Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Род календула {Calendula L.). химический состав и биологическая активность (обзор литературы) 11
1.1. Наукометрический анализ данных литературы 11
1.2. Хеморазнообразие экстрактивных веществ рода Calendula 14
1.3. Биологическая активность препаратов и индивидуальных соединений из Calendula officinalis ЗО
1.4. Методы анализа растительных видов рода Calendula 49
Глава 2. Фенольные соединения с. officinalis. ревизионное исследование химического профиля 54
2.1. Фенольные соединения цветков С. officinalis. Экстракция и фракционирование 55
2.2. Календизиды I и II - новые ацилированные глюкозиды изорамнетина 64
2.3. Антоциановые гликозиды темно-окрашенных сортов С. officinalis 68
2.4. Общая характеристика фенольных соединений листьев С. officinalis 72
2.5. Фенольные соединения листьев С. officinalis. Экстракция и фракционирование 73
2.6. 6 -0-Ванилоил-[3- -глюкопираноза - новый гликозид ванилиновой кислоты 77
2.7. Орган-специфичное распределение фенольных соединений в С. officinalis з
2.8. Фенольные соединения пыльцы С. officinalis 86
2.9. 1,5-Ди-Оферулоилхинная кислота из пыльцы С. officinalis 87
Глава 3. Применение микроколоночной вэжх и твердофазной экстракции / спектрофотометрии для количественного анализа С. officinalis 92
3.1. Количественный анализ фенольных соединений в цветках и листьях С. officinalis методом микроколоночной ВЭЖХ-УФ... 92
3.2. Применение ТФЭ / СФМ для одновременного анализа флавоноидов и фенилпропаноидов в цветках С. officinalis 104
Глава 4. Совершенствование методов стандартизации сырья "ноготков цветки" и "трава календулы " 119
4.1. Обоснование выбора маркерных групп соединений для стандартизации сырья С. officinalis 119
4.2. Стандартизация сырья "Ноготков цветки" 123
4.3. Стандартизация сырья "Календулы трава" 135
Глава 5. Влияние различных факторов на накопление фенольных соединений в с. officinalis в открытом грунте 144
6.1. Влияние уровней минерального питания на накопление фенольных соединений в открытом грунте 144
6.2. Влияние предпосевной обработки семян на накопление фенольных соединений в открытом грунте 150
6.3. Влияние постпосевной обработки сеянцев микроэлементами на накопление фенольных соединений в открытом грунте 152
Глава 6. Материал и методы 158
6.1. Растительное сырье 158 6.2. Фармакогностические методы 158
6.3. Аналитические методы разделения 158
6.4. Препаративные методы разделения 161
6.5. Физико-химические методы 162
6.6. Химические методы 163
6.7. Химические реакции 163
6.8. Статистические методы 164
Общие выводы 166
Список сокращений и условных обозначений 169
Список литературы
- Биологическая активность препаратов и индивидуальных соединений из Calendula officinalis
- Фенольные соединения листьев С. officinalis. Экстракция и фракционирование
- Применение ТФЭ / СФМ для одновременного анализа флавоноидов и фенилпропаноидов в цветках С. officinalis
- Влияние предпосевной обработки семян на накопление фенольных соединений в открытом грунте
Введение к работе
Актуальность исследования. Calendula officinalis L. (календула лекарственная) – известное лекарственное растение семейства Asteraceae, имеющее более чем вековой опыт применения в официнальной медицине большинства стран мира. Данный растительный вид относится к числу многотоннажного культивируемого сырья, занимающего по площади выращивания второе место, уступая только ромашке аптечной (Куркин, 2012). Наукометрические исследования свидетельствуют о постоянно растущем интересе к изучению C. officinalis со стороны ученых различных отраслей науки – биологов, фармакологов, фитохимиков и др.
Анализ данных литературы о химическом составе данного вида свидетельствует о его разнообразии; известно о присутствии моно-, сескви- и тритерпеноидов и их гликозидов, стероидов, каротиноидов, простых фенолов, бензойных кислот, фенилпропаноидов, флавоноидов, кумаринов и алифатических соединений (Swiatek, Gora, 1978; Komissarenko et al., 1988; Vidal-Ollivier et al., 1989; Matysik et al., 2005). Несмотря на объем имеющейся химической информации, наблюдается тенденция в «однообразии» исследовательских работ, посвященных в большинстве случаев изучению тритерпеноидов, каротиноидов и эфирного масла; так, 74% из известных в C. officinalis соединений относятся к терпеновым производным и менее 8% – к фенольным соединениям, 3% из которых – это флавоноиды (12 соединений). Данные о фенольных соединениях листьев C. officinalis ограничены сведениями о присутствии в них изорамнетина, изорамнетин-3-O--D-глюкозида и нарциссина (Friedrich, 1962), что не отражает реальный химический профиль. Следует отметить, что, несмотря на объем имеющейся информации, сведения о фенольных соединениях C. officinalis, культивируемой в России, ограничены небольшим числом публикаций, а изучение C. officinalis, культивируемой в Бурятии, ранее не проводилось.
В России к числу разрешенных к использованию видов лекарственного сырья C. officinalis относятся “Ноготков цветки” (ГФ XI изд., ФС №5) и “Календулы трава” (ТУ 9375-090-04868244-98). Нормативные документы, принятые в XX в. либо не содержат разделов по качественной и количественной стандартизации сырья по действующим веществам (“Ноготков цветки”), либо включают устаревшие рекомендации (“Календулы трава”), которые не могут быть использованы для адекватного анализа сырья. Данные обстоятельства указывают на необходимость пересмотра разделов “Подлинность” и “Количественное определение”.
Согласно современным требованиям надлежащей лабораторной практики (GLP) к лекарственным средствам, необходимым условием является разработка адекватной и правильной системы контроля качества растительного сырья и с применением высокоэффективных и чувствительных методов анализа. Опыт ряда ведущих мировых Фармакопей, а также частных исследований в области анализа сырья и готовых лекарственных форм из C. officinalis свидетельствует
об отсутствии правильных и селективных методов анализа фенольных соединений данного растительного вида.
Таким образом, углубленные химические исследования С. officinalis, а также разработка новых методов анализа данного официнального растительного вида являются актуальными в связи с необходимостью расширения фитохимическй информации, а также обусловлены современными требованиями фармацевтической науки и практики.
Целью исследования явилось химическое изучение фенольных соединений цветков и листьев календулы лекарственной, культивируемой в республике Бурятии, и совершенствование методов стандартизации сырья.
Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Изучить состав фенольных соединений цветков и листьев С. officinalis, культивируемой в республике Бурятии.
-
Создать унифицированные методики определения флавоноидов и фенилпропаноидов в С. officinalis с применением методов микроколоночной ВЭЖХ и спектрофотометрии.
-
Определить оптимальные критерии качественной и количественной стандартизации сырья “Ноготков цветки” и “Календулы трава”.
-
Изучить влияние различных факторов на накопление фенольных соединений в С. officinalis в условиях открытого грунта республики Бурятия.
Научная новизна. В результате химических исследований С. officinalis, культивируемой в Бурятии, было выделено и идентифицировано 63 вещества, из которых 33 впервые для данного вида, и три новых природных соединения, в т.ч. календизид I [изорамнетин-3-(9-(2-ацетил-)-Р->-глюкопиранозид], календизид II [изорамнетин-3-(9-(2, 6-диацетил-)-Р->-глюкопиранозид] и 6-(9-ванилоил--і>глюкопираноза. Впервые для С. officinalis установлено присутствие антоцианов, в составе которых выявлено 8 соединений гликозидной природы, производных цианидина, дельфинидина, мальвидина, пеонидина, пеларгонидина и петунидина. Изучены фенольные соединения пыльцы С. officinalis, и выявлено, что их состав близок к таковому краевых цветков, и отличается наличием 1,5-ди-(9-ферулоилхинной кислоты, ранее полученной синтетическим путем и впервые выделенной из природного объекта. Впервые показана возможность разделения фенольных соединений с применением микроколоночной обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (МК-ВЭЖХ) с использованием мицеллярных подвижных фаз.
Практическая значимость. Разработана новая методика количественного анализа 14 соединений (5 фенилпропаноидов и 9 флавоноидов) в С. officinalis методом мицеллярной МК-ВЭЖХ с применением колонки ProntoSIL-120-5-C18 (275 мм) и градиентной элюентной системы [0.2 М LiClO4 в 0.006 M HClO4 -0.01 М додецилсульфат натрия в воде (1:1)]-ацетонитрил. Разработана новая методика количественного анализа суммарного содержания флавоноидов и фенилпропаноидов в С. officinalis с применением комбинированного метода твердофазной экстракции / спектрофотометрии. Разработана унифицированная
схема выбора маркерных групп соединений для стандартизации растительного сырья. В проект ФС “Ноготков цветки” предложено ввести новые разделы “Подлинность”, “Количественное определение” и числовые показатели “суммарное содержание флавоноидов не менее 1.2%” и “суммарное содержание фенилпропаноидов не менее 0.2%”. В проект ФС “Календулы трава” предложено ввести новый раздел “Подлинность” и числовые показатели “суммарное содержание флавоноидов не менее 0.5%” и “суммарное содержание фенилпропаноидов не менее 0.5%”. С целью повышения содержания фенольных соединений при культивации C. officinalis в республике Бурятия рекомендовано сочетанное применение минерального (N60P90K60) и органического удобрений (30 т/га).
Степень внедрения. Теоретические положения и результаты экспериментальных исследований, изложенные в диссертационной работе, используются в учебном процессе кафедры фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО «Бурятский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
На защиту выносятся:
-
Результаты исследования состава фенольных соединений цветков и листьев рода C. officinalis, культивируемой в республике Бурятии.
-
Характеристика новых природных соединений – календизидов I и II, и 6-O-ванилоил--D-глюкопиранозы, выделенных из C. officinalis.
-
Орган-специфичное распределение фенольных соединений в C. officinalis.
-
Методы количественного анализа флавоноидов и фенилпропаноидов с применением микроколоночной ВЭЖХ-УФ и твердофазной экстракции / спектрофотометрии.
-
Унифицированная схема выбора маркерных групп соединений для стандартизации сырья на примере C. officinalis.
-
Результаты исследования влияния различных факторов на накопление фенольных соединений в C. officinalis в открытом грунте. Апробация работы. Основные положения и результаты работы были
представлены на: V Всероссийской конференции с международным участием “Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья” (Барнаул, 2012), VI Международной научной конференции “Traditional Medicine: Ways of Integration with Modern Health Care” (Ulan-Ude, 2013), VIII Всероссийской научной конференции “Химия и технология растительных веществ” (Калининград, 2013), X Международном симпозиуме “Chemistry of Natural Compounds” (Bukhara, 2013).
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Работа выполнена в соответствии с программой и планом научно-исследовательских работ ФГБУН “Институт общей и экспериментальной биологии” СО РАН по проекту № 146 “Разработка лекарственных и профилактических препаратов для медицины. Фундаментальные основы и реализация”, утвержденным президиумом СО РАН.
Работа выполнена в рамках научно-исследовательских программ и при финансовой поддержке гранта РФФИ №12-03-31547(мол_а)
“Структурно-функциональное исследование низкомолекулярных фенольных соединений растительного происхождения как перспективных антихолинэстеразных агентов” (2012-2013 гг.); гранта РГНФ №12-06-12026(в) “Создание АБД «Тибетская медицина» (информационно-аналитической структуры) как инструмента для комплексного изучения наследия тибетской медицины” (2012-2014 гг.); проекта СО РАН Центры новых медицинских технологий “Структурно-функциональное исследование низкомолекулярных фенольных соединений как антитирозиназных агентов” (2012-2013 гг.).
Личный вклад автора в получении научных результатов. Автором диссертационной работы проведен поиск и анализ данных по теме исследования, осуществлены планирование экспериментов, сбор данных; соискателем непосредственно проведены все химические и аналитические эксперименты. Согласно сформулированным задачам подготовлены доклады, тезисы и статьи, оформлена диссертация, автореферат, представленные к защите.
Публикации. По результатам диссертационной работы опубликовано 8 научных работ, в том числе 4 статьи - в изданиях, рекомендованных ВАК МОиН РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 205 печатных страницах, состоит из введения, обзора литературы, 5 глав экспериментальной части, заключения, списка цитируемой литературы, состоящего из 198 источников, в том числе 192 - на иностранных языках, и включает 24 рисунка, 51 таблицу и 2 приложения.
Биологическая активность препаратов и индивидуальных соединений из Calendula officinalis
Календула (ноготки; Calendula L.) - род травянистых растений семейства Астровые (Asteraceae), представители которого широко применяются с лекарственной и декоративной целью. Учитывая тот факт, что к настоящему времени в экспериментальной науке накоплен значительный объем научной информации о данном роде, нами проведено наукометрическое исследование имеющихся сведений. Для проведения анализа были использованы ресурсы научной базы данных Scopus (www.scopus.com) с привлечением критерия "ключевое слово" в разделах названия статей, резюме, списке авторов, тип публикации и др.
Исследования показали, что количество статей, касающихся исследования видов Calendula за период 1950-2013 гг. составило около 1200 единиц (Рисунок 1.1). 1 Olennikov D.N., Kashchenko N.I. Genus Calendula. Chemical constituents, biological activity and methods of analysis, Chem. Biodiv. (2014, in press). Статистические исследования указывают на экспоненциальный характер роста научного интереса к Calendula; значение коэффициента детерминации (/") для «кривой интереса» (Y = IE- 61-е0 0717 А) составило величину около 0.89, что свидетельствует о достоверности данных утверждений. Наибольший научный вклад в изучение Calendula, на настоящий момент, был внесен в течение 2000-2009 гг. (около 40% публикаций), однако, учитывая тот факт, что за 4 года 10-х годов XXI века было выполнено около 30% исследований по данной теме, то картина может измениться уже в ближайшем будущем.
В число научных направлений, в рамках которых проводятся исследования Calendula, преимущественное положение занимают сельскохозяйственные и биологические науки (около 24% публикаций), фармакология/токсикология (около 21%о) и медицинские науки (около 17%) (Таблица 1.1). Следует отметить, что заметное место занимают исследования в области биохимии и смежных наук, химии и науки об окружающей среде.
Распределение публикаций, посвященных Calendula, по отраслям знаний Отрасль знаний % публикаций Сельскохозяйственные и биологические науки 23.8 Фармакологи / токсикология 20.9 Медицина 17.1 Биохимия, генетика, молекулярная биология 12.5 Химия 9.3 Науки об окружающей среде 4.6 Иммунология и микробиологи 2.5 Ветеринария 1.5 Стоматология 0.6 Неврологические науки 0.2 О перспективности исследований в данной области свидетельствует высокий рейтинг журналов (IF = 0.6-3.1), публикующих работы, посвященные Calendula (Таблица 1.2). Более 96% публикаций представляют собой полные исследовательские публикации и около 2% - главы в книгах. Таблица 1.2. - Распределение публикаций, посвященных Calendula, по журналам Журнал Количество публикаций IF (2012) Phytochemistry 42 3.050 Journal of Ethnopharmacology 22 2.755 Phytotherapy Research 19 2.068 Chemistry of Natural Compounds 17 0.599 Acta Biochimica Polonica 17 1.185 Industrial Crops andProducts 12 2.468 Planta Medica 10 2.348 Наибольшее количество работ выпущено авторами из США (120), Бразилии (94), Индии (88), Германии (86) и Польши (78); исследовательские группы из России занимают 14 место в рейтинге публикаций (31). Из авторов следует отметить Kasprzyl Z. (33), Janiszowska W. (32), Szakiel A. (17), Bransard G. (10), Зинкевич Е.П., Вечерко Л.П. (8), Wilkomirzski В. (6), Kuttan R. (6) и Pizza С. (6).
В число 10 наиболее цитируемых статей с количеством цитирований более 100 входят работы , посвященные исследованию химического состава (тритерпеноиды, липиды), биологической активности (противовоспалительное, антиоксидантное, гипогликемическое), а также результатам клинических исследований и выявлению аллергических свойств (Таблица. 1.3).
Наиболее цитируемые статьи, посвященные Calendula, за период 1954-2013 гг. Статья Цит. _ _ Delia Loggia R., et al. The role of triterpenoids in the topical anti-inflammatory activity of 126 Calendula officinalis flowers [53] 2 по состоянию на 1.11.2014 г. Продолжение таблицы 1. 1 2 Pommier P., et al. Phase III randomized trial of Calendula officinalis compared with trolamine for the prevention of acute dermatitis during irradiation for breast cancer [149] 120 Chaparzadeh N., et al. Antioxidative responses of Calendula officinalis under salinity conditions [44] 98 Zitterl-Eglseer K., et al. Anti-oedematous activities of the main triterpendiol esters of marigold (Calendula officinalis L.) [212] 69 Yoshikawa M., et al. Hypoglycemic, gastric emptying inhibitory, and gastroprotective principles and new oleananeype triterpene oligoglycosides, calendasaponins А, В, C, and D, from egyptian Calendula officinalis [208] 62 Kalvatchev Z., et al. Anti-HIV activity of extracts from Calendula officinalis flowers [83] 54 Cetkovic G.S., et al. Antioxidant properties of marigold extracts [39] 53 Hamburger M., et al. Preparative purification of the major anti-inflammatory triterpenoid esters from Marigold (Calendula officinalis) [75] 49 Campos L.M.A.S., et al. Experimental data and modeling the supercritical fluid extraction of marigold (Calendula officinalis) oleoresin [36] 46 Reider N., et al. The seamy side of natural medicines: Contact sensitization to arnica (Arnica montana L.) and marigold (Calendula officinalis L.) [160] 45 Результаты наукометрического анализа свидетельствуют о необходимости проведения расширенных экспериментальных работ и актуальности данного направления.
Согласно литературным данным наиболее исследованными являются 3 вида растений из рода Calendula L. - С. officinalis, С. arvensis и С. persica. Среди этих видов С. officinalis является наиболее изученным видом. За период 1952-2013 гг. для рода Calendula было установлено присутствие около 400 соединений (1-388), включая моно-, сескви-, тритерпеноиды, сесквитерпеновые гликозиды, стероиды, каротиноиды, фенольные и алифатические соединения. Большинство экстрактивных веществ было выделено из надземной части и цветков данного рода. Результаты по систематизации данных о химическом составе рода Calendula представлены в таблице 1.4
Терпеноиды. 42 монотерпена (1-42), 106 сесквитерпенов (43-148), 17 сесквитерпеновых гликозидов (149-165), 20 стероидов (166-185), 71 тритерпеноид (186-256) было выделено из цветков, листьев, надземной части и корней С. officinalis, С. arvensis и С. persica.
Следует отметить, что виды рода Calendula являются источником редких гликозидов сесквитерпенового ряда, содержащих в составе углеводной части фукозу и хиновозу, ацилированных по положению 2"-0- остатками 4-метилсенециевой и ангеликовой кислот.
Тритерпеновые соединения рода Calendula присутствуют в растениях, как в свободном состоянии, так и в виде эфиров с жирными кислотами (лауриновой, миристиновой, пальмитиновой) или спиртами (метанол, я-бутанол), а также в гликозидированной форме. Выделенные соединения относятся к 6 структурным рядам тритерпенового скелета: производные даммарана (186), циклоартана (187, 188), лупана (189-194), урсана (195-208), олеанана (209-254) и тирукаллана (255, 256). Наиболее крупной группой производных является группа олеанана, включающая 46 соединений.
В С. officinalis выявлено присутствие двух соединений, относящихся к редким 3,4-се/со-терпеновым спиртам, дериватам так называемого тирукаллана (3,4-се/со-кукурбитана или 3,4-се/со-19(10—»9)абео-еуфана), гелианол (255) и тирукалла-7,24-диенол (256). Ранее оба соединения были выявлены в трубчатых цветках Helianthus annus L. [16].
Проведенные наукометрические исследования показали наличие ряда несоответствий в названиях некоторых тритерпеноидных гликозидов; так для отдельных соединений используется несколько альтернативных названий.
Впервые 6 гликозидов олеаноловой кислоты (221, 224, 226, 229, 231, 232), содержащих по положению С-3 агликона остаток глюкуроновой кислоты, были выделены из цветков С. officinalis и охарактеризованы Kasprzyk Z. и Wojciechowski Z. в 1967 г., давшие им названия глюкозиды A-F [87].
Фенольные соединения листьев С. officinalis. Экстракция и фракционирование
Ранозаживляющее действие. Гексановый и этанольный экстракты из цветков С. officinalis стимулировали пролиферацию и миграцию фибробластов (10 мкг/мл экстракта увеличивало число клеток на 64.35% и 70.53% соответственно). Фарадиол-3-О-миристат и фарадиол-3-0-пальмитат обнаруживали сопоставимые индексы стимуляции при концентрации 50 мкг/мл [71]. Фибробласты, обработанные 10 мкл гомеопатического средства «С. officinalis З СН», мигрировали через границы повреждения к центральной области раны. Цитоплазменные процессы фибробластов изменяли их направление от краев раны к центру. Незначительное проникновение фибробластов в центральную область раны можно было наблюдать на 3 день у клеток, обработанных экстрактом, с последующим лазерным облучением [35].
Гель из цветов С. officinalis улучшает заживление воспалений слизистой оболочки рта у хомяков, вызванных 5-флуорацилом. На 15 день исследования 10% геля наблюдалась полная эпителизация и восстановление соединительной ткани. Микро- и макроскопические показатели воспаления слизистой оболочки рта были снижены в группе 5 и 10% геля по сравнению с контрольной и базовой группой [183].
Этанольный экстракт из цветков С. officinalis (200 мг/кг) обнаружил положительные результаты в отношении термических ожогов у крыс. Значения коллаген-гидроксипролина (с 6.99 до 13.26 мг/г) и гексозамина (с 2.96 до 3.72 мг/г) значительно возросли, в то время как уровни гаптоглобина (с 8.77 до 5.03 г/л) и сывороточного орозомукоида (с 2.18 до 0.97 г/л) были значительно снижены у животных, обработанных экстрактом. Перекиспое окисление липидов достигло своей нормы на 10 день у обработанных экстрактом животных. Значения щелочной фосфатазы, аланин- и аспартат-трансаминаз были значительно снижены в группе обработанных животных [43]. Ранозаживляющая активность этанольного экстракта (1%) из цветов С. officinalis была изучена на моделях кожных повреждений макроскопическим, морфометрическим и гистологическим методами. Серозный экссудат начал выделяться на 4 день у группы, использующей экстракт (1), и на 7 день у контрольной группы (2). Корочки начали образовываться с 3 дня, в группе 1 они были более тонкими и влажными. Микроскопическое исследование группы 1 на 4 и 7 дни показало значительное уменьшение количества фибрина (в ср. 1.0 и 2.0) и гиперемии (в ср. 1.0 и 1.5) в сравнении с группой 2 в те же дни (ср. 3.0 и 2.5). Значительное увеличение количества коллагена в группе 1 по сравнению с группой 2 наблюдалось на 4 и 7 дни (8.27 и 6.33 против 5.33 и 4.31), что характеризует фиброплазию [137].
Было оценено влияние экстракта из цветов С. officinalis на заживление ран у крыс при местном применении. На 8 день эксперимента процент затягивания раны был 90% для группы, принимавшей экстракт, и 51.1% для контрольной группы. Количество дней, необходимых для реэпителизации, составило 17.7 для контрольной группы; применение экстракта в дозе 20 или 100 мг/кг снижало этот срок до 14 и 13 дней соответственно [154].
Было изучено влияние различных концентраций геля из цветков С. officinalis (5, 7 и 10%) на содержание коллагена и гидроксипролина в коже крыс. Полученные результаты свидетельствуют, что содержание гидроксипролина (г. на 100 г. сухого веса) в группе, обработанной 7% гелем, было значительно выше, чем в контрольной группе на 14, 21 и 45 дни эксперимента (11.06, 11.14, 11.16 против 7.0, 7.89, 7.97). Содержание коллагена (г. на 100 г. сухого веса) было также выше в группе 7% геля из экстракта С. officinalis (88.52, 89.15 и 89.34 против 56.53, 63.15, 69.13) [114]. Была оценена терапевтическая эффективность мази из цветков С. officinalis (1.5% суммарного экстракта) на частоту и тяжесть протекания пеленочного дерматита у детей. Снижение частоты наблюдалось в группе, принимающей экстракт (Р = 0.001). Никаких неблагоприятных результатов от применения экстракта не было замечено [134].
Мазь из цветков С. officinalis применялась для лечения кожных ран у буйволов в сравнении с контролем, препаратом «Charmil» и желатиновыми гранулами. На 3 день эксперимента сосудистые и клеточные изменения были заметнее у животных, обработанных экстрактом. На 7 день в ранах, обработанных желатиновыми гранулами, обнаружили выраженную активность ангиобластов и фибробластов [22].
Была исследована терапевтическая эффективность мази из цветков С. officinalis на эпителизацию венозных язв нижних конечностей. В экспериментальной группе общая поверхность всех язв на начало лечения составляла 67.544 мм" (69.722 мм" в контрольной группе). После 3 недели эксперимента общая поверхность язв сократилась до 39.373 см" (уменьшение на 41.71%) против 58.743 мм" в контрольной группе (14.52%). У 7 пациентов из экспериментальной группы была достигнута полная эпителизация (против 4 в контрольной группе) [59].
1% крем из цветков С. officinalis обладал ранозаживляющим действием. Гистологические и клинические исследования показали, что крем способствовал рубцеванию ран на коже крыс. Кроме того, он не обладал раздражающим эффектом после применения его наружно и нанесения на внутреннее веко (индекс раздражительности 0 и 0.83% соответственно) [107].
Выявлено, что крем, содержащий масло из цветков С. officinalis, обладал солнцезащитным действием. Фактор защиты от солнца (SPF) был изучен методом УФ-спектрофотометрии и составил 14.84. Состав крема: стеариловый спирт 15%, пчелиный воск 8% , сорбитмоноолеат 1.25%, масло С. officinalis 5%, раствор сорбита 7.5%, полисорбат 80 3.75%, метилпарабен 0.025%, пропилпарабен 0.015%), деионизированная вода до 100% [109].
Применение ТФЭ / СФМ для одновременного анализа флавоноидов и фенилпропаноидов в цветках С. officinalis
Несмотря на широкое использование цветков С. officinalis, листья данного растительного вида не нашли практического применения в настоящее время. Так как продуктивность листьев намного выше продуктивности цветков, то возможно рассматривать листья как новый источник растительного сырья. В результате химических исследований в листьях С. officinalis было определено наличие различных классов химических веществ. Изорамнетин, изорамнетин-3-OP-D-глюкопиранозид и нарциссин [70] относятся к фенольным соединениям. Ранее было доказано, что фенольные соединения из экстрактов С. officinalis отвечают за наличие антиоксидантной и антихолинэстеразной активности [62]. Каротиноиды представлены 12 соединениями, доминирующими являются лютеин, Р-каротин и виолаксантин; общее содержание каротиноидов в листьях С. officinalis, выращиваемой в Болгарии, составляло 0.85 мг/г [26]. Самыми изученными группами соединений в листьях С. officinalis являются тритерпеновые гликозиды и стеролы. В молодых листьях обнаружено присутствие холестанола, кампестанола, стигмастанола и производных клеростерола в свободной, этерифицированной и гликозидированной форме [11] Моно-, ди-, три- и тетраглюкозиды олеаноловой кислоты, полученные из листьев С. officinalis, выращенной в Польше, проявляли антибактериальную и противопаразитарную 4 Olennikov D.N., Kashchenko N.I. Componential profile and amylase inhibiting activity of phenolic compounds from Calendula officinalis L. leaves, The Scientific World Journal, 2014, art. ID 654193(2014). активность [179]. Эфирное масло из листьев С. officinalis содержит ряд компонентов, доминирующими среди которых являются сесквитерпены (т мууролол, 5-кадинен) и монотерпены (а-туйен) [121]. Нейтральные соединения, фосфо- и гликолипиды также определялись в липидном комплексе [188]. Предварительные исследования химического состава листьев С. officinalis были проведены для 9 видов сырья, широко культивируемого на территории России. Эти разновидности характеризуются высокой продуктивностью и простотой выращивания. В результате было установлено, что содержание флавоноидов в изученных образцах листьев изменялось с 8.49 ( Indian Prince ) до 13.08 мг/г ( Radio), в то время как общее содержание фенольных соединений варьировалось от 29.21 ( Russian Size) до 50.24 мг/г ( Radio) (Рисунок 2.8). ES FD G GHO IP R RBC RS TOR Рисунок 2.8 - Общее содержание флавоноидов (черный; F1) и общее содержание фенольных соединений (серый; ТРС) в 9 сортах листьев С. officinalis. Сорта: Egypt Sun (ES), Flame Dance (FD), Geisha (G), Green Heart Orange (GHO), Indian Prince (IP), Radio (R), Red Black Centered (RBC), Russian Size (RS), Touch of Red (TOR). Над столбцами: содержание, мг/г.
Высушенные измельченные листья С. officinalis (1.65 кг) экстрагировали трижды 60% этанолом при 80 С, объединенные извлечения концентрировали под вакуумом (выход экстракта 462.7 г.). Экстракт повторно суспендировали в воде (1:6, v/v) и последовательно обрабатывали гексаном, хлороформом, этилацетатом и н-бутанолом. Органический слой высушивали под вакуумом до остатка гексановой (F1), хлороформной (F2), этилацетатной (F3) и бутанольной фракции (F4) 49.5, 79.4, 59.2 и 204.6 г соответственно. Фракцию F2 (54 г.) поместили на колонку с Сефадекс LH-20 (6 х 100 см) и последовательно элюировали СНОз МеОН (100:0 0:100), получив 10 фракций (фр. F2/1 - F2/10). Фр. F2/2 - F2/3 объединили и поместили на колонку с силикагелем (3 х 50 см), последовательно элюировали СНСЬ-МеОН (100:0 70:30); полученные 10 фракций (фр. F2/2-3/1 F2/2-3/10), разделяли при помощи ТСХ (растворитель — толуол-этилацетат муравьиная кислота 6:3:1), получили умбеллиферон (57; 6 мг), эскулетин (58; 14 мг) и скополетин (61; 5 мг) [123]. Фр. F2/5 - F2/7 объединили и поместили на колонку с силикагелем (2.5 х 70 см), элюировали СНС13-МеОН (100:0— 70:30), получили кверцетин (19 мг) и изорамнетин (9 мг) [122]. Фр. F3 (50 г) нанесли на колонку с XAD7HP (500 г.) и элюировали водой (8 л.), 40% этанолом (12 л.) и 90% этанолом (10 л.). Элюаты высушили под вакуумом, получили остатки водной (F3-1), 40% этанольной (F3-2) и 90% этанольной фракции (F3-3) 1.3, 37.9 и 6.4 г. соответственно. Фр. F3-2 поместили на полиамидную колонку (5 х 120 см), элюировали Н2ОМеОН (100:0—»0:100), получили 10 фракций (фр. F3-2/l [)p.F3 2/10). Фр. F3-2/2 - F3-2/3 разделяли на колонке с Sephadex LH-20 (4 х 140 см) при элюировании МеОН-Н20 (100:0—»0:100), получили кофейную кислоту (24 мг) [125], 3,5-ди-О- (184 мг), 1,5-ди-О- (56; 62 мг) и 4,5-ди-Окофеилхинную кислоту (37 мг) [166]. Фр. F3-2/4 - F3-2/7 разделяли на колонке RP-Si02 (4 х 140 см), элюировали FbO-MeCN (100:0— 0:100), получили З-О-кофеилхинную кислоту (215 мг) [125], эскулин (59; 28 мг), цихориин (60; 14 мг) [101], изокверцитрин (182 мг) и изорамнетин-3-0-Р-Г глюкопиранозид (63 мг) [127]. Фр. F3-3 разделили при помощи препаративной ВЭЖХ [Summit ВЭЖХ-система с УФ-Вид детектором (Dionex), колонка LiChrosorb RP-18 (4.6 х 250 мм, 5 /ит, Merck), Т 35С, скорость потока 1 мл/мин, линейный градиент 5-40% MeCN в Н20 90 мин, детектор 360 нм; 5 повторов], получили кверцетин-3-0-(6"-ацетил)-(3-В-глюкопиранозид (54 мг) [200] и изорамнетин-3-0-(6 "-ацетил)- P-D-глюкопиранозид (25 мг). Фр. F4 (120 г) нанесли на колонку с XAD7HP (800 г) и элюировали водой (24 л), 40% этанолом (28 л) и 90% этанолом (5 л). Элюаты высушили под вакуумом и получили остатки водной (F4-1), 40% этанольной (F4-2) и 90% этанольной (F4-3) фракций 54.9, 38.4 и 12.5 г соответственно. Фр. F4-2 нанесли на полиамидную колонку (5 х 120 см), элюировали Н20-МеОН (100:0— 0:100), получили 10 фракций (F4-2/1 - F4-2/10). Фр. F4-2/1 - F4-2/2 разделяли при помощи препаративной ВЭЖХ [Summit ВЭЖХ-система с УВ-Вид детектором Dionex, колонка LiChrosorb RP-18 (4.6 х 250 мм, 5 мкм, Merck), Т 35С, скорость потока 1 мл/мин, линейный градиент растворителя 0-10% MeCN in НоО 90 мин, детектор 280 nm; 4 повторности] и получили \ -0-п-гидроксибензоил-р-О-глюкопиранозу (51; 24 мг) [57], 6 -0-и-гидроксибензоил-[3-D-глюкопиранозу (52; 11 мг), 1 -О-протокатехоил-Р-Э-глюкопиранозу (53; 18 мг), б -О-протокатехоил-Р-О-глюкопиранозу (54; 14 мг) [130], Г-(9-ванилоил-Р-0-глюкопиранозу (55; 18 мг) [47] и соединение 62 (27 мг). Фр. F4-2/4 - F4-2/6 разделяли на колонке Sephadex LH-20 (4 х НО см), элюируя МеОН-ІЬО (100:0—»0:100), получили рутин (34 мг), нарциссин (24 мг) [127] и тифанеозид (23 мг)[198].
Влияние предпосевной обработки семян на накопление фенольных соединений в открытом грунте
Следует отметить, что на величину ошибки непосредственное влияние оказывает содержание фенилпропаноидов в сырье; так, для сорта Flame Dancer , для которого наблюдается максимальное значение ошибки (+20.4%), соотношение флавоноидов и фенилпропаноидов составило 1.6:1, а для сорта Egypt Sun (ошибка +5.0%) - 25:1.
Данные регрессионного анализа подтверждают данное явление -зависимость ошибки определения флавоноидов от соотношения суммарного содержания флавоноидов / фенилпропаноидов в цветках С. officinalis описывается уравнением линейной регрессии (У = -0.675 X + 20.103) с величиной коэффициента детерминации г = 0.8483 (Рисунок 3.66). Применение нарциссина в качестве референтного вещества снижает показатели ошибки на 3-6%, но также не позволяет добиться правильных результатов.
Следует учесть, что на химический состав лекарственного растительного сырья влияет множество различных факторов (сорт, условия культивирования и хранения и др.), т.е. оно не является матрицей с постоянным составом, даже в пределах одного ботанического вида. В этой связи выбор неких унифицированных условий анализа, позволяющих учесть описанные выше недостатки и добиться получения правильных результатов, не представляется возможным.
Учитывая недостатки существующих методов спектрофотометрического анализа цветков С. officinalis, нами рассмотрена возможность создания удобного метода, позволяющего проводить правильное определение количественных показателей для данного вида растительного сырья. В качестве альтернативного подхода для решения данной проблемы предлагается известный методический подход, объединяющий сорбционные методы разделения классов фенольных соединений, в качестве которого выбрана твердофазная экстракция на полиамидном патроне, и спектрофотометрический метод детектирования, объединенные под общим названием твердофазная экстракции / спектрофотометрия (ТФЭ/СФМ).
Общая процедура ТФЭ заключается в нанесении пробы на полиамидный патрон, предварительно прекондиционированный этанолом и водой, и последующей элюцией фракций последовательно водой, 95% этанолом и 0.5% раствором NH3 в 95% этаноле. Вода позволяет удалить несорбируемые компоненты, такие как углеводы, аминокислоты и другие водорастворимые компоненты, ухудшающие качество последующего анализа. В результате элюции 95% этанолом и 0.5% раствором NH3 в 95% этаноле можно получить фракции, содержащие флавоноиды (агликоны и гликозиды) и фенилпропаноиды, соответственно.
Анализ спектров поглощения элюатов после ТФЭ свидетельствует о значительном улучшении аналитических параметров для спиртовых извлечений из цветков С. officinalis. Водная фракции не содержит компонентов, поглощающих в диапазоне длин волн 300-400 нм, и не дает положительные реакции на флавоноиды и фенилпропаноиды, что подтверждается данными ВЭЖХ (Рисунок 3.7а). Для спиртового элюата характерно наличие спектра поглощения, типичного для флавонол-гликозидов (Рисунок 3.7а). Сравнительный анализ хроматограмм необработанного извлечения и данной фракции указывает на переход всех маркерных флавоноидов в элюат (Рисунок 3.76). Аналогичная картина наблюдается для щелочного элюата, содержащего все основные производные кофейной кислоты. Таким образом, применение ТФЭ на полиамиде позволяет разделить две доминирующие группы фенольных соединений, входящих в состав цветков С. officinalis.
Данные количественного анализа элюатов свидетельствуют практически о количественном определении групп флавоноидов и фенилпропаноидов (Таблица 3.9). Ошибка определения в сравнении с методом ВЭЖХ составила для флавоноидов -0.76 - +2.03%, фенилпропаноидов - -0.34 - +1.45%, что свидетельствует об удовлетворительной правильности метода.
Валидационный анализ показал, что зависимость оптической плотности от концентрации индивидуальных соединений в диапазоне концентрации 5-150 мкг/мл описывалась линейной регрессией со значением коэффициентов детерминации 0.9978-0.9982 (Таблица 3.10). Величины пределов детектирования (LOD) / количественного определения (LOQ) нарциссина и 3-0-кофеилхинной кислоты составили 2.54 / 7.70 и 0.84 / 2.55 мкг/мл, соответственно. Показатели воспроизводимости и правильности не превышали 2.2%, а точность методики, определенная для пяти уровней концентрации (80-120%) составила 98.20-102.14%. Для групп соединений показатели воспроизводимости и правильности не превышали 3%, а точность составила 97.34-102.54%. Валидационные исследования показали, что разработанная методика соответствует критериям приемлемости и может быть использована для аналитических целей.
![Совершенствование методов стандартизации лекарственных средств на основе корневищ радиолы розовой [Электронный ресурс]](/i/i/4381/176171.png "Совершенствование методов стандартизации лекарственных средств на основе корневищ радиолы розовой [Электронный ресурс] Петрова Елена Сергеевна")
