Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Растения родов dracocephalum l. и hissopus l., их химический состав, ботаническая и экологическая характеристика, применение 11
1.1 Ботаническая и экологическая характеристика растений родов змееголовник и иссоп, их географическое распространение 11
1.2 Химический состав растений родов змееголовник и иссоп 19
1.3 Применение растений родов змееголовник и иссоп в научной и народной медицине 28
Заключение по обзору литературы 32
ГЛАВА 2 Объекты и методы исследований 33
2.1 Характеристика объектов исследований 33
2.2 Методы фитохимических исследований 38
2.2.1 Приготовление водных извлечений для проведения качественных реакций 39
2.2.2 Приготовление спирто-водных извлечений и фракционирование природных соединений органическими растворителями 39 "
2.2.3 Методы изучения фенольных соединений 39'
2.2.3.1. Хроматографический анализ 39
2.2.3.2. Хроматографический анализ фенольных соединений методом ВЭЖХ 40
2.2.4 Флавоноиды 41
2.2.5 Фенолокислоты 43
2.2.6 Эфирное масло 43
2.2.7 Иридоиды 43
2.2.8 Полисахариды 45
2.2.9 Тритерпеновые соединения 46
2.2.10 Дубильные вещества 48
2.2.11 Аминокислоты 48
2.2.12 Органические кислоты 49
2.2.13 Определение макро- и микроэлементов 50
2.3 Морфолого-анатомический анализ растительного сырья 51
2.4 Определение товароведческих показателей качества сырья 5Г
2.5 Определение микробиологической чистоты сырья 52
2.6 Определение сроков хранения сырья 52
2.7 Статистическая обработка данных 53
2.8 Методы фармакологических исследований 53
2.8.1 Изучение острой токсичности 54
2.8.2 Изучение отхаркивающего действия 54
2.8.3 Изучение диуретической активности 55
2.8.4 Изучение седативного действия 55
2.8.5 Изучение антимикробных свойств 56
ГЛАВА 3 Фитохимическое исследование травы змееголовника молдавского и иссопа лекарственного .58
3.1 Эфирное масло 58
3.1.1 Выделение и изучение динамики накопления эфирного масла 58
3.1.2 Использование газо-жидкостной хроматографии в анализе эфирного масла из сырья змееголовника молдавского и иссопа лекарственного 65
3.2 Фенольные соединения 73^
3.2.1 Идентификация фенольных соединений 73
3.2.2 ВЭЖХ фенольных соединений травы змееголовника молдавского 81
3.2.3 Изучение динамики накопления флавоноидов в траве змееголовника молдавского..83
3.2.4 Количественное определение суммы флавоноидов в траве иссопа лекарственного 86
3.2.5 Количественное определение фенолокислот 88
З.ЗИридоиды 90s
3.3.1 Идентификация иридоидов 90
3.3.2 Количественное определение иридоидов 94
3.4 Полисахариды 98*
3.4.1 Выделение полисахаридного комплекса 100
3.4.2 Определение моносахаридного состава полисахаридов 103
3.5 Тритерпеновые соединения 106'
3.5.1 Идентификация тритерпеновых кислот 107
3.5.2 Определение количественного содержания тритерпеновых соединений 108-
3.6 Дубильные вещества 111-
3.7 Аминокислотный состав 112
З.вЮрганические кислоты 115
3.8.1 Изучение качественного состава органических кислот 115
3.8.2 Определение кислоты аскорбиновой 116
3.9 Макро- и микроэлементы 118
Выводы по главе 121
ГЛАВА 4 Стандартизация сырья змееголовника молдавского и иссопа лекарственного и разработка проекта фармакопейной статьи предприятия на траву змееголовника молдавского 124
4.1 Исследование морфолого-анатомических признаков змееголовника молдавского и иссопа лекарственного 124
4.1.1 Морфологические особенности 124
4.1.2 Анатомическое строение вегетативных органов 126
4.1.3 Качественные реакции для травы змееголовника молдавского и иссопа лекарственного 139
4.2 Разработка оптимальных условий методики количественного определения суммы флавоноидов в траве змееголовника молдавского .142
4.3 Определение товароведческих показателей сырья 147
4.4 Определение микробиологической чистоты травы змееголовника молдавского и иссопа лекарственного 150
Выводы по главе 150
ГЛАВА 5 Фармакологические исследования травы змееголовника молдавского и иссопа лекарственного 152
5.1 Исследование фармакологической активности спиртовых извлечений из травы змееголовника молдавского и иссопа лекарственного 152'
5.1.1 Определение острой токсичности 152
5.1.2 Изучение отхаркивающего действия 154'
5.1.3 Изучение диуретической активности 156
5.1.4 Изучение седативного действия 158
5.2 Изучение антимикробных свойств эфирного масла и спиртовых извлечений из травы змееголовника молдавского и иссопа лекарственного 159
5.2.1 Изучение антимикробного действия эфирных масел и спиртовых извлечений из травы змееголовника молдавского и иссопа лекарственного 160
5.2.2 Изучение антимикробной активности эфирного масла змееголовника молдавского 162
5.2.3 Изучение антимикробной активности спиртовых извлечений змееголовника молдавского и иссопа лекарственного 164
Выводы по главе 165
Общие выводы 166
Список литературы
- Химический состав растений родов змееголовник и иссоп
- Хроматографический анализ фенольных соединений методом ВЭЖХ
- Использование газо-жидкостной хроматографии в анализе эфирного масла из сырья змееголовника молдавского и иссопа лекарственного
- Качественные реакции для травы змееголовника молдавского и иссопа лекарственного
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время лекарственные препараты на основе растительного сырья успешно применяются при лечении большинства заболеваний, не смотря на то, что эпоха синтетических препаратов, начавшаяся приблизительно полтора века назад, позволила медицине шагнуть далеко вперед. Фитотерапия уходит своими корнями в глубину веков. Фитопрепараты обладают рядом преимуществ перед синтетическими лекарствами - широкий выбор терапевтически активных ингредиентов в лекарственных растениях, возможность их комбинированного использования, меньшая частота побочных эффектов и противопоказаний. Эти особенности способствуют широкому использованию фитопрепаратов в клинической практике для лечения ряда заболеваний, а также в качестве дополнения к основному лечению, в виде профилактической терапии. Однако, антропогенное воздействие на природу и сложность экологической обстановки в ряде регионов России привели к резкому сокращению природных запасов большинства лекарственных растений. Возрастающая потребность здравоохранения в лекарственных препаратах растительного происхождения на первый план ставит вопросы обеспечения сырьевой базы за счет дополнительных растительных источников и их комплексного использования. Широкая и неконтролируемая эксплуатация эфирномасличных растений привела к истощению многих сырьевых ресурсов, поэтому возникает необходимость в изучении интродуцентов, способных обеспечить стабильную сырьевую базу. В этом плане особый интерес представляют эфирномасличные растения семейства яснотковые, так как они содержат комплекс биологически активных веществ (эфирные масла, иридоиды, тритерпеноиды, полисахариды, фенольные соединения и др.), обладают разносторонней фармакологической активностью и малой токсичностью. Большинство эфирномасличных растений семейства яснотковые в настоящее время применяются в качестве отхаркивающих, противовоспалительных, ранозаживляющих, седативных и др. средств. Многие виды растений семейства яснотковые недостаточно изучены в химиче ском отношении и имеют ограниченные сведения по фармакологической активности.
Змееголовник молдавский {Dracocephalum moldavica L.) и иссоп лекарственный (Hyssopus officinalis L.) не произрастают на территории Северо-Кавказского региона. Однако на экспериментальных участках лаборатории лекарственных растений Ставропольского НИИ сельского хозяйства (СНИИСХ) на протяжении пяти лет проводятся исследования по культивированию различных селекционных форм змееголовника молдавского и ботанических форм иссопа лекарственного (розовая и синяя окраска венчика). Экспериментально установлено, что в экологически благоприятных условиях юга России возможно получение необходимого количества семенного и посадочного материала для создания промышленных плантаций исследуемых растений. В тоже время внедрение близкородственных видов семейства яснотковые в медицинскую практику позволит значительно расширить сырьевую базу официальных видов лекарственного растительного сырья, а также номенклатуру лекарственных растений, сырья и лечебных средств на их основе.
Змееголовник молдавский и иссоп лекарственный широко применяются в национальной медицине многих стран мира и включены в фармакопеи ряда Европейских стран, однако в химическом отношении они изучены недостаточно. Поэтому фармакогностические исследования указанных видов растений, изучение их фармакологической активности с целью внедрения в медицинскую практику, а также разработка норм качества и стандартизация новых видов сырья являются весьма актуальными.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключается в фармакогностическом исследовании змееголовника молдавского и иссопа лекарственного, разработке методик стандартизации сырья и проведении фармакологического скрининга для обоснования возможности использования надземной части этих растений в качестве лекарственного растительного сырья.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
• провести фотохимический анализ надземной части змееголовника молдавского и иссопа лекарственного для выявления основных групп БАВ;
• разработать оптимальные условия методик для оценки качества сырья по количественному содержанию эфирного масла и флавоноидов;
• установить основные морфолого-анатомические диагностические признаки и товароведческие показатели сырья;
• изучить антимикробные свойства эфирного масла и спиртовых извлечений из травы змееголовника молдавского и иссопа лекарственного;
• провести фармакологический скрининг спиртовых извлечений из травьг исследуемых видов;
• провести стандартизацию травы змееголовника молдавского и разработать нормативную документацию на данный вид сырья.
Научная новизна и теоретическая значимость работы. Проведено фи- ; тохимическое изучение травы змееголовника, молдавского и иссопа лекарственного (ботанические формы с синим и розовым венчиком). Установлено на- -личие эфирного-масла, флавоноидов, иридоидов,, полисахаридов, фенол окис-лот, органических кислот, дубильных веществ, тритерпеновых соединений. Впервые изучен состав аминокислот и макро- и микроэлементов травы змееголовника молдавского. Методом газожидкостной хроматографии впервые изучено эфирное масло разных ботанических форм иссопа лекарственного.
Впервые из надземной части змееголовника молдавского выделены и охарактеризованы полисахариды, определено их количественное содержание; изучен качественный моносахаридный состав. Иолисахариды. представлены нейтральными сахарами (глюкоза, арабиноза, ксилоза, галактоза,, рамноза) и уроновыми кислотами (галактуроновая и глюкуроновая кислоты).
Впервые в траве змееголовника молдавского методом ВЭЖХ идентифицированы 12 соединений фенольной природы: флавоноиды (лютеолин, апиге-нин, цинарозид, кверцетин, дигидрокверцетин, гесперидин) и фенолокислоты (хлорогеновая, кофейная, феруловая, коричная, цикориевая, галловая). В сырье иссопа лекарственного идентифицированы 5 соединений флавоноидной приро ды (гиперозид, гесперидин, рутин, апигенин и диосмин) и 4 фенолокислоты (хлорогеновая, кофейная, феруловая и розмариновая).
В траве змееголовника молдавского и иссопа лекарственного впервые исследован качественный состав и определено количественное содержание суммы иридоидов.
Впервые изучена динамика накопления эфирного масла и флавоноидов в траве змееголовника молдавского по фазам вегетации; определены оптимальные сроки заготовки сырья.
Комплексные исследования селекционных образцов змееголовника молдавского позволили определить сортообразец, признанный селекционерами наиболее перспективным по совокупности хозяйственно-полезных признаков, в том числе, по продуктивности эфирного масла. Получено авторское свидетельство №43954 на новый сорт змееголовника молдавского «Эгоист».
В ходе фармакологического скрининга выявлена антибактериальная активность эфирного масла и спиртовых извлечений- из травы змееголовника молдавского и иссопа лекарственного, определены острая токсичность и наличие отхаркивающего, диуретического и седативного действия спиртовых извлечений из сырья.
Практическая значимость результатов исследования.
На основе проведённых исследований разработаны показатели и нормы качества сырья, установлены характерные диагностические особенности травы змееголовника молдавского. Разработаны и включены в проект ФСП на-, траву змееголовника молдавского- оптимальные условия методики количественного определения суммы флавоноидов и эфирного масла. Предложена методика ТСХ-анализа флавоноидной фракции травы змееголовника, позволяющая подтвердить подлинность сырья. Определены оптимальные сроки заготовки сырья.
Интродукционные исследования, проведённые совместно с сотрудниками лаборатории лекарственных растений Ставропольского НИИ сельского хозяйства (СНИИСХ), и фитохимическое изучение змееголовника молдавского и иссопа лекарственного свидетельствуют о возможности культивирования данных видов растений в условиях Ставропольского края в качестве источников биологически активных веществ: эфирных масел, фенольных и полифенольных соединений.
Показана возможность применения в медицинской практике травы змееголовника молдавского и иссопа лекарственного в качестве источников отхаркивающих, диуретических, седативных и антимикробных средств, что позволит значительно расширить номенклатуру лекарственного растительного сырья, и лечебных средств на его основе.
Внедрение результатов исследования в практику.
Разработаны проект ФСП «Змееголовника молдавского трава» и «Инструкция по сбору и сушке травы змееголовника молдавского», прошедшие апробацию на ФГУП «Пятигорская фармацевтическая фабрика» (акт от 21 апреля 2007).
Основные положения, выносимые на защиту:
• результаты фитохимического исследования травы змееголовника» молдавского и иссопа лекарственного;
• рекомендации по1 использованию выявленных диагностических признаков травы змееголовника молдавского и иссопа лекарственного;
• результаты исследований по выбору экстрагента, обеспечивающего наиболее полную экстракцию определённой группы БАВ из травы змееголовника молдавского и иссопа лекарственного;
• основные положения стандартизации сырья (травы) змееголовника молдавского;
• результаты некоторых фармакологических и микробиологических исследований эфирного масла и спиртовых извлечений из .травы змееголовника молдавского и иссопа лекарственного.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на 59-61-й межрегиональных конференциях по фармации, фармакологии и подготовке кадров (г. Пятигорск, 2005-2007 гг.). По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ.
Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Пятигорской государственной фармацевтической академии ПятГФА (номер государственной регистрации 0120011264).
Объём и структура диссертации. Работа изложена на 187 страницах машинописного текста, содержит 54 таблицы, 39 рисунков, состоит из введения, обзора литературы (1 глава), главы, посвященной материалам и методам исследования, 3 глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 193 источника, в том числе 21 иностранного, и приложения.
Химический состав растений родов змееголовник и иссоп
М.Н. Кубрак с соавторами изучали изменчивость эфирного масла змееголовника молдавского и почтиголовчатого в онтогенезе. По биосинтезу эфирного масла в листьях и соцветиях обнаружена закономерность, которая характерна и для растений других родов, синтезирующих масла именно в этих органах. Максимум образования эфирного масла в листьях змееголовника молдавскогои почтиголовчатого приходится на период до бутонизации (0,8 и 4,5 %), а в гене-ративных органах - массового цветения (1,4 и 4,5 %) [87, 88].
Изучение терпеноидов эфирного масла видов змееголовника, проведенное М.Н. Кубрак и Л.И. Житарчук, позволило выяснить межвидовые взаимоотношения у растений этого рода. Установлено, что основным компонентом эфирного масла змееголовника почтиголовчатого является п-ментадиен-1,8-аль-10 (54,2 %). Кроме альдегида в масле присутствуют лимонен (до 15 %), п-ментадиен-1,8-ацетат-10, а-пинен, р-пинен, аллоцимен. Змееголовник почтиго ловчатый по составу эфирного масла очень близок змееголовнику вонючему, который рассматривается некоторыми ботаниками как разновидность змееголовника молдавского, другие выделяют его в самостоятельный вид [89, 90, 91]. Эфирное масло змееголовника молдавского состоит в основном из ациклических монотерпеноидов — цитраля, геранилацетата, гераниола, тогда как эфирное масло змееголовника почтиголовчатого и вонючего - из моноциклических — п-ментадиен-1,8-аль-10, п-ментадиен-1,8-ола-10 и его сложного эфира. Однако последние два вида змееголовников значительно различаются по морфологическим признакам, они отнесены к различным систематическим группам. Змееголовник вонючий относится к ряду Foetidae Schischik, а почтиголовчатый — к ряду Peregrine Schischik подрода Eudracocephlnm. [30, 88, 90].
Некоторые виды рода Dracocephalum изучены на содержание пентацик-лических тритерпеновых кислот — урсоловую, олеаноловую- и бетулиновую. [42, 61, 62]. Согласно результатам исследований А.Д. Зориной у 10 видов змееголовников: D: foetidum Bunge., D. fruticulosum Steph:, D: ruyschiana L., D. charkevichii Drobat.,.D: multicolor Kom., D. imberbe Bunge, D. palmatum Steph., D. bipinnatunrL., D. nodulosum Rupr., D. stamineum Kar. Et Kir. все тритепены относятся к пентациклическим и являются представителями групп фридоолеа-нана, лупана, олеанана, урсана. Детально изучен тритерпеновый состав травы D. multicolor Кот., эндемика флоры России. Исследование хлороформного экстракта всех исследованных видов змееголовника установило наличие в них ур-соловой кислоты,, в надземной, части D. multicolor Кот. идентифицированы,урсоловая кислота и {3-ситостерин [153].
Впервые обратил внимание на виды рода Dracocephalum L. как источники жирных масел С.Л. Иванов (1929 г.); он определил содержание жирного масла в семенах D. moldavica L. и отметил его высокие технические качества. В настоящее время в литературе имеются сведения о содержании и составе масел семян 8 видов рода Dracocephalum L. Содержание жирного масла в семенах колеблется от 3,72% до 29%, наибольшее количество масла характерно для семян D. moldavica L. и D. diversifolium Rupr. (25,4%). У всех исследованных видов, за исключением D. diversifolium Rupr., масло семян имеет высокое йодное число, что свидетельствует о значительном содержании в нем ненасыщенных кислот, которые обеспечивают высыхающую способность масел. У большинства видов рода в состав масел входят ненасыщенные жирные кислоты - олеиновая, лино-левая и линоленовая, а также насыщенные — пальмитиновая и стеариновая. Эти жирные кислоты характерны для многих видов семейства губоцветных. В то же время у D. diversifolium Rupr. и D. subcapitatum (О. Kuntze) Lipsky обнаружен ряд насыщенных и ненасыщенных кислот, отсутствующих в семенах других видов данного рода [41, 54, 120].
Работы Г.В. Новицкой с соавторами посвящены изучению жирнокислот-ного состава масел семян 4 видов змееголовника и иссопа лекарственного [113, 114, 115]. Методом газо-жидкостной хроматографии было установлено, что масла семян Dracocephalum L. содержат 5 главных жирных кислот - пальмитиновую (П), стеариновую (С), олеиновую О), линолевую (Л) и линоленовую (Ле) (табл. 3). Таблица 3 - Жирные кислоты семян видов рода Dracocephalum L. и Hyssopus officinalis L. Виды родаDracocephalumL. Йодное число Жирные кислоты, мол.% Сумма кислот, % п С О Л Ле насыщенных ненасыщенных D. nutans L. 231,4 4,3 1,2 8,8 21,1 64,6 5,5 94,5 D. peregrinum L. 229,7 3,0 1,4 8,3 27,2 60,1 4,4 95,6 D. multicaule Kom. 227,1 3,9- 2,3- 9,8 21,1 62,8 6,2 93,8 D. ruyschiana L. 205,1 4,5 1Д 11,0 26,8 56,5 5,6 94,3 Hyssopus officinalis L. 229,0 5,1 1,4 8,6 21,4 63,5 6,5 93,5 Работы многих авторов посвящены изучению полифенолъных соединений представителей семейства Lamiaceae [17, 21, 63]. Первые сообщения о выделении флавоноидов из изучаемых видов появились в конце XIX - начале XX веков. В настоящее время изучен флавоноидный состав более 15 видов изучаемых родов, в большинстве из них обнаружены гликозиды флавонолов, в некоторых гликозиды флавонолов и флаванов. Характерным является распределение в этих видах гликозидов основных агликонов апигенина и лютеолина [6, 44, 167,192].
Производный акацетина - молдавозид был выделен из надземной части D. moldavica L. Фенолкарбоновые кислоты - хлорогеновая и кофейная присутствуют в надземной части D. moldavica L. и D. thymiflorum L. [96, 167].
Методами микрохимического анализа и люминесцентной микроскопии установлена локализация флавоновых соединений в паренхимных клетках стебля, мезофилла листа, эпидермы, а также в железистых волосках D. moldavica L. и D. thymiflorum L. Аскорбиновая кислота найдена в надземной части D. heterophyllum Benth., в листьях D. thymiflorum L., в листьях и цветках D. moldavica Ь., каротин - в листьях D. moldavica L. [78, 79, 138].
Методом хроматографии на полиамидном сорбенте спиртового экстракта из-травы D. nutants L. выделили два агликона флавоноидной природы. Сумма агликонов после ферментолиза была представлена двумя веществами, которые выделили препаративно методом хроматографии на полиамиде и идентифицировали как апигенин и лютеолин. Это позволило заключить, что все флавонои-ды этого растения являются производными лютеолина и апигенина [44, 45, 125, 192].
А.А. Шамыриной с соавторами изучены флавоноиды D. nutants L. Основ-ными из них являются лютеолин, лютеолин-3 -Р-Д-глюкопиранозид (дракоце-фалозид), апигенин-7-Р-0-глюкопиранозид (космосиин);. лютеолин-7-P-D-глюкопиранозид (цинарозид) [167]!
Согласно данным литературы, химический состав растений рода Hyssopus L. достаточно разнообразен (табл. 4). Химический состав иссопа обыкновенного представлен эфирным маслом (0,22-0,6%), основными компонентами которого являются а-пинен, Р-пинен, камфен карен, п-цимол, пино-камфон; стероидами: Р-ситостерином, флавоноидами (диосмин), тритерпенои-дами олеаноловой и урсоловой кислотами, витаминами Вь В2, С. Листья содержат эфирное масло 0,14-0,9 %, фенолкарбоновые кислоты (хлорогеновая ки 26 слота) и их производные, флавоноиды - виценин-2 (6,8-ди-С-гликозид апигени на); цветки-флавоноиды - диосмин (7-рутинозид диометина), иссопин [27, 63, 140]. Семена содержат жирное масло 24,2% (й.ч. 229), в гидролизате кислоты (%): пальмитиновая 5,1, стеариновая 1,4, олеиновая 8,6, линолевая 21,4, лино леновая 63,5 [113, 115].
Хроматографический анализ фенольных соединений методом ВЭЖХ
Для изучения компонентного состава фенольных соединений травы змееголовника молдавского применяли метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Анализ проводили на высокоэффективном жидкост 41 ном хроматографе фирмы «GILSTON» (Франция) модель 305; инжектор ручной, модель RHEODYNE 7125 USA с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы Мультихром для «Windows». В качестве неподвижной фазы была использована металлическая колонка размером 4,6x150 мм Luna Є 18 100, размер частиц 5 микрон. В качестве подвижной фазы использовали смесь: метанол-вода - кислота фосфорная концентрированная - тетрагидрофуран, в соотношении (370:570:5:60). Анализ проводили при комнатной температуре. Скорость подачи элюэнта 1 мл/мин. Продолжительность анализа 30 мин. Детектирование проводилось с помощью УФ-детектора «GILSTON» UV/VIS модель 15 Г, при длине волны 254 нм.
Для; исследования траву змееголовника молдавского измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм по (FOOT 214-83). Около 10,0 г лекарственного сырья помещали в колбу вместимостью 250 мл, прибавляли.50 мл спирта этилового 70 %, присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение. 1 часа с момента закипания- спиртоводної смеси BV колбе. После охлаждения смесь фильтровали через;бумажный фильтр в мерную колбу объёмом 100 мл и доводили спиртом этиловым 70% до метки (исследуемый раствор).
Параллельно готовили серию растворов сравнения 0,05 % в спирте этиловом 70 %: рутина,, кверцетина, лютеолина, лютеолин-7-гликозида, галловой кислоты, кофейной кислоты, хлорогеновой кислоты коричной кислоты, цикорие-вой кислоты, гиперозида, гесперидина, апигенина; феруловош кислоты, „ изофе-руловой кислоты, дигидрокверцитина. По 20 мкл исследуемых растворовш растворов сравнения вводили в хроматограф и хроматографировали в выше приведенных условиях. Идентификацию проводили путем сопоставления времен удерживания компонентов смеси и растворов сравнения [8, 29, 183].
Наличие флавоноидов определяли в водных и спирто-водных извлечениях из исследуемых растений с помощью характерных качественных реакций: 1. проба Синода (Цианидиновая реакция). К исследуемым спиртовым извлечениям прибавляли кислоту хлороводородную концентрированную и цинковую пыль. Наблюдали появление оранжево-красного окрашивания [53,97,161]; 2. при добавлении к спиртовым извлечениям раствора аммония хлорида 2% появлялось желто-зеленое окрашивание [94]; 3. при взаимодействии спиртовых извлечений с раствором натрия гидрокси-да 10 % наблюдали желто-бурое окрашивание [94, 161]; 4. реакция со средней солью свинца ацетата (реакция на флавоноиды, содержащие О-диоксигруппу в кольце). Наблюдали образование желтого осадка [94];
Для хроматографического изучения флавоноидных соединений методом хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента использовали следующие системы растворителей: растворы кислоты уксусной 2 %, 15 % и 30 %, бензол-этилацетат-кислота уксусная (50:50:1); н-бутанол-кислота уксусная-вода (4:1:2; 4:1:5, 40:12:28); проявители - пары аммиака, спиртовый раствор натрия гидро-ксида, спиртовый раствор алюминия хлорида 5%. Хроматограммы просматривали в УФ-свете до и после обработки хромогенными реактивами [8; 5, 29, 76, 97].
Количественное определение Для изучения динамики накопления суммы флавоноидов использовалась методика, указанная в ГФ XI, т. 2, в частной.статье «Трава зверобоя» [37]. Дифференциальная УФ-спектрофотометрия УФ-спектры поглощения измеряли на спектрофотометре СФ-56 в кюветах с толщиной слоя 10 мм в области от 200 до 600 нм.
Растворителем для флавоноидов служил безводный спирт этиловый и спирто-водные растворы. Оптимальным растворителем, обеспечивающим максимальный выход суммы флавоноидов, являлся спирт этиловый 70 %. В качестве комплексообразующей добавки для получения УФ-спектров поглощения применяли алюминия хлорид [8, 9, 29]. Запись УФ-спектров проводили на фоне чистого растворителя. Дифференциальные спектры записывались, на фоне исходного раствора исследуемого вещества равной концентрации для выяснения характера сдвигов в положения максимумов под влиянием реактивов.
Для обнаружения данной группы соединений в траве изучаемых растений использовали этилацетатную фракцию. Определение проводили хроматографией на бумаге в системе растворителей: раствор кислоты уксусной 2 % с последующей обработкой специфическими реактивами: спиртовым раствором бром-крезолового зеленого 0,5 %, парами аммиака, спиртовым раствором железа (III) хлорида 1 %, диазотированным п-нитроанилином [1, 7, 93, 94].
Количественное определение
УФ-спектры спиртовых растворов извлечения травы змееголовника молдавского имеют два характерных максимума при 280-290 нм (флавоны лютео-лин, апигенин, цинарозид)4 и 325 нм (фенилпропаноиды: феруловая, кофейная кислоты, розмариновая кислота и её этиловый эфир).. В качестве аналитической длины волны В.А. Куркиным предложено использовать максимум поглощения при 320—325 нм, характерный для содержащихся в растении фенолокислот (ферул овой, кофейной) [74, 81]. В данной области спектра спиртовые растворы извлечения из сырья и фенолокислоты имеют прямо пропорциональную зависимость оптической плотности от концентрации, что позволяет использовать прямукьспектрофотометрию для количественного определения фенолокислот.
Использование газо-жидкостной хроматографии в анализе эфирного масла из сырья змееголовника молдавского и иссопа лекарственного
Содержание эфирного масла в сырье иссопа лекарственного зависит от морфологических параметров, что подтвердилось в ходе эксперимента. Оказалось, что растения с сине-фиолетовой окраской венчика содержат большее количество эфирного масла (-0,58%), чем сырьё с венчиками розового цвета (-0,43 %). Определили, что содержание эфирного масла в образцах сырья, представляющего собой смесь цветков и листьев превышает таковой в эксперименте со стеблями и травой иссопа лекарственного. Установлено, что на выход эфирного масла из сырья исследуемых видов оказало влияние использование насыщенных растворов натрия хлорида. В4 среднем выход эфирного масла увеличивался на 16-50 %.
Использование газо-жидкостной хроматографии в анализе эфирного масла из сырья змееголовника молдавского и иссопа лекарственного
Компонентный состав эфирного масла змееголовника молдавского и иссопа лекарстенного исследовали методом газожидкостной хроматографии на газовом хроматографе «Цвет-500» с пламенно-ионизационным детектором. В выполнении этого фрагмента исследований большую помощь оказала доц. каф. аналит. химии Пятигорской ГФА Л.С. Ушакова. Образцы эфирных масел змееголовника были получены в 2004 г. (№1) и 2005 г. (№2), изучение проведено в 2005 г. Эфирное масло из сырья иссопа получали в 2005 году.
Использование газо-жидкостной хроматографии обусловлено широкими возможностями метода, позволяющего проводить разделение, идентификацию и количественное определение компонентов эфирных масел [139, 179, 185]. Для выполнения анализа необходимо было подобрать оптимальные условия хроматографирования: неподвижную жидкую фазу (НЖФ), температурный режим и др.
Эксперимент показал, что ГЖХ-разделение компонентов эфирных масел змееголовника и иссопа возможно проводить на НЖФ различной полярности [52, 176, 182], при этом лучшее разделение полярных соединений - достигаются на высокополярных НЖФ (карбоваксы, реоплексы, супероксы и др.), имеющих максимально допустимые рабочие температуры более 200С [57]..Наиболее подходящим для исследований нами были выбраны стеклянные насадочные колонки с цельностеклянными испарителями длиной 240 мм, диаметром 0,3 см, заполненные твердым сорбентом (носитель)- Reoplex 400 10 % на инертоне Super (0,16 мкм). После заполнения сорбентом колонки кондицировали до получения стабильной нулевой линии. Предварительное изучение ГЖХ характеристик предполагаемых компонентов эфирных масел и выбор оптимальных условий их разделения проводили на индивидуальных веществах и на их модельных смесях (точные навески около 0,05 г стандартов веществ растворяли- в 10 мл спирта). В работе использовали стандартные образцы производства, фирмы Fluka Chemie I Sigma-Aldrich Chemie (Швейцария, Германия).
Решающее влияние на ход хроматографического разделения оказывает температурный режим. Температура является одним из основных факторов, определяющих селективность сорбента, продолжительность разделения и размытость хроматографических зон [57, 59, 77, 91, 149].
Поэтому одним из этапов хроматографического анализа был выбор температурного режима ГЖХ-анализа эфирных масел. При подборе оптимальной температуры термостата колонки было установлено, что селективность колонки позволяет проводить анализ в изотермическом режиме. Хроматографирование проводили при температуре испарителя и детектора — 220-250С, температуру термостата колонки задавали начиная от 60-90С с задержкой 5-10 минут до 190С, с задержкой 5-10 минут в программированном режиме со скоростью нагрева 3-5С/мин, при расходе воздуха 300 мл/мин, водорода - 30 мл/мин, азота -30 мл/мин.
В результате проведенных исследований были выбраны оптимальные условия анализа эфирных масел змееголовника молдавского и иссопа лекарственного методом газо-жидкостной хроматографии.
Пробы стандартных образцов (точные навески около 0,05 г стандартов веществ растворяли в 10 мл спирта этилового 96 %) и эфирных масел (чистых эфирных масел и их 0,5 % растворов в спирте этиловом 96%) исследуемых видов объёмом 1 мкл с помощью микрошприца вводили в испаритель хроматографа и хроматографировали при следующих условиях: колонка длиной 2,4 м с внутренним диаметром 0,3 см, заполненная сорбентом 10 % Реоплекс 400 на инертоне Super, температурное программирование колонки: от 80 (5 минут) до 190С (10 минут) со скоростью нагрева 3 град/мин, температура испарителя и детектора 220С, скорость газа-носителя (азота) - 30 мл/мин, водорода -30мл/мин, воздуха- 300 мл/мин.
Идентификацию компонентов эфирного масла змееголовника молдавского и иссопа лекарственного проводили путём сопоставления времён удерживания компонентов пробы исследуемого эфирного масла с временами удерживания индивидуальных стандартных образцов и временами удерживания компонентов в модельных смесях, а также использовали данные литературы. Количественное содержание компонентов определяли методом внутренней нормализации, для расчета использовали площадь пиков [101, 149].
Эфирное масло змееголовника молдавского содержит монотерпеновые углеводороды, спирты и производные фенола. Образцы масел отличаются по содержанию основных веществ.
Так, в масле из сырья 2004 года (рис. 2) больше содержание лимонена и нерилацетата. Содержание основного компонента, цитраля, в образце 2004 г. меньше в 1,5 раза, чем в образце 2005 года (рис. 3).
Наблюдаются незначительные колебания в количественном содержании отдельных компонентов (табл. 10). Следует отметить, что найденные в ходе эксперимента различия в составе изученных образцов эфирного масла змееголовника молдавского согласуются с данными, приведенными в литературе [101]. Замеченные отличия в составе эфирного масла исследуемого сырья типичны для данного вида растений и связаны с естественными причинами — выращиванием в разные годы. Известно, что значительные изменения в составе эфирных масел связаны с географическим положением мест выращивания пряно-ароматических растений и сроками их сбора. Отмечены различия в составе эфирных масел растений, выращенных на одном поле, но в разные годы [30, 101].
Содержание одного из основных компонентов, определяющего требуемое потребительское качество эфирного масла и присутствующего в значительном количестве - цитраля - увеличивается в генеративных органах и достигает максимума в фазу массового цветения до 22 %. Таким образом, с практической точки зрения целесообразно перерабатывать свежеубранные растения змееголовника молдавского в период начала цветения, массового цветения и конца, цветения, когда в нижней части соцветия завершается процесс семяобразования и стебель приобретает буровато-фиолетовую окраску. Это соответствует высоте растения-70-75 см, а срез сырьевой-массы следует проводить на высоте125-35см, что обеспечит выход эфирного масла в пределах до 0,43 %.
Для изучения эфирного масла иссопа лекарственного использовали те же условия хроматографирования, что и для эфирного масла змееголовника, так как они оказались подходящими для данного эфирного масла.
В результате исследований, было установлено,, что эфирное масло иссопа лекарственного обеих изучаемых форм характеризуется присутствием-15-компонентов (рис: 5\ 6). Нами идентифицированы 10 компонентов эфирного масла иссопа, основным из,которых является-в обеих формах линалоол 42,38 % (форма с синим венчиком) и 51,55 % (форма с розовым венчиком) (табл. 12).
Качественные реакции для травы змееголовника молдавского и иссопа лекарственного
Характерными особенностями строения стебля являются: четырехгранная форма на поперечном сечении в верхней и средней зонах стебля и округлая в нижней зоне; центральный цилиндр представлен склеренхимными волокнами перицик-лического происхождения, внутри стебля образуется полость; тип строения.проводящей системы — непучковый; проводящие ткани кроме проводящих элементов - ситовидных элементов во флоэме и сосудов с кольчато- спиральной, лестничной и пористой перфорацией в ксилеме имеют хорошо развитые механические элементы -волокна.
Хроматографический метод анализа даёт объективную информацию о качественном составе ЛРС и широко используется для его достоверной идентификации [4, 75]. Из хроматографических методов анализа мы.использовали метод ТСХ на пластинке «Sorbfil» как наиболее оптимальный.и рациональный. Он отличается, от других методов хроматографии быстротой, экономичен-с точки зрения использования реактивов и оборудования [75]. Для анализа готовили водно-спиртовые извлечения из образцов сырья по следующей методике:, 0,5 г измельчённого сырья помещают в колбу с притёртой пробкой вместимостью 25 мл, прибавляют 10 мл спирта этилового 70 %. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 минут. Содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр. На хроматографическую пластину «Sorbfil» ПТСХ-П-А размером 5 15 см на линию старта наносят с помощью микрошприца 0,1 мл полученного извлечения из травы змееголовника молдавского в виде полосы длиной 1 см и 0,01 мл спиртового раствора РСО лютеоли-на. Пластину с нанесёнными пробами подсушивают на воздухе в течение 5 минут до исчезновения запаха растворителя и помещают в хроматографическую камеру, предварительно насыщенную в течение 40 минут системой растворителей: н-бутанол-кислота уксусная-вода (4:1:2). Хроматографирование осуществляют восходящим способом при комнатной температуре, время хроматографи-рования 35 минут. После прохождения фронта растворителя, пластинку вынимают и высушивают на воздухе до полного исчезновения запаха растворителя, затем просматривают в УФ-свете при длине волны 360 нм и проявляют спиртовым раствором алюминия хлорида 5 %. Люминесцентно-хроматографическая характеристика водно-спиртового извлечения из травы змееголовника молдавского представлена на рисунке 35. 1 - извлечение из травы змееголовника молдавского; . . 2 - лютеолин Rf 0,88±0,01»; Система: н-бутанол-кислота уксусная-вода (4:1:2) Рисунок 35 — Схема ТСХ водно-спиртового извлечения из травы змеего-" ловника молдавского
На хроматограмме извлечения из змееголовника молдавского видно 6 зон адсорбции. Значение Rf зоны около 0,88 (лимонно-жёлтая) сопоставимо со значением Rf РСО лютеолина. На хроматограмме допускается наличие других зон.
Для идентификации сырья змееголовника молдавского рекомендуется также использовать спектр поглощения извлечения, полученного спиртом этиловым 70 % (см. п. 3.2.5), К 01 =280 нм (лютеолин).
Для хроматографирования извлечения из травы иссопа лекарственного на хроматографическую пластину размером 5 15 см на линию старта наносили с помощью микрошприца ОД мл полученного извлечения в виде полосы длиной 1 см и 0,01 мл спиртового раствора РСО гиперозида. Пластину подсушивали на воздухе в течение 5 минут и хроматографировали при комнатной температуре в системе растворителей: н-бутанол-кислота уксусная-вода (4:1:2); время хроматографирования 35 минут. Затем хроматограмму высушивали до полного исчезновения запаха растворителя, просматривали в УФ-свете при длине волны 360 нм и проявляли спиртовым раствором алюминия хлорида 5 %. Люминес-центно-хроматографическая характеристика водно-спиртового извлечения из травы иссопа лекарственного представлена на рисунке 36. - извлечение из травы иссопа лекарственного;
На хроматограмме извлечения из иссопа лекарственного видно 5 зон ад сорбции, из которых зона со значением Rf около 0,68 (темно-жёлтая) иденти 142 фицируется со значением Rf РСО гиперозида. На хроматограмме допускается наличие других зон. Таким образом, эксперимент показал, что извлечения из травы исследуемых видов имеют индивидуальную люминесцентно-хроматографическую характеристику.
Разработка оптимальных условий методики количественного определения суммы флавоноидов в траве змееголовника молдавского
Наряду с эфирными маслами, основной группой действующих веществ травы змееголовника молдавского являются флавоноидные соединения [106, 107, 111, 128]. В связи с этим, для стандартизации сырья по содержанию суммы флавоноидов нами проведены исследования по разработке оптимальных условий методики количественного определения суммы флавоноидов в траве змееголовника молдавского.
Для анализа сырья змееголовника молдавского нами была выбрана методика дифференциального спектрофотометрического определения суммы флавоноидов непосредственно в извлечениях из сырья. В основу данной методики положена реакция комплексообразования с алюминия хлоридом, которая позволяет проводить непосредственное спектрофотометрирование комплексов флавоноидов с алюминия хлоридом в извлечениях из сырья без дополнительных трудоемких стадий очистки [9]. Реакция является селективной для флавоноидов и дает батохромный сдвиг спектра, что позволяет отделить их от боль-шойгруппы сопутствующих веществ [94, 161]. Алюминия хлорид - доступный, дешевый реактив, хорошо растворимый в воде и спиртах.
Основными этапами разработки оптимальных условий методики количественного анализа являются: оптимизация процесса экстракции; оценка спектров светопоглощения извлечений из сырья без реактива и после проведения реакции с целью определения степени влияния сопутствующих веществ на спектральные характеристики извлечений; разработка оптимальных условий проведения реакции комплексообразо-вания в спектрофотометрируемом растворе [19].
Одной из продолжительных стадий при анализе флавоноидов является их количественная экстракция. Процесс экстракции флавоноидов зависит от степени измельчения сырья, времени экстракции, экстрагента, соотношения сы-рье-экстрагент. Результаты проведенных нами исследований по изучению процесса экстрагирования суммы флавоноидов приведены в таблице 39.
Экспериментальные исследования показали, что максимальное извлечение флавоноидов из травы змееголовника молдавского достигается при степени измельчения сырья 1 мм в течение 120 мин (30+30+30) с использованием спирта этилового 70 %, при соотношении сырья и экстрагента 1:30.
Устойчивое окрашивание извлечений из растительного сырья с алюминия хлоридом наступает через 40 минут и сохраняется в течение 1,5 часов, что достаточно для проведения анализа.
При исследовании спектров поглощения продуктов взаимодействия фла-воноидов в 70 % спиртовых извлечениях из травы змееголовника молдавского с алюминия хлоридом установлено, что максимум светопоглощения комплексов находится в области 393±1 нм и совпадает с максимумом светопоглощения комплекса раствора РСО лютеолина с алюминия хлоридом (рис. 37). При выборе стандартного вещества руководствовались тем, что спектральные характеристики (область максимума поглощения) продуктов реакции суммы флавонои-дов с комплексообразующим реактивом совпадали с максимумом продуктов реакции стандартного образца лютеолина с тем же реактивом.
