Совершенствование методов стандартизации лекарственных средств на основе корневищ радиолы розовой [Электронный ресурс] Петрова Елена Сергеевна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Современное состояние исследований в области изучения родиолы розовой 11

1.1. Историческая справка 12

1.2. Ботанико-фармакогностическая характеристика 13

1.3. Химический состав родиолы розовой 17

1.4. Химическая стандартизация сырья и препаратов родиолы розовой 20

1.5. Фармакологические свойства препаратов родиолы розовой 24

1.6. Концепция создания новых адаптогенных, нейротропных и иммуномодулирующих препаратов на основе родиолы розовой 28

Глава 2. Характеристика объектов и методов исследования...34

2.1. Характеристика объектов исследования 34

2.2. Методы исследования 35

2.2.1. Методы выделения веществ из лекарственного растительного сырья, их очистка и идентификация 35

2.2.2. Методы микроскопических исследований ЛРС 39

2.2.3. Методы, использованные для получения лекарственных средств и определения числовых показателей 40

Глава 3. Сравнительное исследование химического состава дикорастущего и культивируемого сырья родиолы розовой 42

3.1. Выделение веществ из культивируемого сырья родиолы розовой 42

3.2 Изучение химической структуры и определение физико-химической характеристики выделенных соединений 50

Глава 4. Стандартизация сырья и препаратов родиолы розовой 56

4.1. ЛРС «Родиолы розовой корневища и корни» 56

4.1.1. Качественный анализ культивируемого сырья родиолы розовой 56

4.1.2. Количественное определение розавина в культивируемом сырье родиолы розовой 58

4.1.2.1. Хроматоспектрофотометрия (метод 1) 58

4.1.2.2. Метод ВЭЖХ (метод 2) 62

4.2. Лекарственное средство «Родиолы розовой сироп» 67

4.2.1. Качественный анализ лекарственного средства «Родиолы розовой сироп» 57

4.2.2. Количественное определение розавина в лекарственном средстве «Родиолы розовой сироп» 70

4.2.2.1. Хроматоспектрофотометрия (метод 1) 70

4.2.2.2. ВЭЖХ-анализ (метод 2) 74

Глава 5. Разработка технологическрх способов получения фитопрепаратов 79

5.1 Комплексная переработка корневищ родиолы розовой 80

5. 2. Разработка препарата «Родиолы розовой сироп» 84

Общие выводы 89

Список литературы 91

Приложение 111

• Химическая стандартизация сырья и препаратов родиолы розовой
• Методы выделения веществ из лекарственного растительного сырья, их очистка и идентификация
• Изучение химической структуры и определение физико-химической характеристики выделенных соединений
• Количественное определение розавина в культивируемом сырье родиолы розовой

Введение к работе

Актуальность темы. Расширение ассортимента группы адаптогенных и иммуномодулирующих лекарственных средств путем внедрения в медицинскую практику новых отечественных фитопрепаратов, безопасных, эффективных и доступных по цене широким слоям населения, является социально и экономически важным направлением в современной фармации.

Это связано с тем, что в настоящее время возросла потребность практического здравоохранения в адаптогенных препаратах и иммуномокорректорах, обладающих способностью в условиях дезадаптации смягчать отрицательное воздействие на организм человека стрессовых ситуаций, а также неблагоприятных экологических, производственных и других факторов.

В этом отношении особый интерес представляет родиола розовая (золотой корень) (Rhodiola rosea L., сем. толстянковых - Crassulaceae). Лекарственное растительное сырье (ЛРС) данного растения популярны в народной медицине и используются в медицинской практике Российской Федерации в качестве тонизирующих и адаптогенных средств (Куркин В.А., 2003; Куркин В.А. и др., 2005). При этом в последнее время выявлен целый ряд новых фармакологических свойств, а именно: антиоксидантная, анксиолитическая, ноотропная, иммуномодулирующая активность (Куркин В.А. и др., 2003). Однако ассортимент лекарственных средств на основе корневищ данного растения представлен только двумя препаратами -экстрактом родиолы жидким (1:1) и таблетками «Родаскон», что следует считать явно недостаточным с учетом имеющихся литературных данных относительно фармакологических свойств данного растения.

Кроме того, одним из основных дестабилизирующих факторов фитопроизводства является неритмичность обеспечения сырьем, родиола

розовая, в этом случае, не является исключением. Причины этого кроются, в частности, в резком сокращении сырьевой базы дикорастущих растений родиолы розовой.

В этой связи, перспективным направлением является проведение исследований в плане расширения сырьевой базы родиолы розовой, за счет внедрения в фармацевтическое производство культивируемого сырья, а также по созданию новых адаптогенных, иммуномодулирующих и тонизирующих препаратов, в частности, «Родиолы розовой сироп», с целью применения в медицинской практике.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы является проведение исследований по совершенствованию методов стандартизации корневищ и корней родиолы розовой, а также лекарственных средств на основе сырья данного растения.

Для достижения этой цели решались следующие задачи:

1. Систематизация данных литературы в области лекарственных растений, перспективных в качестве адаптогенных, иммуномодулирующих и тонизирующих лекарственных средств.

2. Изучение химического состава корневищ и корней родиолы розовой, культивируемой в различных регионах РФ (Пензенская область, Республика Коми и Республика Марий Эл).

3. Разработка показателей качества сырья культивируемых растений родиолы розовой.

4. Оформление проекта нормативной документации на корневища и корни родиолы розовой.

5. Разработка способа получения фитопрепарата «Родиолы розовой сироп».

6. Изучение показателей качества фитопрепарата «Родиолы розовой сироп».

7. Разработка и оформление проекта ФСП «Родиолы розовой сироп».

8. Научное обоснование технологии комплексной переработки Научная новизна. Из сырья родиолы розовой, культивируемой в

Пензенской области, Республике Коми и Республике Марий Эл впервые выделены 17 индивидуальных соединений (фенилпропаноиды, простые фенолы, флавоноиды, терпеноиды и стерины) охарактеризованных с использованием УФ -, ЯМР - спектроскопии, масс-спектрометрии, а также различных химических превращений.

Определены методические подходы к стандартизации препарата на
основе корневищ родиолы розовой, которые заключаются в использовании
принципа унификации в ряду: растительное сырье - субстанция -
лекарственная форма, а также применении в методиках качественного и
количественного анализа препаратов корневищ родиолы розовой
тонкослойно-хроматогорафического анализа (ТСХ),

хроматоспектрофотометрии и высокоэффективной жидкостной

хроматографии (ВЭЖХ).

При изучении химического состава корневищ дикорастущего и культивируемого сырья родиолы розовой, а также препаратов данного растения обоснована необходимость использования в качественном и количественном анализе Государственного стандартного образца (ГСО) розавина, являющегося индикатором качества сырья данного растения.

Обоснована комплексная технология переработки корневищ родиолы розовой, которая позволяет сохранить исходный набор БАС в готовом продукте (сухой экстракт), повысить выход целевого продукта. Данная субстанция является перспективной для получения лекарственных форм, обладающих тонизирующими, адаптогенными и иммуномодулирующими свойствами. Комплексная переработка позволяет также получать С0₂-экстракт обогащенный веществами липофильной природы (доминирующий

компонент - коричный спирт), представляющий интерес для парфюмерной и пищевой промышленности

Практическая значимость. В результате проведенных исследований разработаны и внедрены:

1. Показатели качества сырья культивируемого растения родиолы розовой, которые использованы для проекта фармакопейной статьи «Родиолы розовой корневища и корни» с целью включения данной нормативной документации (НД) в Государственную фармакопею XII издания. Это обстоятельство позволит наряду с корневищами дикорастущих растений применять в медицинской практике культивируемое сырье и, следовательно, расширить сырьевую базу данного растения.

2. Способ получения лекарственного средства «Родиолы розовой сироп»

3. Методика качественного анализа лекарственного средства «Родиолы розовой сироп», позволяющая объективно оценивать подлинность продукции, получаемой из корневищ данного растения методом ТСХ с использованием ГСО розавина.

4. Методика количественного определения розавина в лекарственном средстве «Родиолы розовой сироп» с использованием хроматоспектрофотометрии и ГСО розавина, позволяющая объективно оценивать качество продукции, получаемой из корневищ данного растения.

5. Методики количественного определения розавина в лекарственном средстве «Родиолы розовой сироп» с использованием ВЭЖХ и ГСО розавина.

6. Проект фармакопейной статьи предприятия (ФСП) «Родиолы розовой сироп».

7. Технология комплексной переработки корневищ и корней родиолы

Результаты исследований используются в научных изысканиях и в учебном процессе на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии Самарского государственного медицинского университета (акты внедрения от

14.11.2005г.).

Положения, выдвигаемые на защиту:

результаты химического изучения образцов культивируемого сырья родиолы розовой;

показатели качества культивируемого сырья «Родиолы розовой корневища и корни» и фитопрепарата «Родиолы розовой сироп»;

методики качественного и количественного анализа фитопрепарата «Родиолы розовой сироп»;

способ получения "Родиолы розовой сироп";

обоснование технологии комплексной переработки сырья родиолы розовой.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (Государственная регистрации № 01200202303) и Республиканской программы: «Разработка методик качественного и количественного анализа сырья и препаратов лекарственных растений, содержащих фенилпропаноиды и флавоноиды» (Государственная регистрация №01990007536).

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на V, VI, VIII Международной научно - практической конференции серии «Экология и здоровье человека» (Самара 1998, 1999, 2001), Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых вузов России, IX, XI Российском национальном конгрессе «Здоровье человека» (Москва 2002, 2004), Научно - практической конференции

«Современные тенденции развития фармации» (Самара, 1999), Международной научной конференции "Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности" (Томск, 2000), Научно - практической конференции, посвященной 20-летию фармацевтического факультета Башкирского медицинского университета (Уфа, 2002), Межрегиональной конференции молодых ученых «Аспирантские чтения - 2001» (Самара, 2001), 58-й межрегиональной конференции по фармации и фармакологии сборник научных трудов - Пятигорск «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2003), Научно-практическом журнале «Фармация», №6, (Москва, 2003), 1-го Международном форуме (6-ой Международной конференции) молодых ученых и студентов, медицинские науки «Актуальные проблемы современной науки» (Самара, 2005). Основное содержание диссертации опубликовано в 14 научных работах.

Объем и структура диссертации. Объем диссертации: 111 страницах машинописного текста. Она содержит 16 таблиц, 8 рисунков. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания объектов и методов исследования, 3-х глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований и их обсуждение, общих выводов, приложения и списка литературы, включающего 162 ссылки, из которых 51 на иностранных языках.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования, отмечена новизна и практическая значимость полученных результатов, а также изложены положения, выносимые на защиту.

В первой главе содержится аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по состоянию лекарственных растений, обладающих адаптогенными, иммуномодулирующими и тонизирующими свойствами и

проведен обзор современного состояния исследований в области создания фитопрепаратов с данным спектром действия. Систематизированы сведения по изучению химического состава, фармакологической активности, применению в медицинской практике родиолы розовой.

Во второй главе дана характеристика объектов, методов исследования. Приведены методики химического, физического и физико - химического изучения лекарственного сырья, индивидуальных веществ и препаратов на основе родиолы розовой и представлены методы контроля качества лекарственных средств данного растения.

В последующих трех главах экспериментальной части приводятся результаты собственных исследований по изучению химического состава корневищ и препаратов родиолы розовой, разработке методик качественного и количественного анализа сырья и лекарственного средства «Родиолы розовой сироп» и технологического способа получения данного препарата.

В приложение вынесены материалы по разработке нормативной документации и технологической документации.

Результаты, полученные при проведении исследований, обработаны статистически и представлены в таблицах, на рисунках, выражены соответствующими формулами, которые приведены в тексте диссертации.

Химическая стандартизация сырья и препаратов родиолы розовой

Данные исследования показали, что сырье родиолы розовой, культивируемое в Самарской, Московской областях, содержит практически весь набор веществ, характерный для корневищ дикорастущих растений, важно отметить, что при этом не отличается и относительное содержание основных биологически активных компонентов [15, 18, 24, 33, 38, 49]. Различия имеются в их абсолютном содержании в связи с тем, что культивируемое сырье содержит меньше экстрактивных веществ. В ходе изучения отмечена особая важность условий послеуборочной обработки и сушки сырья [38]. Поскольку для сырья родиолы розовой была выявлена высокая активность фермента вицианозидазы, которая вызывает разрушение розавина (особенно в интервале температур 40-50 С) [19, 38, 75, 78]. В итоге автоферментации химический состав корневищ резко изменяется и основным компонентом становится не розавин, как это имеет место в случае качественного сырья, а его агликон - коричный спирт, при этом содержание тирозола (агликон салидрозида) не увеличивается [19].

В результате химических и фармакологических исследований, проведенных в НПО "ВИЛАР" и в Самарском государственном медицинском университете, были открыты новые возможности для внедрения современных принципов стандартизации сырья и препаратов родиолы розовой [59, 63, 75, 90, 98].

Были проведены сравнительные исследования корневищ 21 вида рода родиола и выявлены хемотоксономические признаки (к ним относятся циннамилгликозиды), выделяющие родиолу розовую среди других видов рода Rhodiola L. [8, 26, 59, 70, 75] Так, салидрозид (1) может рассматриваться как родовой химический признак видов Rhodiola L. Терпеновый гликозид розиридин содержится в родиоле розовой в значительных количествах (около 3 %) и фактически может быть диагностическим веществом, так как не содержится в других видах родиолы. Трицин-5-глюкозид является дополнительным диагностическим признаком сырья родиолы розовой (наряду с циннамилгликозидами), причем его содержание в монгольской популяции на два порядка выше, чем в алтайской [6, 8, 37, 38].

Ранее было установлено, что наличие таких соединений, как родионин и родиозин являются отличительным признаком 6 видов родиолы, объединенных в ряд Roseae секции Rhodiola. Родиолин содержится в двух видах родиол, в родиоле тёмнокрасной (Rh. atropurpurea) его содержание значительно выше, чем в родиоле розовой и в ее арктической популяции [6, 8, 38,75, 153].

В результате химического, изучения было обнаружено [25, 35], что салидрозид содержится в большинстве видов родиолы и, следовательно, не может быть надежным показателем подлинности сырья родиолы розовой. А коричный спирт и его гликозиды (розавин, розарии, розин) содержатся только в корневищах родиолы розовой [15, 25, 37, 75, 151]. Наличие данных веществ однозначно позволяет выделять родиолу розовую среди других и служить надежным признаком при диагностике ее сырья. На основании данного факта был разработан тонкослойно-хроматографический метод установления подлинности лекарственного сырья родиолы розовой [2-4, 42, 92]. В модифицированном виде этот метод введен в Государственную фармакопею СССР XI издания, где методом ТСХ в родиоле розовой определяется наличие розавина и салидрозида [15].

В настоящее время одним из показателей качества сырья является содержание салидрозида (не менее 0,8 %), однако профессором В.А. Куркиным и профессором Г.Г. Запесочной было установлено, что данный показатель не позволяет объективно оценивать не только подлинность, но и качество корневищ родиолы розовой [9, 15, 19, 25, 26, 38].

Для стандартизации сырья данного растения были разработаны способы получения двух основных компонентов сырья - розавина и розиридина [2, 3, 29]. При этом, более удобным в качестве Государственного стандартного образца (ГСО) был признан розавин по следующим критериям: 1) розавин - кристаллическое вещество и для него сравнительно легко достигается высокая степень очистки, с классификацией "для ВЭЖХ"; 2) возможность УФ-детекции розавина в условиях ТСХ- и ВЭЖХ -разделения экстрактов родиолы; 3) высокая нейротропная активность, совпадающая с аналогичной активностью препаратов радиолы [20,21]. В НПО "ВИЛАР" и в Самарском государственном медицинском университете проведена разработка методов определения подлинности и количественной оценки БАС в сырье родиолы розовой по нескольким направлениям [2-4, 7, 15, 19, 25, 59, 75, 78]: 1. Метод ТСХ, предложенный для массовых анализов сырья с целью количественной оценки содержания розавина и салидрозида [25, 36]. 2. Методика анализа розавина, где используется ТСХ на силикагеле, элюирование зоны розавина и спектрофотометрирование, предложенная для целей стандартизации. С помощью этой методики было показано, что содержание в сырье розавина, розарина и розина составляет соответственно 3,0; 0,9 и 0,5 % , а их суммы около 4,0 % [15, 19, 25]. 3. Методика количественного определения розавина методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектирования при длине волны 252 нм, также предложенная для целей стандартизации сырья и препаратов родиолы розовой [19, 59]. 4. Методика количественного определения суммы циннамилгликозидов и салидрозида, где используется колоночная хроматография и спектрофотометрирование при двух длинах волн. Достоверность получаемых результатов подтверждена методами ТСХ и ВЭЖХ [19, 59]. Во всех четырех перечисленных методиках анализа используется ГСО розавин, для которого в НПО "ВИЛАР" разработаны регламент и проект ВФС, регламентирующий качество продукта.

Методы выделения веществ из лекарственного растительного сырья, их очистка и идентификация

Для выделения соединений из сырья родиолы розовой, их разделения и очистки использовали сочетание различных экстракционных и хроматографических методов, при этом препаративное разделение суммарных экстрактов с использованием невысоких слоев сорбента (полиамид, силикагель, сефодекс LH - 20). Использовались водно-спиртовые и хлороформно-спиртовые системы в различных соотношениях. Кристаллизация и перекристаллизация веществ осуществлялась с помощью гексана, хлороформа, ацетона, этанола, метанола, воды и их различные соотношения. Отсутствие примесей в получаемых соединениях контролировалась методом ТСХ. Для колоночной хроматографии экстрактивных веществ использовали следующие сорбенты: 1. Полиамид Woelm (Германия); полиамид, изготовленный на Олайнском заводе химреактивов или полученный в лабораторных условиях. Для удаления мономерных и низкомолекулярных фракций полиамидный порошок обрабатывали в течение 1 часа (дважды) смесью хлороформ-спирт этиловый 1:1 в условиях кипения. 2. Силикагель марки L 40/100 мкм и L 100/250 мкм (Чехия). 3. Сефадекс LH-20 (Швеция). Эффективного разделения и очистки веществ, в особенности некристаллических, удалось добиться лишь чередованием указанных сорбентов и соответствующих систем растворителей. Для ТСХ-анализа экстрактов из растительного сырья и выделенных соединений использовали пластинки "Силуфол УФ-254" (Чехия) и "Сорбфил ПТСХ-ПА-УФ" (Россия). Системы растворителей: - хлороформ-метанол-вода, 26:14:3; - хлороформ-метанол, 6:1; 9:1; - хлороформ-этанол, 2:1; 4:1; 6:1; 9:1; 19:1; - бензол-ацетон, 4:1; - хлороформ - этиловый спирт - ацетон, 4:4:1. Бумажную хроматографию Сахаров и других компонентов осуществляли на бумаге FN-11, FN-15 в нисходящем токе растворителей. Системы растворителей: - этилацетат-н-пропанол-вода, 7:2:1; - 15% уксусная кислота; - н-бутанол-уксусная кислота-вода; 4:1:2. Для проведения ВЭЖХ использовали прибор хроматограф "Милихром-5" (НПО "Научприбор", Россия).

Для обнаружения пятен веществ проводили УФ-облучение (254 и 366 нм) до и после обработки хроматограмм 1 % спиртовым раствором АІСІз (для обнаружения флавоноидов и других компонентов), обработкой 1 % спиртовым раствором хлорида железа (FeCb) и раствором карбоната натрия (Na2C03) свежеприготовленным раствором диазобензолсульфокислоты (для обнаружения фенольных соединений), 20 % раствором серной кислоты с последующим нагреванием при 105-110 С (для обнаружения монотерпенов, стеринов). Для проявления Сахаров использовали анилин-фталат в н-бутаноле, насыщенном водой, при нагревании хроматограмм (105 С). При этом гексозы проявляются виде пятен коричневого цвета, а пептозы в виде пятен красновато-розового цвета. Химическая структура и физико-химические характеристики выделенных соединений (1-17) даны нами в таблицах 1-4. Вещества, выделенные из сырья, сушили в вакуум-пистолете при температуре 60-78 С/2 мм над пятиокисью фосфора и затем определяли температуру плавления на блоке Кофлера. УФ-спектры сняты на приборе Specord М 40 и Hitachi-EPS-ЗТ в этаноле.

Применялись реагенты сдвига: 0.1 М раствор метилата натрия, свежеплавленный ацетат натрия, безводная борная кислота (или ее насыщенный раствор в метаноле), 5 % раствор безводного АІСІз , Ю % НС1. Спектры ЯМР- Н записаны на приборе Gemini-200 фирмы Varian с рабочей частотой 200 МГц. Величины химических сдвигов приведены в шкале 5. Внутренний стандарт - тетраметилсилан (5=0). Приняты следующие сокращения: с - синглет, д - дублет, т - триплет, дд - двойной дублет, кв - квартет, м - мультиплет. Масс-спектры электронного удара выполнены на приборе Varian СН-8 при энергии ионизирующих электронов 70 эВ. Температура ионного источника варьировалась от 30 до 300 С. Калибровка масс-спектрометра проводилась с помощью перфторкеросина. Углы вращения получали на поляриметре Polamat А при 546 им с пересчетом для 589,3 им. Качественные реакции: 1. Цианидиновая реакция (проба Синода). К 1-2 мг исследуемого вещества, растворенного в 1 мл спирта, прибавляют 5 капель концентрированной хлористоводородной кислоты и 5-10 мг магния. Образуется красно-малиновое окрашивание (флавоноиды) [16, 17]. 2. Цианидиновая реакция по Брианту. Раствор, полученный по реакции 1, разбавляют водой и обрабатывают октиловым спиртом. В случае агликона окраска переходит в органическую фазу, а в случае гликозида - остается в водном растворе [16.17]. 3. Госсипетоновая реакция. К спиртовому раствору флавоноида добавляют п-бензохинон. Красно-коричневая окраска или осадок свидетельствуют о наличии п-дигидроксигруппировки [16, 17]. 4. Проба Гиббса. К спиртовому раствору флавоноида приливают 2-3 капли раствора реактива Гиббса (хлоримид 2,6-дибром-бензохинона) и 1 мл боратного буфера (рН 9,4). Глубокая синяя окраска характерна для фенолов с незамещенным положением (например, для 5-оксифлавонов, не имеющих заместителей при С-8) [16, 17]. 5. Реакция Либермана-Бурхардта. К 1-2 мг вещества добавляют 1 мл смеси концентрированной серной кислоты и уксусного ангидрида (50:1). Красно-фиолетовая окраска свидетельствует о стериновой или стероидной природе вещества [17]. Кислотный гидролиз. 10 мг гликозида нагревают с 3 мл 2 % НС1 на кипящей водяной бане в течение 5-30 мин. Полноту гидролиза проверяют ТСХ. Из охлажденной смеси отфильтровывают кристаллы агликона через взвешенный стеклянный фильтр, а в случае некристаллического агликона его извлекают из кислотного гидролизата хлороформом. Водный раствор упаривают в вакууме и используют для идентификации углевода методом БХ. Полный гидролиз даукостерина проводили в более жестких условиях: 10 мг гликозида растворяют в 3 мл спирта или смеси спирт-хлороформ (1:1), добавляют 5 мл 10 % НО и нагревают в течение 2-3 часов при 100 С. Из охлажденной смеси отделяют кристаллы агликона и затем для идентификации сахара гидролизат нейтрализуют на анионите и упаривают.

Изучение химической структуры и определение физико-химической характеристики выделенных соединений

Результаты исследований (рис. 1, табл. 1-4) свидетельствуют о том, что корневища родиолы розовой, интродуцированной в Самарской, Московской, Пензенской областях, Республике Коми, республике Марий Эл, имеют практически тот же набор соединений, что и сырье дикорастущих растений (Горно-Алтайская автономная область), отличаясь лишь по количественным характеристикам. Родиола розовая, культивируемая в Республике Коми и Республике Марий Эл, характеризуется более высоким содержанием производных гербацетина - флаволигнана родиолина, родионина родиозина. (д, 7 Гц, H-I глюкозы), 2.9-3.7 (м, 7Н, 1Н агликона и 6Н глюкозы), 0.6-2.3 (м, 47Н). Вещество дает положительную реакцию Либермана-Бурхардта. Кислотный гидролиз гликозида в жестких условиях (10% НС1 в течение 5 часов) приводит к образованию глюкозы и агликона, который идентичен Р-ситостерину по составу, хроматографической подвижности и спектральным данным. 1. При сравнительном фитохимическом исследовании образцов корневищ родиолы розовой, интродуцированной в Пензенской области, Республике Коми и Республике Марий Эл, определен практически тот же набор соединений, что и в сырье дикорастущих растений, выявлено лишь отличие количественных характеристик фенилпропаноидного и флавоноидного состава сырья. 2. В результате изучения химического состава ЛРС культивируемого в Пензенской области, Республике Коми и Республике Марий Эл выделено 17 индивидуальных веществ, относящихся к простым фенолам, фенилпропаноидам, флавоноидам, монотерпенам, стеринам и флаволигнанам. 3. Из корневищ родиолы розовой, культивируемой в условиях Пензенской области, Республики Коми и Республики Марий Эл выделенные индивидуальные соединения определены как: розин, розавин, розарии, коричный спирт (фенилпропаноиды), тирозол, салидрозид, галловая кислота (простые фенолы), родиолин (флаволигнан), родионин, родиозин, трицин, трицин-5- и 7-О-глюкозиды (флавоноиды), розиридол, розиридин (монотерпены), р-ситостерин и даукостерин (стерины), которые идентифицированы с использованием УФ-, !Н-ЯМР-спектроскопии, масс-спектрометрии и различных химических превращений. 4. Показана целесообразность, на основе данных по компонентному составу БАС, культивирования родиолы розовой в условиях Пензенской области, Республики Коми и Республики Марий Эл, что будет способствовать расширению сырьевой базы данного растения. С учетом современных подходов по разработке методов анализа гармонизации и унификации методик в ряду растительное сырье-субстанция-лекарственная форма, представляется целесообразным провести разработку объективных методов анализа с позиций определения ведущей группы действующих веществ и использования ГСО розавина. [2-4, 59, 75, 78]. Решение вопросов по стандартизации сырья и препаратов позволит на качественно новом уровне решать вопросы стандартизации и обеспечить соответствующую нормативную базу препаратов родиолы розовой.

Для качественной оценки сырья родиолы розовой предложен ТСХ-анализ. В ходе разработки методики были проведены исследования по выбору оптимальных условий хроматографирования, позволяющие эффективно разделить и однозначно идентифицировать основные компоненты ЛРС [2-4, 75, 78]. В результате проведенных опытов с различными хроматографическими системами (хлороформ - этанол, хлороформ - метанол, хлороформ - метанол -вода в различных соотношениях) предпочтение было отдано системе растворителей хлороформ - метанол - вода (26:14:3), как обеспечивающей наиболее четкое разделение доминирующих БАС - циннамилгликозидов розавина, розарина, розина и доминирующего фенольного соединения -салидрозида. Для их идентификации были использованы в качестве свидетелей ГСО розавина и достоверно известные образцы вышеперечисленных соединений. При облучении УФ-светом (254 нм) розавин на хроматограмме обнаруживается в виде доминирующего пятна с фиолетовой флуоресценцией с величиной Rf около 0,40 (рис. 2). Менее интенсивны пятна других циннамилгликозидов (розарии, розин) и коричного спирта.

Количественное определение розавина в культивируемом сырье родиолы розовой

В предложенной методике количественного определения использовали образец ГСО розавина - доминирующего и специфического фенилпропаноида в сырье родиолы розовой. Для определения розавина в препарате использовали хроматоспектрофотометрический метод, заключающийся в хроматографическом отделении его от сопутствующих веществ с использованием системы: хлороформ - этиловый спирт - ацетон в соотношении 4:4:1 и в последующем спектрофотометрическом определении [75, 90]. Спиртовой раствор элюата имеет максимум поглощения при длине волны 252 нм, причем характер УФ-спектра практически совпадает с таковым раствора ГСО розавина (рис. 3). 225 230 235 240 245 250 255 260 265 270 275 280 285 290 295 300 Методика. Около 10,0 г (точная навеска) воздушно-сухого сырья, измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм, помещали в коническую колбу вместимостью 100 мл с притертой пробкой и прибавляли 30 мл 70 % спирта. Колбу с содержимым присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Затем содержимое колбы отстаивали 10 мин, фильтровали через бумажный фильтр с красной полосой в мерную колбу вместимостью 50 мл. Извлечение повторяли еще раз вышеуказанным способом и после охлаждения фильтрата доводили объем раствора 70 % спиртом до метки. 5,00 мл извлечения помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводили объем раствора 60 % спиртом до метки (раствор А). На хроматографическую пластинку наносили микропипеткой 3 полосы (1, 3, 5) длиной 2,3 см по 0,04 мл полученного раствора А и 3 полосы (2, 4, 6) раствора ГСО розавина по 0,04 мл, одну полосу оставляли для контрольного опыта. Пластинку подсушивали на воздухе в течение 5 мин, помещали в камеру, которую предварительно насыщали не менее 30 мин смесью хлороформ -этиловый спирт - ацетон в соотношении 4:4:1, и хроматографироволи восходящим способом. После того, как фронт растворителей проходил до края пластинки (около 3-х часов), пластинку вынимали из камеры, сушили на воздухе до удаления запаха растворителей (не менее 30 мин). Пластинку просматривали в УФ-свете при 254 нм и отмечали зоны, содержащие розавин (на уровне ГСО розавина).

Силикагель с отмеченных зон, содержащих розавин, и зону контрольного опыта количественно переносили в колбы со шлифами вместимостью 50 мл, приливали по 10 мл 95 % этилового спирта. Элюирование проводили при постоянном взбалтывании в течение 1 ч. Элюаты фильтровали через беззольный фильтр с синей полосой (раствор Б). Оптическую плотность фильтратов измеряли на спектрофотометре при длине волны 252 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм на фоне контрольного опыта. Метрологические характеристики хроматоспектрофотометрической методики количественного определения розавина в ЛРС даны по результатам 11 определений и представлены в табл. 5. Результаты статистической обработки проведенных опытов свидетельствуют о том, что ошибка единичного определения с доверительной вероятностью 95 % составляет ±3,12 %. Достоверность предложенной методики определения розавина в сырье родиолы розовой подтверждена опытами с добавками ГСО розавина в сырье и в раствор А (табл. 6). В дополнение к методу 1 предложен метод 2, повышающий объективность анализа по содержанию основного компонента - розавина. В качестве альтернативного метода определения розавина в сырье предлагается ВЭЖХ-анализ с использованием ГСО розавина. Ввиду того, что розавин является полярным веществом и хорошо растворяется в полярном растворителе, был выбран обращенно-фазовый вариант жидкостной хроматографии с неполярным адсорбентом.

В этом варианте жидкостной хроматографии удерживание анализируемого соединения определяется как его взаимодействием с поверхностью адсорбента (дисперсионные силы притяжения адсорбат - адсорбент), так и межмолекулярными взаимодействиями в объёме элюента, причем небольшое изменение состава элюента может резко изменять удерживание вещества вплоть до его необратимой сорбции в колонке. В связи с этим подбор состава элюента являлся наиболее трудоёмкой частью эксперимента. Выбор детектируемой длины волны осуществляли на основании данных спектрофотометрического анализа сирингина. В ходе разработки методики ВЭЖХ-анализа варьировали условия разделения основных компонентов препарата: тип сорбента, состав элюента, скорость элюирования и длину волны детектирования. Для адаптации метода к условиям заводской лаборатории, оборудованной жидкостными хроматографами отечественного производства, были проведены эксперименты на хроматографе «Милихром-5» (НПО «Научприбор»).

Похожие диссертации на Совершенствование методов стандартизации лекарственных средств на основе корневищ радиолы розовой [Электронный ресурс]

Совершенствование методов стандартизации и контроля качества противоопухолевых лекарственных средств, производных хлорэтиламина на основе аминокислотШпрах, Зоя Сергеевна

Совершенствование принципов и методов фармакопейного анализа в системе стандартизации лекарственного растительного сырья и лекарственных средств на его основеБаландина Ирина Анатольевна

Разработка и совершенствование методов стандартизации стоматологических средств и материалов, содержащих эвгенолШабалина Ангелина Эдуардовна

Совершенствование методов стандартизации и оценки качества лекарственных средств группы нестероидных противовоспалительных средств (на примере диклофенака натрия)Карманова Татьяна Михайловна

Исследования по совершенствованию методов стандартизации фитопрепаратов и гомеопатических лекарственных средствЛякина Марина Николаевна

Обоснование состава и разработка методов стандартизации противоязвенного лекарственного средства на основе облепихового маслаКупянская Валентина Николаевна

Получение и стандартизация стоматологических гелей и жидких лекарственных средств на основе корневища и корней хрена обыкновенного и бутонов гвоздичного дереваНейман, Полина Леонидовна

Фитохимическое исследование и совершенствование методов стандартизации цветков и травы календулы лекарственной (Calendula officinalis L.)Кащенко, Нина Игоревна

Совершенствование стандартизации и контроля качества лекарственного растительного сырья и лекарственных форм из него на основе микроскопического метода исследованияПотанина Ольга Георгиевна

Обоснование состава противоязвенного лекарственного средства методом математического планирования эксперимента и его стандартизацияТалдыкина Анна Анатольевна