Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Роль и значение стандартизации в современной стоматологии 12
1.1. Стандартизация стоматологических материалов, современные аспекты 12
1.2. Стандартизации фармацевтических препаратов, содержащих эвгенол 16
1.3. Стоматологические материалы, содержащие эфирные масла и их основные компоненты 20
1.4. Основные источники получения эвгенола 21
1.5. Эвгенол стоматологический: химическое строение, физико-химические свойства, применение в стоматологии 25
1.5.1. Контроль качества препарата «Эвгенол стоматологический» по Техническим условиям (9336-058-45814830-01) 25
1.5.2. Качественные реакции на эвгенол 26
1.5.3. Определение примесей 26
1.5.4. Фармакологическое действие и области применения эвгенола в стоматологической практике 26
1.6. Стоматологические материалы на основе эвгенола 27
1.7. Антибактериальная активность эвгенола стоматологического 30
1.8. Токсичность и клинические проявления при отравлении эвгенолом 33
Глава 2. Материалы и методы исследования 37
2.1. Объекты исследования 37
2.1.1. Характеристика жидких эвгенолсодержащих стоматологических материалов для антисептической обработки корневых каналов 37
2.1.2. Характеристика пломбировочных материалов на основе эвгенола 37
2.2. Стандартные образцы 40
2.3. Оборудование и реактивы 42
2.3.1. Основные характеристики газового хроматографа «Agilent 6890N» с масс-селективным детектором «Agilent 6890N» 50
2.3.2. Устройство динамического парафазного анализатора «Gerstel MPS 2» 56
2.4. Валидация метода обнаружения и количественного определения эвгенола методом ГХ-МС с применением метода равновесной паровой фазы 63
2.5. Статистическая обработка результатов количественного определения эвгенола 66
2.6. Определение класса исследуемого пломбировочного материала методом ГХ-МС с
применением равновесной паровой фазы 68
2.6.1. Рентгенофлуоресцентный анализатор 68
2.6.2. Калибровка прибора «Спектроскан» для количественного анализа 71
2.6.3. Определение матрицы исследуемого пломбировочного материала 75
2.7. Вспомогательное оборудование 76
Глава 3. Результаты исследований 77
3.1. Методика определения подлинности и чистоты «Эвгенола Стоматологического».. 77
3.1.1. Характеристика внешнего вида «Эвгенола Стоматологического» 77
3.1.2. Определение плотности «Эвгенола Стоматологического» 78
3.1.3. Растворимость «Эвгенола Стоматологического» 78
3.1.4. Определение подлинности химическими реакциями 79
3.1.5. Определение показателя преломления 81
3.1.6. Определение чистоты исследуемых стоматологических материалов в тонком слое сорбента и УФ-спектрофотометрии 81
3.2. Определение примесей, входящих в состав исследуемых стоматологических материалов методом ГХ-МС 92
3.3. Определение концентрации эвгенола в стоматологической продукции (метод равновесной паровой фазы с ГХ-МС) 102
3.4. Метрологические характеристики разработанного метода количественного определения эвгенола ГХ-МС с применением равновесной паровой фазы 107
3.5. Стандартизация стоматологических материалов на основе эвгенола 115
Общие выводы 120
Список литературы 122
- Стандартизации фармацевтических препаратов, содержащих эвгенол
- Стоматологические материалы, содержащие эфирные масла и их основные компоненты
- Стандартные образцы
- Определение примесей, входящих в состав исследуемых стоматологических материалов методом ГХ-МС
Введение к работе
Стандартизация лекарственных препаратов - важнейшая экономическая задача фармации в совершенствовании современного производства, необходимая для обеспечения населения высокоэффективными и высококачественными препаратами. Это требование является одной из основных задач фармацевтической науки. Однако поступлению надлежащих продуктов на мировой рынок должны сопутствовать ряд мероприятий, позволяющих гарантировать их качество. Совершенно очевидно, что эффективность лечения теснейшим образом связана с качеством используемых материалов, требования к которым заложены в нормативной документации с учетом последних достижений науки [51, 53, 74].
Все увеличивающееся число доступных на фармацевтическом и стоматологическом рынке лекарственных средств, тенденция роста фальсифицированной продукции требуют внедрения новых фармакопейных методов анализа и контроля качества готовых лекарственных форм, что обеспечивает их безопасность и эффективность. В последнее время особый интерес для фармацевтов во всем мире представляет разработка новых современных физико-химических и физических методов, а также измерительных приборов для контроля качества лекарственных средств.
Участились случаи обращения населения в Министерство Здравоохранения и социального развития РФ по вопросу оказания некачественной стоматологической помощи. Это связано далеко не только с наличием малоквалифицированного персонала, а еще и с естественным развитием рынка стоматологических материалов, который сопровождается ростом контрафактной и низкокачественной продукции, контроль за которой осуществляется по стандартам стоматологической отрасли [107].
Особое место в этой проблеме занимают эвгенолсодержащие стоматологические материалы, которые составляют более трети стоматологической продукции, имеющей в своем составе компоненты эфирных масел. Широта применения эвгенола, получаемого из различных частей гвоздичного дерева и базилика эвгенолового, обусловлена спектром его фармакологического действия: антибактериальное, антисептическое, противовоспалительное и ра-нозаживляющее, местнообезболивающее, отвлекающее, спазмолитическое; при этом обладая меньшей токсичностью, отсутствием привыкания, хорошей переносимостью по сравнению с синтетическими аналогами (хлоргекседин, триклозан и др.). Эвгенол в пломбировочных материалах выполняет роль связующего, девитализирующего и противовоспалительного звена [95, 107].
Анализ нормативной и патентной документации показал, что определение подлинности и доброкачественности материалов, основанное на идентификации индивидуальных компонентов, заявленного состава с последующей их количественной оценкой требованиям НД на стоматологические материалы не предусмотрено, а основными критериями определения подлинности стоматологических материалов являются лишь рабочие технические характеристики (время деформации, относительное удлинение, адгезивные свойства (прилипание к дентину), совместимость с гипсом, твердость на излом, время отверждения, коэффициент усадки, и т.д.). Определение этих свойств, безусловно, важны, но недостаточны для полноты определения качества стоматологической продукции.
Эвгенол один из наиболее эффективных антисептиков, используемых в стоматологии, как монопрепарат для антисептической обработки корневых каналов, а также в качестве комплексных препаратов для временного и постоянного пломбирования. Наличие посторонних примесей будет ухудшать процесс схватываемости цемента, уменьшая бактерицидный эффект препаратов, а также снижать прочностные характеристики образовавшегося цемента, более того, часть примесей может оказывать и токсическое действие на организм (LD503Br^2680 мг/кг) [52, 54, 130].
Создание современных методов стандартизации, позволяющих контролировать подлинность и качество материалов на основе эвгенола, а также определять источник его получения и примесный состав, является, безусловно, актуальным вопросом для фармацевтической науки.
Заметим, что современная химическая литература пестрит сообщениями об успешном использовании методов хромато-масс-спектрометрии, применении баз данных и систем компьютерной идентификации для решения самых разнообразных научных и прикладных задач. Многолетний опыт работы различных химико-токсикологических лабораторий, в которых эксплуатируются системы компьютерной идентификации веществ, подтверждает важную роль информационных технологий (в сочетании с современной приборной базой спектрального анализа) в повышении эффективности качественного и количественного анализа [130].
Все вышесказанное предопределило выбор актуальной темы разработки и совершенствования методов стандартизации стоматологических средств и материалов, содержащих эвгенол, позволяющих контролировать подлинность и качество материалов на основе эвгенола, а также определять источник его получения и примесный состав. Практическая значимость работы также связана с разработкой метода обнаружения и количественного определения эвгенола в различных стоматологических средствах, пломбировочных материалах и препаратах, поскольку, в доступной нам литературе имеются данные, лишь по анализу эвгенола и его аналогов в биологических жидкостях человека [147, 154], что связано с имеющимися в судебно-медицинской практике случаями смертельного отравления эвгенолом и его изоме-ром-изоэвгенолом. В стоматологической практике известны также случаи попадания пломбировочного материала в пазухи носа, что сопровождается воспалительными процессами, обусловленными ростом различного рода грибов и вызывает одентогенный синусит. Также часто воспалительный процесс может достигать и лобных долей, с развитием фронтитов. Причем, как показывает практика, различные пломбировочные материалы вызывают рост разной патогенной микрофлоры, поэтому определение именно класса цемента, попадание которого в пазухи носа, сопровождается ростом определенного рода микроорганизмов, может существенно облегчить терапию пациента, с подбором соответствующих препаратов (чаще всего антибиотиков) [52].
Таким образом, разработка современных методов стандартизации позволяющих обнаружить, определить подлинность, качество и количественную оценку входящего в состав не только стоматологических средств эвгенола, а также в пломбировочные материалы является актуальной задачей.
Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы явилась разработка методики обнаружения, определения подлинности и количественной оценки эвгенола, входящего в состав лекарственных средств и материалов, применяемых в стоматологии, с последующей стандартизацией изучаемых объектов.
Задачи исследования.
Определить показатели качества исследуемых эвгенолсодержащих материалов различных фирм-производителей, а также предложить показатели подлинности с учетом определения таковых в фармацевтической продукции.
Разработать экспресс-методику определения эвгенола и примесей методом хроматографии в тонком слое сорбента (с использованием разных проявителей).
Установить методом ГХ-МС примесный состав исследуемых препаратов с целью определения источника получения эвгенола (природный и/или синтетический).
Разработать методику обнаружения и количественного определения эвгенола в стоматологических материалах (в том числе, пломбировочных) методом равновесной паровой фазы с применением газовой хроматографии и масс-спектрального детектирования.
Предложить методику стандартизации и разработать НД на стоматологические средства и материалы на основе эвгенола.
Научная новизна. - Проведена оценка качества стоматологических материалов «Эвгенола стоматологического» фирмы «Омега Дент», «Радуга-Р», «ВладМива», по критериям (растворимость в различных растворителях, определение показателя преломления, плотность, качественные реакции на функциональные группы), регламентируемым НД на фармацевтические препараты.
Предложены и обоснованы современные физико-химические методы определения подлинности и качества исследуемой продукции (цемента на основе оксида цинка с эвгенолом, «Гутасиллера», «Кариосана» и антисептического раствора), методом спектрофотометрии в УФ области и хроматографии в тонком слое сорбента.
Разработаны методики определения чистоты «Эвгенола стоматологического» различного происхождения экспресс-методом хроматографии в тонком слое сорбента.
Изучен примесный состав исследуемых материалов, исследования положены в основу идентификации источника получения эвгенола, а также в раздел ТУ «Примеси».
Впервые разработаны рекомендации к разделам «Подлинность» и «Содержание индивидуальных компонентов» в ТУ на «Эвгенол стоматологический».
Методом газовой хроматографии с масс-селективным детектированием в анализируемых объектах установлены основные примесные соединения: ацетилэвге-нол, р-кариофиллен, Р-кариофиллена оксид, ванилин, изоэвгенол, 3-метокси-б-аллилфенол, бензойная кислота, толуол, в случае синтетического источника получения.
Разработаны методики количественного определения эвгенола в стоматологических материалах на основе эвгенола, а также в пломбировочном материале, в основе которого лежит современный физико-химический метод: метод равновесной паровой фазы с применением капиллярной газовой хроматографии и масс-спектрального детектирования.
Теоретическая и практическая значимость.
На основании результатов проведенных исследований нами подготовлены ТУ «Эвгенол стоматологический». Результаты диссертационного исследования необходимы в оценке качества стоматологических материалов, что повысит качество эвгеполсодержащеи продукции, уменьшит поступление фальсификатов и сократит количество побочных реакций в результате стоматологического лечения, оказанного с применением лекарственных средств содержащих эвгенол.
Проведенное исследование показало необходимость изменения существующего подхода к оценке качества эвгенолсодержащих стоматологических материалов, основанное лишь на оценке технических характеристик: предложено дополнить нормы определения качества современными физико-химическими методами: спектрофотометрией в УФ-области, хроматографией в тонком слое сорбента, ГХ-МС (с применением равновесной паровой фазы).
Определены физико-химические показатели (плотность, показатель преломления) качества «Эвгенола стоматологического» фирмы («Омега Дент», «ВладМива», «Радуга-Р»). Разработаны новые методики идентификации и количественного определения эвгенола в комплексных стоматологических средствах и пломбировочных материалах, которые легли в основу проекта НД на «Эвгенол стоматологический».
Внедрение результатов исследования в практику.
Разработаны проекты ТУ: «Эвгенол стоматологический»; «Цементы стоматологические на основе оксида цинка и эвгенола».
Проведено внедрение разработанных методик идентификации, разделения, определения чистоты в контрольно-аналитическую лабораторию Главного Управления по контролю качества лекарственных средств и медицинской техники республики Узбекистан, о чем имеется акт внедрения №29/3254 от 15 октября 2007 года.
Фрагменты диссертационного исследования внедрены в учебный процесс стоматологического факультета ММА им. И.М. Сеченова и медицинского факультета стоматологического отделения Российского университета дружбы народов.
Положения, выдвигаемые на защиту
Данные по определению показателей подлинности и качества стоматологических материалов, содержащих эвгенол.
Выбор оптимальных параметров для разделения эвгенола и его примесей в тонком слое сорбента (экспресс-методика).
Определение подлинности методом спектрофотометрии в УФ области спектра.
Методика количественного определения эвгенола в жидких стоматологических материалах его содержащих.
Методика обнаружения и количественного определения эвгенола в пломбировочных материалах.
Результаты исследования по теоретическому и экспериментальному обоснованию необходимости внедрения современных физико-химических методов в НД на эвгенолсодержащие стоматологические материалы.
Апробация работы.
Основные результаты исследования доложены на: X Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (Москва, 2007 г.);
IV Научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создание функциональных продуктов» (Москва, 2007);
Всероссийская научно-практическая конференция «Современные проблемы медико-криминалистических, судебно-химических и химико-токсикологических экспертных исследований» (Москва, 2007).
Научно - практическая конференция, посвященная 65-летию судебно - медицинской экспертизы Вооруженных Сил Российской Федерации (Москва, 2008).
К вопросу стандартизации эвгенолсодержащих материалов в стоматологической практике//Журнал Естественные и технические науки . - 2008. - №2. - С. 176-178 (соавт.: Саломатин Е.М., Симонов Е.А.).
Метод исследования эвгенола // Журнал Судебно-медицинская экспертиза. -2008.-№5.
О разработке методик определения подлинности и качества эвгенолсодержащих стоматологических материалов // Вестник Московского Государстенного Университета. - Т.49. - №10. - 2008. (Нестерова О.В., Кузьменко А.Н., Попков В.А.).
Публикации по результатам исследования: опубликовано 7 работ, в том числе 2 статьи, 1 тезисы.
Объем и структура диссертации: диссертация изложена на 156 страницах машинописного текста, содержит 94 рисунка, 59 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы собственных исследований, общих выводов, библиографического указателя включающего 187 источников и Приложений.
Стандартизации фармацевтических препаратов, содержащих эвгенол
Поскольку эвгенол применяется не только в стоматологии (в качестве моно- и комплексных препаратов), но также и в пищевой и фармацевтической промышленности (в составе комплексных препаратов), на него имеется нормативная документация и в зарубежных фармакопеях (Европейская фармакопея 2007 года и Американская фармакопея 2006 года), что особенно важно рассмотреть в рамках данной диссертационной работы. Проанализированные данные представлены в сводной таблице, исходя из которой можно сделать вывод, что подлинность эвгенола и показатели качества определяют качественными реакциями на фенолы, хроматографией в тонком слое сорбента с разными проявителями (серная кислота, анисовый альдегид), УФ-спектрометрией, а Европейская фармакопея нормирует также остаточные растворители методом газовой хроматографии.
Эвгенол, применяемый в качестве одного из компонентов комплексных препаратов, качественно оценивается по определению примесей (метод ТСХ) и определению физических констант (показатель преломления и плотность), количественная оценка предусмотрена лишь в фармакопейных статьях на индивидуальный препарат (Рис. 1).
Количество фармацевтических препаратов, содержащих гвоздичное масло или его главный компонент эвгенол, зарегистрированных в России не так велико, по сравнению со стоматологическими материалами. Тем не менее, при анализе соответствующей документации было выявлено, что их стандартизация осуществляется по определению главного компонента (эвгенола) методами, характерными для определения всех эфирных масел - различные виды хроматографии (ТСХ, ГЖХ и т. д.). Однако, существуют многокомпонентные препараты, в которых эвгенол присутствует в минорных количествах, но его используют для определения подлинности. К таким препаратам относятся различные эликсиры и бальзамы, в которых эвгенол обнаруживается методом ГЖХ и нормируется в разделе «Подлинность» -эликсир «Алтайский», «Демидовский», бальзам «Первопрестольный». Это связано с тем, что эвгенол обладает хорошими параметрами воспроизводимости, как по частоте обнаружения, так и по количественному содержанию, и эти показатели нормируются в разделе «Подлинность». Такое использование эвгенола в качестве маркера делает возможность его определения не только в фармацевтической, но также и в стоматологической продукции его содержащей [74, 95].
Компоненты эликсиров и бальзамов, обнаруживаемые методами газовой хроматографии и нормируемые в разделе «Подлинность» представлены в таблице ниже (Таблица 1).
Данное положение вещей дает нам возможность затронуть проблему идентификации и количественной оценки эвгенола в стоматологической продукции, где определение качества материалов весьма условно.
Основные фирмы-производители стоматологической продукции, представленные на Российском рынке.
В настоящее время количество фирм, представляющих на мировом рынке стоматологические материалы и оборудование, неуклонно растет. Однако имеется тенденция «пожирания» крупными компаниями своих конкурентов, и даже, несмотря на это, общее число фирм составляет около 1500. На российском рынке представлены лишь порядка 400 фирм как российских, так и зарубежных стран: Австрия, Германия, Франция, США, Италия, Словения, Финляндия, Россия, Индия и др.
Достаточно сказать, что основная часть стоматологических материалов (70-80%) поступает в Россию из-за рубежа. Несмотря на то, что на отечественные компании приходится 20-30% рынка, (это составляет значительную конкуренцию западным компаниям и отечественные компании продолжают получать все большую распространенность), очевидно, что на данном этапе все-таки отдается предпочтение зарубежной продукции, ввиду ее технологически более совершенных качеств и четко отлаженной системе стандартизации ISO.
Производство стоматологических материалов сосредоточено в Западной Европе (Австрия, Германия, Франция, Великобритания, Италия), в США, России и Индии (Приложение
1) В изготовлении стоматологических материалов задействованы: фармацевтическая, химическая и пищевая промышленность, именно оттуда поступают столь необходимые составляющие компоненты для изготовления конечного продукта. Наиболее известные фирмы -производители стоматологической продукции представлены в таблице ниже (Таблица 2).
Стоматологические материалы, содержащие эфирные масла и их основные компоненты
Проанализировав ассортимент стоматологических материалов, можно сделать вывод о том, что наряду с полимерными материалами, традиционно используемыми в стоматологии, значительную часть составляют препараты, содержащие эфирные масла и их компоненты, которые занимают 3-е место после препаратов на основе цинка (слепочные материалы, пломбировочные материалы), содержащие гормоны (дексаметазон, преднизолон) и анестетики чисто химического происхождения, которые с успехом применяются уже десятилетиями (лидокаин, новокаин.) Основные компоненты эфирных масел входящих в состав стоматологической продукции - это ароматические соединения, они обладают сильным бактерицидным свойством, что находит применение в медицинской практике. Эфирные масла тимьяна, чабреца, душицы и др. содержат тимол, карвакрол. Анетол - главный компонент эфирного масла плодов аниса, фенхеля. Эвгенол содержится в эфирном масле гвоздики, эвгенольного базилика, эвгенольной камеди и др. В свою очередь среди материалов, содержащих различные компоненты эфирного масла, основная доля приходится на препараты с эвгенолом (главным компонентом эфирного масла гвоздики), используемые в стоматологии в качестве антисептических, болеутоляющих противовоспалительных и успокаивающих средств, в виде моно- и комплексных препаратов (Приложение 1). В стоматологической продукции используются также и другие эфирные масла [ПО]: - Апельсиновое и цитрусовое масло используются в составе жидкостей для расплом-бирования корневых каналов, запломбированных эвгенолсодержащими пастами. - Масло корицы входит в состав паст для временного лечения инфицированных каналов. - Масло герани и масло мяты перечной применяется как антисептик для пульпы. - Анисовое масло используется для девитализации корневых каналов в пасте «Некор — ( Азур». - Гвоздичное масло применяется аналогично эвгенолу. В состав разнообразных стоматологических материалов входят также индивидуальные компоненты эфирных масел: - Тимол входит в состав жидкости для антисептической и бактериальной обработки корневых каналов. - Камфора применяется, как антисептический раствор, стерилизующий дентин после препарирования. - Ментол используется, как антисептик. Эвгенол - это фенол (2-метокси-4-аллилфенол), являющийся главным компонентом эфирных масел гвоздики и базилика эвгенольного, также входит в состав эфирного масла тысячелистника, пименты лекарственной и эвгенольной камеди [71, 77]. Наиболее распространенными источниками получения служит - гвоздичное дерево (Eugenia caryophyllata), которое содержит 17-20 % эфирного масла и базилик эвгенольный (Ocimum gratissimum L), информация о которых представлена в таблице ниже (Таблица 3) [80]. Из данной таблицы видно, что количество эвгенола в процентном отношении значительно выше у гвоздичного дерева (бутоны содержат до 20%), поэтому в качестве главного источника получения применяется гвоздичное масло, выделяемое из различных частей гвоздичного дерева (Приложение 3), которое содержит разные компоненты (Приложение 4). Главный компонент эфирного масла гвоздики - эвгенол 70-85%, ацетилэвгенол, карио-филлен, ванилин и другие (Рис. 3). Дубильные вещества составляют около 2%. Масло, полученное из различных частей гвоздичного дерева, представляет собой почти бесцветную или слегка желтоватую жидкость, приобретающую при хранении коричнево -пурпурный цвет, с острым пряным запахом и жгучим вкусом. Основным компонентом гвоздичного масла является эвгенол, процентное содержание которого варьируется в зависимости от того, из какой части растения его выделяют. Подлинность эфирного масла проверяют по нескольким показателям (Таблица 4) [60, 62]. Таблица 4. Физико-химические показатели эфирного масла гвоздичного дерева. Из эфирного масла чистый эвгенол получают водно-паровой дистилляцией в течение двух суток, а также из СОг экстрактов (Приложение 5) эфирного масла гвоздики и базилика эвгенольного (Приложение 6), химическим способом - путем аллилирования гваякола. Алли-лирование гваякола проводится с помощью катализатора - порошка меди, соответствующего ТУ 4451 - 94, температурный режим 87-115С. В этих условиях главное направление реакции выглядит следующим образом (Рис. 4): В промышленности душистые вещества (эвгенол, изоэвгенол, эвгенолацетат) получают из 2-метоксифенола (гваякола). При его алкилировании 3-гидрокси- или 3-хлорпропеном получают его 4-аллильное производное (эвгенол). В случае аллилового спирта применяют кислотные катализаторы. При использовании аллилхлорида процесс ведут на металлической меди. Затем эвгенол отделяют от изомерных алкилатов кристаллизацией (от 6-аллилпроизоводного) с карбонатом калия, а затем ректификацией под вакуумом (от 5-изомера). Эвгенол можно также синтезировать из гваякола его О-аллилированием (CuCl/HCl) с последующей О— С перегруппировкой аллильного заместителя по Кляйзену в присутствии BF3. Изомеризацию эвгенола в изоэвгенол осуществляют нагреванием в присутствии водного (50%-ного) раствора щелочи. При этом образуются смеси транс- и z/wc-изоэвгенолов в соотношении от 15:5 до 5:1. Оба изомера (эвгенол, изоэвгенол) имеют запах гвоздики, но у эвгенола он сильный, а у изоэвгенола ослабленный. Зато у последнего появляется выраженный мускатный аромат (изоэвгенол входит в состав пряности мускатного ореха, получаемой из плодов дерева Myristica fragrans (Рис. 5)).
Стандартные образцы
При разработке методик для определения эвгенола и примесного состава в стоматологических материалах, использовали эвгенол-стандарт фирмы «Merck» («Эвгенол чистый» (99%) 4 alIyI-2 methoxyphenol). Основные параметры, характеризующие «Стандарт», использованный при анализе, представлены в таблице ниже (Таблица 10). Для приготовления стандартных растворов с концентрацией 0.01 мг/мл (10 мкг/мл), 0.94 мг вещества эвгенола-стандарта («Merck» d = 1.066 г/мл) помещали в мерные колбы вместимостью 100 мл, доводили объем до метки этанолом. Стандартный раствор хранили при +5С не более 3 месяцев. Приготовление рабочих стандартных растворов. Для приготовления рабочих стандартных растворов для исследуемых жидких стоматологических материалов с концентрацией 0.1; 0.5; 1; 1.5; 2.5 мкг/мл, /; 5; 10; 15; 25 мл соответственно, стандартного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем до метки этанолом. Рабочий стандартный раствор хранили в холодильнике при +5С не более 2 недель. Дополнительно приготавливали 0.01; 0.1; 0.5 мкг/мл растворы для определения предела обнаружения эвгенола в исследуемых материалах. Для исследования пломбировочного материала готовились навески (25 штук) порошка, в который входили оксид цинка, сульфат бария, тимол, дексаметазон, и кальция фосфат, кальция оксид. Масса навески составляла 30 мг (что было приближено к количеству реально замешиваемого в клинической практике материала). Затем готовили пломбы с различной концентрацией эвгенола (10; 15; 25; 50; 100; 200 мкг/мл) по 5 каждой концентрации. Замешанные пломбы помещали в холодильник в хорошо укупоренных флаконах на 20 мл, хранили пломбы не более 1 месяца. Перед проведением исследований жидкие пробы в количестве 1 мл помещали во флаконы объемом 20 мл, добавляли 1 г хлорида натрия, закрывали герметичной крышкой и термостатировали при 80С в течение получаса. Затем автоматическим путем отбирали аликво-ту для исследования. Твердые образцы пломб размером до 100 мг растирали в ступке пестиком, переносили во флаконы на 20 мл, добавляли 1 мл дистиллированной воды, 1 г хлорида натрия. Далее термостатировали при 80С в течение получаса. Затем пробы устанавливали в кюветное отделение масс-спектрометра с заранее выбранным температурным режимом. 2.3. Оборудование и реактивы. Качество препаратов «Эвгенол стоматологический» трех фирм-производителей определяли по физико-химическим показателям, качественным реакциям, хроматографией в тонком слое сорбента, заложенными в ТУ (9336 - 058 - 45814830 - 01) и по показателям, нормируемым НД на фармацевтические препараты, его содержащие. Определение цвета, запаха и прозрачности по ГОСТ Р 5472 - 50. Растворимость в различных растворителях: для этого в качестве растворителей использовали этанол 70% марки «х.ч.», эфир «х.ч», хлороформ «х.ч» («ХимРеактив»). Определение показателя преломления: (EPh 6 edition 2007). Измерения проводились на рефрактометре лабораторном ИРФ-454Б2М (Рис. 13). Определение показателя преломления, как одного из показателей подлинности, проводили для материалов «Эвгенол стоматологический» фирм-производителей: «Омега Дент» (г. Москва), «ВладМива» (г. Белгород), «Радуга-Р» (г. Воронеж). Качественные реакции на эвгенол. Методика проведения качественных реакций. 1. Метод Ml. Реакция на фенольний гидроксил. Несколько капель эвгенола растворяют в 2 мл этилового спирта, прибавляют 1 каплю раствора хлорида железа (III) и серную кислоту. Появляется сине-зеленоватая окраска, меняющаяся на желтовато-зеленоватую, в течение 10 минут. 2. Метод М2. Реакция на непредельную двойную связь. Эвгенол, имея в пара-положении аллильный радикал, может бромироваться. Раствор брома в воде имеет бурую окраску. Продукты присоединения - бесцветны, что возможно использовать, как простой визуальный тест на непредельную двойную связь. 3. Метод МЗ, Реакция образования поликонденсатов. К 2 мл концентрированной серной кислоты (H2SO4) прибавляют 1 каплю эвгенола. Появляется красное окрашивание, свидетельствующее об образовании поликонденсатов, которые с течением времени застывают. Определение подлинности и родственные примеси проводили методом хроматографии в тонком слое сорбента. Методика заимствована из фармакопеи EPh 6 edition 2007 (проявители: ванилин, анисовый альдегид). На сегодняшний день в литературе [38, 133, 134, 169] описано большое количество методик, которые используются для идентификации компонентов эфирных масел, эвгенол не является в данном случае исключением. Для определения подлинности, а также родственных примесей Р-кариофиллена, ацетэв-генола, ванилина, изоэвгенола использовали метод хроматографии в тонком слое сорбента. Идентификацию пятен проводили по значению Rf, и по цвету и размеру пятен. Для исследования использовали пластинки фирмы «Merck» (10 10) Silica gel 60 F254. Система растворителей: бензол-хлороформ (9:1). В качестве проявителей использовали ванилин в 70% серной кислоте и анисовый альдегид. Детектором также служит УФ-облучатель.
Определение примесей, входящих в состав исследуемых стоматологических материалов методом ГХ-МС
Выбор стоматологических материалов на основе эвгенола на зарубежном и российском рынке достаточно богат, но главным критерием выбора лекарственного препарата должно быть его качество, так как побочные действия эвгенола и его примесей даже в небольших количествах могут оказывать различные реакции, вплоть до летального исхода. Поэтому для анализа качества исследуемой продукции были выбраны современные методы качественного и количественного анализа. Так, качественное и количественное определение компонентов, входящих в состав исследуемых стоматологических материалов, производилось методом газовой хроматографии с масс-селективным детектированием.
На сегодняшний день зарегистрировано множество препаратов под торговым названием «Эвгенол стоматологический», при этом, количественное нормирование во всех анализируемых препаратах осуществляется только по эвгенолу - его количество должно быть 99.6%, а примеси в стоматологической документации не нормируются, единственное отличие представляют зарубежные фармакопеи, в которых обозначены допустимые примеси (EPh 6th 2007, British Pharmakopea 2007).
В таблице ниже (Таблица 37) представленны данные о процентном содержании эвгенола и примесей в стоматологических материалах различных фирм - производителей согласно данным нормативной документации.
Как видно из приведенных данных (Таблица 37), нормирование происходит лишь основного компонента - эвгенола, а примеси не рассматриваются вовсе, хотя зачастую именно они являются провоцирующим фактором различных аллергических реакций, а не сам эвгенол.
Идентификацию компонентов, входящих в состав исследуемых образцов, а также определение примесей проводили методом ГХ-МС на газовом хроматографе фирмы «Agilent Technologies» (США) 6890N с масс-селективным детектором «Agilent 5973N».
Для этого, перед введением образцов исследуемых материалов, брали 1 мкл раствора анализируемого вещества, добавляли в него растворитель 0.5 мкл C2H5OH+CHCL3 (1:1) и термостатировали в течение 20 минут при температуре 60С. Масс-спектрометр работал в режиме снятия масс-спектров в диапазоне от 20 до 280 дальтон, в режиме SCAN по полному ионному току.
Предел обнаружения методики в описанных условиях, определяемый по минимально детектируемому количеству, дающему сигнал, превышающий тройной уровень флуктуации (3:1) базовой линии (шума), составил 5 мкг/мл (точность 0.005%).
Приведенные ниже хроматограммы (Рис. 42, Рис. 43, Рис. 44) с временами удерживания летучих компонентов исследуемых препаратов, наглядно демонстрируют примесный состав. Основные примеси обнаруженные в исследуемых препаратах - это терпеноидные (мо-но- и сесквитерпены) легколетучие соединения: Р-кариофиллен, ацетилэвгенол, изоэвгенол, кариофиллен оксид, ванилин, камфора, ментол, эвкалиптол, камфен, феландрен, Р-карен, а и р-пинены, копаен, цинеол, Р-иланген, р-оцимен, кадинол, а-гумулен.
После проведения хроматографирования масс-спектры, соответствующие вершинам хроматографических пиков, сравнивали с масс-спектрами библиотек (примеры масс-спектров библиотек приведены в Приложении 12).
Основной пик эвгенола может быть легко определен в каждом случае. Время удерживания (Rta6c) стандартного раствора эвгенола (при температуре 80С) составляет 5.814 минут (Рис. 42).
Характеристики Исследование этим методом «Эвгенола стоматологического» фирмы «ВладМива» (Рис. 44, Таблица 40) и фирмы «Радуга-Р» (Рис. 45, Таблица 41) выявило наличие примесей различного характера. Так как в состав анализируемых препаратов кроме эвгенола входят и другие компоненты, заявленные в составе, то время эксперимента было увеличено до 25 минут, с тем, чтобы выявить основные примеси, находящиеся в исследуемых образцах и определить их количественно. Все примеси, обнаруженные в ходе исследования можно разделить на 2 основные группы: «природного» и «синтетического» происхождения.
В группу примесей «природного начала» вошли в основном компаненты эфирного масла гвоздики - основного источника получения эвгенола, а в группу «синтетических» - вещества, изначально не содержащиеся в природном источнике, а значит получаемые, как промежуточные звенья в результате промышленного синтеза эвгенола.
![Совершенствование методов стандартизации лекарственных средств на основе корневищ радиолы розовой [Электронный ресурс]](/i/i/4381/176171.png "Совершенствование методов стандартизации лекарственных средств на основе корневищ радиолы розовой [Электронный ресурс] Петрова Елена Сергеевна")
