенах других сортов. Так, в семенах сорта Кизлярец 10 минимальных (Са, Mg, Ва, Се, Си, Ge, Mn, Та, Th, Ті) и 6 значений после них (Cr, La, Nb, Sn, Sr, V). Соответственно в семенах сорта Янтарь 8 (Cd, Fe, Mo, Nd, Se, Tb, Tl, Tin) и 13 (Ca, Ag, Co, Er, Ga, Ho, Ni, Rb, Sb, Sm, Ті, W, Zr), сорта Воронежский — 7 (Al, As, B, Lu, Pb, Se, U) и 11 (Si, Ba, Bi, Cs, Eu, Fe, Hf, Mg, I, Li, Y), сорта Кинельский — 1 (Pr) и 8 (Na, Be, Br, Dy, Gd, Mo, Yb, Zn).
По мере убывания максимальных и вторых после них значений элементов после экстракции гексаном сорта можно расположить в следующий ряд: Кинельский Кизлярец Янтарь Воронежский Крепыш, аналогично минимальных и вторых после них значений: Крепыш Янтарь Воронежский Кизлярец Кинельский, т. е. весьма наглядны сортовые особенности в накоплении анализируемых элементов.
Из изложенного следует, что семена анализируемых сортов амаранта в больших количествах аккумулируют К, Са, Mg, Р, Fe, Mn, Zn, Rb, Ті, В, Ва, что подтверждает известные данные [85, 112].
Данные по содержанию доминирующих макро- и микроэлементов семян амаранта коррелируют с накоплением этих же элементов в семенах льна, семенах гречихи и плодах расторопши пятнистой [20, 147]. Это позволяет отнести семена амаранта печального и, что важно, его шрота к источникам эссенциальпых элементов, недостаток которых в организме человека может привести к различным заболеваниям.
Содержание техногенных и токсичных элементов в исследуемом сырье нами определено с помощью метода масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой. Основной критерий экологической чистоты сырья -содержание в нем отдельных токсичных элементов. В настоящее время не приняты предельно допустимые концентрации (ПДК) техногенных и токсичных элементов для официнального сырья, поэтому в качестве ориентировочного критерия экологической чистоты нами использованы ПДК для пищевых продуктов, принятые в Российской Федерации (СанПиН 2.3.2.1078-01 от2001 года) (табл. 3.1.3).
Условные обозначения образцов: 1 — семена амаранта печального сорт Воронежский, собранные в сентябре 2009 года; 2 - семена амаранта печального сорт Крепыш, собранные в сентябре 2008 года; 3 - семена амаранта печального сорт Кизлярец, собранные в сентябре 2008 года; 4 - семена амаранта печального сорт Кинельский, собранные в сентябре 2007 года; 5 - семена амаранта печального сорт Янтарь, собранные в сентябре 2008 года.
Накопление токсичных и техногенных элементов (свинец, мышьяк, кадмий, ртуть) в анализируемом сырье не превышало предел допустимых концентраций на период заготовки и исследования сырья. В результате чего семена различных сортов амаранта печального, культивируемого в Центральном федеральном округе, экологически безопасны и использованы нами для получения жирного масла.
ТСХ-анализ фосфолипидов
Фосфолипиды - важнейшие фосфорносодержащие соединения липидного характера, входящие в состав живых организмов. Они обладают рядом важных физиологических и биологических свойств, в частности участвуют в процессах клеточной регуляции, отвечают за формирование информационно-регуляторных потоков в ответ на воздействие эндогенных факторов, проявляют адыовантные свойства и поэтому способны влиять на иммунный стагус [136, 154, 156, 195,217].
Ацетоновой экстракцией нами получен фосфолипидный комплекс масел семян различных сортов амаранта печального по методике Блайя и Дайэра, являющейся упрощенным вариантом классического метода Фолча [218].
Гравиметрическим методом нами определена масса фосфолипидного комплекса и рассчитано его процентное содержание в изучаемых маслах (табл. 4.6.1). В жирном масле из семян различных сортов амаранта печального содержалось от 2,5 до 3,5% суммы фосфолипидов. Их наибольшее содержание отмечено в сортах Воронежский и Янтарь. Различия в количественном содержании, возможно, можно объяснить сортовой вариабельностью химического состава семян.
Известно, что содержание и состав фосфолипидов, извлекаемых вместе с маслом при переработке сырья, обусловлены их состоянием в масличных семенах и качеством последних. Кроме того, они зависят от степени зрелости, условий послеуборочной обработки и хранения, а также от применяемых способов получения растительных масел [3].
В таблице 4.6.2 представлены результаты по содержанию фосфолипидного комплекса в анализируемых маслах, полученных методом Фолча и методом ВЭЖХ (НИИ РАМН).
Количественные значения содержания суммы фосфолипидов, полученные методом ВЭЖХ, отличаются от рассчитанного нами после осаждения ацетоном, что, возможно, связано с большей чувствительностью метода ВЭЖХ, а также возможными потерями фосфолипидов при смывании их с фильтра после осаждения ацетоном. Вместе с тем нами отмечено, что, несмотря на различия при количественном определении фосфолипидов, сохранилась тенденция распределения содержания их суммы относительно анализируемого сортовых образцов.
Для фракционного разделения суммы фосфолипидов нами использован метод ТСХ. Отдельные фосфолипиды обнаруживались в виде синих пятен на желто-зеленом фоне (рис. 4.6.1). Расчет их процентного содержания в комплексе так же проводили с использованием компьютерной программы Sorbfil Videodensitometer.
Из результатов хроматографирования следует, что, в основном, в испытуемых образцах жирных масел нами выявлены 4 зоны фосфолипидов, каждая из которых характеризуется своими значениями Яг(табл. 4.6.3).
При сравнении эталонных значений и полученных нами идентифицированы следующие соединения: фосфатидилхолин (ФХ) - со значениеми Rf в среднем 0,57, фосфатидилсерин (ФС) - с Rf в среднем 0,74, фосфатидилэтаноламин (ФЭА) - с Rr в среднем 0,89, фосфатидовая кислота (ФК) - с Rf в среднем 0,92. Перечисленные вещества относят к ценным эссенциальным фосфолипидным соединениям.
В течение последних десятилетий рядом исследователей установлено, что наиболее фармакологически активным компонентом из суммы фосфолипидов является фосфатидилхолин [3, 56, 219]. Именно его содержание в препаратах в подавляющем большинстве случаев определяет направленность и выраженность терапевтического эффекта. Например, в высокоэффективном препарате "Эссенциале форте" (Германия), концентрация полиненасыщенного фосфатидилхолина по отношению к сумме фосфолипидов составляет более 95% [154].
Другие фосфолипиды (фосфатидилглицерин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, сфингомиелин) обычно присутствуют как "минорные" компоненты, которые могут модифицировать активность фосфатидилхолина в неблагоприятную сторону. Фосфатидовая кислота лежит в основе образования фосфолипидов путем этерификации соответствующим аминоспиртом.
Как видно из анализа данных таблицы 4.6.4, содержание отдельных компонентов суммы фосфолипидов и их числовые значения зависели от сортовой принадлежности и сильно варьировали.
Наибольшее содержание эссенциалыюго компонента смеси фосфолипидов - фосфатидилхолина выявлено в жирном масле, полученном из семян сорта Воронежский (30,2 %). В жирных маслах сортов Кинельский и Янтарь фосфатидилхолина обнаружено на 30 % меньше, а в маслах сортов Крепыш и Кизлярец он содержался в концентрациях в два раза меньших. Кроме того, нами отмечено, что только в жирном масле сорта Кинельский обнаружена лизоформа фосфатидилхолина (ЛФХ), более 6 %. Высокие концентрации лизофосфолипидов могут нарушать целостность мембран и даже приводить к лизису клеток [241], вместе с тем они проявляют бактерицидную активность [104], но в малых концентрациях эти соединения могут выступать в качестве липидных вторичных мессенджеров и проявлять множественные биологические активности [71].
Возможно, наличие лизоформы фосфолипида в небольшой концентрации в известной мере влияет на проявление терапевтического действия амарантового масла. Высказанное предположение потребует дальнейших специальных исследований, направленных на изучение фармакологической активности амарантового масла.
Анализ жирных масел, полученных из семян амаранта печального различных сортов, показал, что все они содержали комплекс биологически активных веществ в значимых количествах. Вместе с тем для дальнейшего изучения качества и сроков хранения нами выбрано в качестве объекта исследования амарантовое масло семян сорта Воронежский.
Гипохолестеринемическое действие
Гиполипидимическая лекарственная терапия - один из главных способов снижения риска развития и прогрессирования атеросклероза [90]. Актуальным является поиск новых веществ, способных не только устранять дислипопротеидемии атерогенного характера, но и метаболические нарушения артериальной стенки, связанные с увеличением содержания общего холестерина в крови, с нормализацией ее проницаемости, снижением содержания атерогенных липопротеидов низкой плотности и повышением в крови антиатерогенных липопротеидов высокой плотности.
Определение гипохолестеринемического действия масла из семян амаранта проводили в условиях дополнительной алиментарной холестериновой нагрузки в сравнении с подсолнечным и льняным маслами. Критериями оценки гипохолестеринемического действия являлись биохимические показатели сыворотки крови.
Исследования проведены на 40 белых беспородных крысах-самцах массой тела 180-220 грамм. При этом сформированы 4 группы животных по 10 крыс в каждой группе. Первая группа - интактная (здоровые животные, никакие лекарственные препараты не вводили). Вторая группа - контрольная. Животные этой группы в течение опыта получали 1% раствор холестерина в 5 мл подсолнечного масла из расчета на 1 кг массы тела животного. Третья группа - опытная. Животные этой группы в течение опыта получали 1% раствор холестерина в 5 мл амарантового масла из расчета на 1 кг массы животного. Четвертая группа - группа препарата сравнения. Животные этой группы в течение опыта получали 1% раствор холестерина в 5 мл льняного масла из расчета на 1 кг массы животного.
На протяжении всего периода проведения эксперимента (21 день) животным контрольной и опытных групп ежедневно в утренние часы до основного кормления, внутрижелудочно, с помощью зонда вводился масляный 1 % раствор холестерина (ХС) в соответствующем масле. Результаты исследования представлены в таблице (табл. 6.4.1).
Из данных исследования следует, что в группах животных, получавших растворы холестерина с амарантовым и льняным маслами концентрация общего белка в сыворотке крови по окончании эксперимента достоверно выше по сравнению с контролем соответственно на 20,5% и 19,3 %, но не превышала верхних границ нормы. Такая же тенденция выявлена в отношении содержания общих липидов. Как известно, транспорт жирных кислот осуществляется в составе белок-липидных комплексов. Таким образом, повышение содержания в сыворотке крови крыс, получавших растворы масел, общего белка и липидов при достоверном увеличении концентрации мочевины косвенно свидетельствуют об интенсификации белкового обмена у животных данных опытных групп.
Поскольку кормление опытных животных растворами растительных масел и холестерина вызывало интенсификацию процессов липидного обмена в печени, нами проанализированы показатели активности гепатотрофных ферментов (ЩФ, АсАТ, АлАТ). При этом в результате проведенных исследований отмечено, что, несмотря на дополнительную холестерин-ЖК нагрузку, в сыворотке крови животных опытных групп отсутствовало достоверное увеличение активности упомянутых ферментов, что вероятно указывает на наличие элементов гепатопротекторной активности исследуемых масел.
Изучение фракций белков сыворотки крови показало недостоверное увеличение фракции альбуминов, как известно ответственных за транспорт ТГ (табл. 6.4.2).
При изучении показателей липидного обмена в сыворотке крови крыс интактных и экспериментальных групп нами выявлены статистически достоверные изменения, которые представленные в таблице 6.4.3.
При этом нами установлено, что пероральное применение масляных растворов 1 % раствор ХС в дозе 5 мл/кг привело к достоверному увеличению общего холестерина в контрольной группе животных почти в 4 раза, тогда как на фоне применения раствора холестерина в амарантовом масле не обнаружено достоверных изменений в содержании ХС по сравнению с интактными здоровыми животными, при этом по сравнению с контролем содержание холестерина составило 71,4 %. На фоне введения льняного масла зафиксировано его достоверное снижение на 27,0 % по сравнению со здоровыми животными и на 77,7 % по сравнению с контролем.
Из результатов предпринятых нами исследований следует, что в сыворотке крови животных контрольной и опытных групп достоверно повышалось содержание ЛПВП по сравнению с интактными животными. Вместе с тем, если в контрольной группе оно являлось в 2,5 раза большим по сравнению со здоровыми животными интактной группы, то на фоне введения амарантового и льняного масла содержание ЛПВП увеличивалось лишь на 97% и 91 % соответственно.
Содержание атерогенных липоротеидов в составе ЛПНП контрольной группы увеличилось более чем в 5,5 раз, в то время как введение амарантового льняного масла вызывало снижение ЛПНП на 46 % и 66 % соответственно по сравнению с контролем.
Следует подчеркнуть, что в контрольной группе животных коэффициент атерогенности значительно (в 1,8 раза) повышен, что возможно свидетельствовало о наличии дисбаланса содержания липопротеидов и гиперхолестеринемии, предшествующих развитию атеросклероза. Соответственно в результате применения амарантового и льняного масел выявлено значительное снижение коэффициента атерогенности (в 4,7 раза и 7,9 раза ниже по сравнению с контролем соответственно группам). В связи с тем, что снижение коэффициента атерогенности, как известно выражающего отношение атерогенных липопротеинов к содержанию антиатерогенных липопротеинов, на фоне применения амарантового и льняного масел, по видимому, указывает на нормализацию липопротеидного дисбаланса, что наряду с выявленным нами значительным снижением содержания общего холестерина подтверждало их достаточно выраженный гипохолестеринемический и гиполипидемический эффект.
Изложенное выше свидетельство того, что амарантовое масло оказывало гипохолестеринемический и гиполипидемический эффект, однако степень его выраженности несколько меньше, чем на фоне влияния льняного масла. Возможно, антиатерогенное действие амарантового и льняного масла обусловлено высоким содержанием в них полиеновых жирных кислот, прежде всего омега-3 и омега-6 жирных кислот.
