Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 10
1.1. Обзор нормативных документов по организации аналитической службы для контроля за оборотом наркотических средств .
1.2. Cовременные аспекты применения ВЭЖХ для определения наркотических средств и психотропных веществ .
1.2.1. Детектирование наркотических средств 16
1.2.2. Неподвижные фазы 19
1.2.3. Колонки для ВЭЖХ 21
1.2.4. Подвижная фаза 22
1.2.5. Контроль качества ВЭЖХ- исследований . 23
1.3. Современные аспекты применения ВЭЖХ для определения наркотических средств при судебно-химических исследованиях вещественных доказательств
1.3.1. ВЭЖХ- скрининг наркотических средств в криминалистике .
1.3.2. ВЭЖХ исследование опия 28
1.3.3. Применение метода ВЭЖХ при установлении общности источника происхождения героина
1.3.4. Криминалистическое и судебно-химическое исследование дезоморфина .
1.4. Современные аспекты применения метода ВЭЖХ для определения наркотических средств химико-токсикологическиом аналие...
1.4.1. Особенности пробоподготовки 43
1.4.2. Влияния биологической матрицы на хроматографическое поведение наркотических средств
1.4.3. ВЭЖХ как подтверждающий метод для обнаружения и определения опиатов при судебно-химическом и химико-токсикологическом анализе
1.4.4. Гидролиз при пробоподготовке 46
1.4.5. Изолирование опиатов из биологического материала 47
1.4.6. Изолирование опиатов из мочи методом твердофазовой экстракции .
Глава 2. Материалы и методы исследования . 51
2.1. Оборудование 51
2.2. Материалы и реактивы 51
2.3. Приготовление элюэнтов и градуировочных растворов 52
2.4. Подготовка объектов исследования 53
2.5. Дериватизация образцов 54
2.6. Изолирование морфина и кодеина из биологического материала . 54
2.7. Подготовка извлечения для определения методом ВЭЖХ 56
2.8. Условия хроматографического определения 57
Глава 3. Результаты и их обсуждение 59
3.1. Выбор режима хроматографического разделения 59
3.2. Применение метода ВЭЖХ при установлении общности источника происхождения опия
3.3. Оптимизация методики определения героина методом ВЭЖХ в наркотических средствах с целью установления общности источника происхождения и создания коллекции образцов
3.4. Оптимизация методики определения дезоморфина при экспертно криминалистических и химико-токсикологических исследованиях .
3.5. Усовершенствование методики определения морфина и кодеина в биологических объектах с применением метода ВЭЖХ
3.5.1. Подготовка пробы к анализу 98
3.5.2. Идентификация опиатов хроматографическим методом.. 106
3.5.3. Количественное определение опиатов хроматографическим методом
3.5.4. Исследование опиатов с применением жидкостного хроматографа с масс - селективным детектором
Список литературы 123
Приложение . 142
Благодарности
- Cовременные аспекты применения ВЭЖХ для определения наркотических средств и психотропных веществ
- Криминалистическое и судебно-химическое исследование дезоморфина .
- Приготовление элюэнтов и градуировочных растворов
- Оптимизация методики определения героина методом ВЭЖХ в наркотических средствах с целью установления общности источника происхождения и создания коллекции образцов
Введение к работе
Актуальность темы. Идентификация и определение содержания наркотических средств (НС) в биологических материалах, лекарственных средствах и вещественных доказательствах играют важную роль в криминалистике, судебной химии, клинической лабораторной диагностике и фармацевтическом анализе. С этой целью возможно использование высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), особенно ее микроколоночного варианта. Метод позволяет идентифицировать полярные и термолабильные вещества, существенно повышая качество и достоверность исследований и снижая их стоимость.
Однако использование микроколоночного ВЭЖХ в рутинном токсикологическом анализе, в криминалистической и медицинской практике ограничено из-за отсутствия унифицированных методик.
Совершенствование и унификация методик определения наркотических средств, в том числе опиатов (морфина, кодеина, диацетилморфина, моноацетилморфина, дезоморфина и др.), позволит расширить область использования ВЭЖХ в экспертной практике, повысит достоверность фармацевтического и клинического анализа, увеличит объективность рассмотрения административных и уголовных дел в судебной практике.
Цель работы: Разработка и совершенствование методик микроколопочного ВЭЖХ-определения алкалоидов ония и способов интерпретации результатов анализа.
В соответствии с поставленной целью определены следующие задачи:
-
Оптимизировать и унифицировать процедуру пробоподготовки образцов наркотических средств (НС) для определения в них опиатов методом микроколоночной ВЭЖХ.
-
Оптимизировать методику микроколоночного ВЭЖХ- определения опия и героина для выбора идентификационных признаков и установления общности источника происхождения НС.
-
Разработать алгоритм оценки идентичности образцов героина по содержанию 6-моноацетилморфина, диацетилморфина, кодеина, морфина, наркотина для оперативного отслеживания поступления наркотических средств в регион.
4. Исследовать возможности применения микроколоночной ВЭЖХ для
идентификации компонентов кустарно изготавливаемого НС на основе дезоморфина.
5. Разработать методики ВЭЖХ - определения опиатов в биологических материалах (кровь моча, печень, желчь) с использованием УФ- и масс - селективного детекторов.
Научная новизна исследования.
-
Впервые разработаны экономичные методики сравнительного исследования наркотических средств опия, героина с применением микроколоночной ВЭЖХ, позволяющие сократить длительность и стоимость анализа.
-
Выявлены идентификационные признаки, по которым устанавливают общность источника происхождения НС и формируют базы данных об образцах. Эта информация позволяет проследить пути распространения и перемещения наркотического средства.
-
Предложен уникальный подход для оценки идентичности образцов героина (метод многофакторного анализа): по значению угла между парами векторов, размер которых соответствует площадям хроматографических пиков пяти основных компонентов героина (б-моноацетилморфина, диацетилморфина, кодеина, морфина, наркотина).
-
Впервые в экспертных образцах и биологическом материале идентифицирован 7,8-дидегидродезоморфин (побочный продукт синтеза дезоморфина). Для дезоморфина и 7,8-дидегидродезоморфина определены времена удерживания, УФ- и масс-спектральные характеристики.
-
Разработаны методики качественного и количественного определения морфина и кодеина в крови, моче, желчи и тканях печени с применением ВЭЖХ с УФ-и масс-селективпым детектором в двух режимах работы по выбранным ионам. Отличителыше особенности методик: использование малого количества биоматериала (2-6 г); высокая воспроизводимость результатов (среднее значение относительной погрешности 10%), низкий предел определения (до 0,02 мкг/мл (г)).
Практическая значимость работы.
Создана база данных в виде компьютерной программы, содержащая хроматографические данные об образцах героина (более 300), позволяющая выявлять образцы с общим источником происхождения по сырью.
Разработанные методики с 2004 г. внедрены в повседневный токсикологический анализ при проведении экспертиз с целью идентификации и определения содержания опиатов в образцах НС, а также при сравнительных экспертизах героина и опия в ЭКО
Управленій Федеральной службы РФ но контролю за оборотом наркотиков по Кемеровской области (Акт внедрения № 56/2372 от 28 февраля 2008 г.).
Разработанные методики определешм морфина и кодеина в биологическом материале с 2004 г. используют в химико-токсикологической лаборатории ГУЗ "Кемеровский областной клинический наркологический диспансер" и в химическом отделении Кемеровского областного бюро судебно-медицинской экспертизы для проведения химико-токсикологических и судебно-химических исследований.
С 2010 г. разработанные методики определения морфина и кодеина в биологическом материале используют в экспертной практике отделения общих химических методов исследования Бюро судебно-медицинской экспертизы Департамента здравоохранения г. Москвы. Методика модифицирована для ВЭЖХ с одноквадрупольным масс-селективиым детектором.
По результатам исследований подготовлены и внедрены два рационализаторских предложения для использования в экспертной практике:
-
Удостоверение на рационализаторское предложение № 116 от 25.06.2007 г., принятое Бюро судебно-медицинской экспертизы ДОЗН Кемеровской области к использованию под наименованием «Способ очистки гидролизатов биоматериала при количественном определении морфина и кодеина методом ВЭЖХ с помощью амилового спирта»
-
Удостоверение на рационализаторское предложение №115/2 от 28.05.2007 г., принятое Бюро судебно-медицинской экспертизы ДОЗН Кемеровской области к использованию под наименованием «Способ подщелачивания кислотных гидролизатов биоматериала при судебно-химическом исследовании на алкалоиды опия».
Результаты исследований явились основой для издания Информационного письма ФГБУ Российского центра судебно-медицинской экспертизы Минздравсоцразвития России «Об определении морфина и кодеина в моче и желчи с применением тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии» (Москва, 2010 г.).
Апробация работы. Основные результаты работы представлеіпа в устных докладах на Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы химико-токсикологического анализа наркотических средств» (г. Санкт-Петербург, 1999 г.); научно-практической конференции «Непрерывное последипломное образование - инвестиции в здравоохранение России» посвященной 25-летию факультета последипломного образования
провизоров (г. Москва, 2005 г.); всероссийском симпозиуме «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия» посвещенный к 100-летию со дій рождения профессора Л.В. Киселева). Москва - Клязьма 14 - 18 апреля 2008 г; VIII научной конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока ». Томск 13-18 октября 2008 г.; научно-практической конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки РСФСР, профессора О.Х. Поркшеяна (г. Москва, МГСУ, 2010 г.); научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы судебно-медицинской экспертизы» (г. Москва, 2012 г.), объединенном научном семинаре кафедры фармацевтической и токсикологической химии, кафедры биохимии, кафедры общей и клинической фармакологии и лаборатории физико-химических методов исследования ЦКП (НОЦ) РУДН (Москва, 25.01.2013), на заседании секции по поиску биологически активных веществ, технологии получения лекарств, фармацевтической химии, фармакогнозии Ученого совета ГНУ ВИЛАР Россельхозакадемии от 25 октября 2013 г.
Личное участие автора. Данные, приведенные в диссертации, получены при непосредственном участии автора как на этапах постановки задач и разработки методических подходов к их выполнению, так и при наборе первичных фактических данных, статистической обработке и анализе полученных результатов и написании публикаций. Диссертация и автореферат написаны лично автором.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности по специальности 14.04.02 -фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют пункту 3 «Разработка новых, совершенствование, унификация и валидация существующих методов контроля качества лекарственных средств на этапах их разработки, производства и потребления»; пункту 4 «Разработка методов анализа лекарственных веществ и их метаболитов в биологических объектах для фармакокинетических исследований, эколого-фармацевтического мониторинга, судебно-химической и наркологической экспертизы».
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, из них 8 статей, 6 в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК РФ, 2 - в зарубежной печати, тезисы к 7 докладам.
На защиту выносятся следующие положения:
-
Усовершенствование методики микроколоночного ВЭЖХ определения опия и героина с целью установления общности источника происхождения.
-
Усовершенствование процедуры создания базы данных по НС для экспертно-криминалистических учреждений. Разработка алгоритма обработки хроматографических
данных.
-
Оптимизация методики определения дезоморфина при экспертно-криминалистических и химико-токсикологических исследованиях.
-
Усовершенствование методики ВЭЖХ определения морфина и кодеина в биологическом материале с применением внутреннего стандарта (ВС) - налтрексона.
-
Особенности применения разработанных методик определения опиатов при исследования на жидкостных хроматографах Agilent 1200, Agilent Technologies, США с масс-селективными детекторами 6110.
Объем и структура диссертации.
Cовременные аспекты применения ВЭЖХ для определения наркотических средств и психотропных веществ
Практическая значимость работы. Создана база данных в виде компьютерной программы, содержащая хроматографические данные об образцах героина (более 300), позволяющая выявлять образцы с общим источником происхождения по сырью. Разработанные методики с 2004 г. внедрены в повседневный токсикологический анализ при проведении экспертиз с целью идентификации и определения содержания опиатов в образцах НС, а также при сравнительных экспертизах героина и опия в ЭКО Управления Федеральной службы РФ по контролю за оборотом наркотиков по Кемеровской области (Акт внедрения № 56/2372 от 28 февраля 2008 г.).
Разработанные методики определения морфина и кодеина в биологическом материале с 2004 г. используют в химико-токсикологической лаборатории ГУЗ "Кемеровский областной клинический наркологический диспансер" и в химическом отделении Кемеровского областного бюро судебно-медицинской экспертизы для проведения химико-токсикологических и судебно-химических исследований.
С 2010 г. разработанные методики определения морфина и кодеина в биологическом материале используют в экспертной практике отделения общих химических методов исследования Бюро судебно-медицинской экспертизы Департамента здравоохранения г. Москвы. Методика модифицирована для ВЭЖХ с одноквадрупольным масс-селективным детектором.
По результатам исследований подготовлены и внедрены два рационализаторских предложения для использования в экспертной практике:
1. Удостоверение на рационализаторское предложение № 116 от 25.06.2007 г., принятое Бюро судебно-медицинской экспертизы ДОЗН Кемеровской области к использованию под наименованием «Способ очистки гидролизатов биоматериала при количественном определении морфина и кодеина методом ВЭЖХ с помощью амилового спирта»
2. Удостоверение на рационализаторское предложение №115/2 от 28.05.2007 г., принятое Бюро судебно-медицинской экспертизы ДОЗН Кемеровской области к использованию под наименованием «Способ подщелачивания кислотных гидролизатов биоматериала при судебно-химическом исследовании на алкалоиды опия». Результаты исследований явились основой для издания Информационного письма ФГБУ Российского центра судебно-медицинской экспертизы Минздравсоцразвития России «Об определении морфина и кодеина в моче и желчи с применением тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии» (Москва, 2010 г.).
Результаты исследований внедрены в учебный процесс кафедры фармацевтической и токсикологической химии Российского университета дружбы народов – дисциплина «Токсикологическая химия» и раздел «Современные методы контроля качества лекарственных средств» дисциплины «Фармацевтическая химия», а также используются в лекциях и на лабораторных занятиях для слушателей курсов ДПО. Апробация работы. Основные результаты работы представлены в устных докладах на Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы химико-токсикологического анализа наркотических средств» (г. Санкт Петербург, 1999 г.); научно-практической конференции «Непрерывное последипломное образование – инвестиции в здравоохранение России» посвященной 25-летию факультета последипломного образования провизоров (г. Москва, 2005 г.); всероссийском симпозиуме «Хроматография и хромато- масс спектрометрия» просвещенный к 100-летию со дня рождения профессора А.В. Киселева). Москва – Клязьма 14 - 18 апреля 2008 г; VIII научной конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока ». Томск 13-18 октября 2008 г.; научно практической конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки РСФСР, профессора О.Х. Поркшеяна (г. Москва, МГСУ, 2010 г.); научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы судебно-медицинской экспертизы» (г. Москва, 2012 г.), объединенном научном семинаре кафедры фармацевтической и токсикологической химии, кафедры биохимии, кафедры общей и клинической фармакологии и лаборатории физико-химических методов исследования ЦКП (НОЦ) РУДН (Москва, 25.01.2013), на заседании секции по поиску биологически активных веществ, технологии получения лекарств, фармацевтической химии, фармакогнозии Ученого совета ГНУ ВИЛАР Россельхозакадемии от 25 октября 2013 г. Личное участие автора. Данные, приведенные в диссертации, получены при непосредственном участии автора как на этапах постановки задач и разработки методических подходов к их выполнению, так и при наборе первичных фактических данных, статистической обработке и анализе полученных результатов и написании публикаций. Диссертация и автореферат написаны лично автором.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности по специальности 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведённого исследования соответствуют пункту 3 «Разработка новых, совершенствование, унификация и валидация существующих методов контроля качества лекарственных средств на этапах их разработки, производства и потребления»; пункту 4 «Разработка методов анализа лекарственных веществ и их метаболитов в биологических объектах для фармакокинетических исследований, эколого фармацевтического мониторинга, судебно-химической и наркологической экспертизы». Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ, из них 8 статей,6 из которых – в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК РФ, 2 – в зарубежной печати;. 2 рационализаторских предложения, 1 Информационное письмо, тезисы к 7 докладам.
Криминалистическое и судебно-химическое исследование дезоморфина .
Применяемые в практике экспертных исследований НС колонки для ВЭЖХ могут значительно отличаться по своим размерам. Типичные колонки имеют внутренний диаметр 4,0-4,6 мм, длину 100-150 мм, иногда до 250 мм. Уменьшение длины колонки позволяет сократить длительность анализа и уменьшить расход растворителей [7, 71, 171].
Благодаря разработке современного хроматографического оборудования в последние годы стали широко использоваться микроколонки с диаметром 1-2 мм и длиной 100-250 мм. В работе [167] описано разделение морфина и его глюкуронидов в крови и волосах на микроколонке с сорбентом С-18 размерами 2 100 мм, что особенно актуально при работе с масс- селективными детекторами.
Для успешного разделения многих НС достаточно иметь колонки с эффективностью 5000 т.т. При подборе оптимальных условий анализа при такой эффективности возможно сократить длину колонки до 50-100 мм. Однако следует учитывать и возможное снижение эффективности колонки при исследовании определенных НС из-за высокого фона примесей, содержащихся в объекте, или при исследовании биологического материала, содержащего НС. Для стандартных колонок размером 4,6х250 мм количество анализируемого вещества в пробе не должно быть больше 4-40 мкг. Оптимальная скорость подвижной фазы для таких колонок примерно 1 мл/мин. При повышении скорости элюента эффективность колонки может снижаться. У колонок длиною 50-100 мм, при той же эффективности, скорость подвижной фазы находится на уровне 0,1 мл/мин, что значительно экономит дорогостоящие элюенты.
Современное хроматографическое оборудование позволяет использовать микро- и капиллярные колонки, особенно в сочетании их с масс-селективным детектором. Диаметр микроколонок может составлять 1-2,1 мм и длина - от 39 мм. Для таких колонок оптимальная скорость элюента - 100-500 мкл/мин. Капиллярные колонки имеют размеры в диаметре 0,5-1 мм, скорость элюента для них 100 мкл/мин, при этом время хроматографирования удается снизить до 1-2 минут.
Подвижная фаза Селективность хроматоргафического разделения на колонке во многом зависит от правильного подбора подвижной фазы, ее состава и свойств. Одна из фундаментальных работ по применению растворителей в качестве подвижной фазы для ВЭЖХ представлена в монографии [44].
При анализе в режиме обращено-фазовой хроматографии для вытеснения веществ с колонки используют различные органические растворители, которые смешивают с водными растворами солей или с водой. Некоторые подвижные фазы могут содержать до 4 компонентов растворителей, что необходимо для эффективного разделения веществ. В практике в качестве органических растворителей часто используют ацетонитрил, метанол и некоторые другие спирты. Эти вещества не оказывают влияния на анализируемые соединения и процесс детектирования, хорошо смешиваются с водой и обладают низкой плотностью [143].
Применяемый растворитель должен иметь степень химической очистки для ВЭЖХ, обладать строго определенными пределами содержания флуоресцирующих и УФ-поглощающих примесей, не содержать микрочастиц. Исследуемые НС часто имеют многокомпонентный состав, содержат разнообразные примеси или продукты метаболизма. Для их эффективного разделения целесообразно использовать градиентный режим элюирования, при котором концентрация органического растворителя в процессе хроматографирования повышается. Подбор градиента осуществляется опытным путем или с помощью существующих компьютерных программ [81, 88]. Для исследования индивидуальных веществ, не содержащих примесей, можно использовать изократический режим элюирования. Для удаления растворенного в подвижной фазе воздуха необходимо использовать вакуумную дегазацию или дегазацию гелием. Попадание воздушных пузырьков из подвижной фазы в насос снижается скорость подачи элюента, а при попадании в детектор приводит к получению на хроматограмме ложных пиков.
Применяемые в ВЭЖХ подвижные фазы должны иметь стабильные значения рН и ионной силы. Для этого в фазу добавляют буферные системы (фосфатный или др. буфер) [166, 174], перхлорат лития [21], сульфат аммония или натрия. Обычно исследование НС проводят при слабокислых или нейтральных значениях рН. Подбирается оптимальное значение рН подвижной фазы в пределах стабильности сорбента [180].
Для стабильности и воспроизводимость результатов хроматографического анализа необходимо использовать термостатирование колонки. Повышение температуры влияет на степень диссоциации ионогенных веществ [180], снижает вязкость подвижной фазы и давление в колонке, а также повышается вероятность образование в элюэне микропузырьков воздуха.
Экспертные исследования НС требуют применения утвержденных стандартных методик. Такие методики позволяют контролировать целый ряд параметров, влияющих на качество проводимых анализов. Типичные аналитические характеристики, оцениваемые в контроле качества ВЭЖХ-исследований, могут включать точность, специфичность, предел обнаружения вещества, предел количественного определения, линейности.
Важное значение в контроле качества ВЭЖХ-исследований имеет использование тестовых контрольных образцов, которые позволяют оценить всю ВЭЖХ-систему: качество применяемых реактивов, надежность работы прибора, качество подготовки пробы и др.
В настоящее время использование таких тестов широко распространено в зарубежных лабораториях, занимающихся экспертными исследованиями НС, контролем качества лекарственных препаратов, пищевых продуктов и т.п. В России проблема создания надежной системы контроля качества экспертных и др. исследований пока остается нерешенной. Оценка результатов исследования на жидкостном хроматографе, их правильная трактовка - одна из основных задач, которую ежедневно приходится решать аналитику. Для получения объективной информации необходимо учитывать следующие параметры: правильность, воспроизводимость, линейность, линейный диапазон, специфичность, предел обнаружения, нижнюю границу концентраций определяемых соединений, надежность, чувствительность и пригодность системы. Каждый из этих параметров получают из статистического анализа результатов эксперимента [8, 11, 38].
Согласно литературным данным, правильность есть мера того, насколько близко даваемый методом результат к «истинному». Чтобы оценить правильность метода используют стандартные образцы сравнения. Допустимое отклонение от «истинного» содержания устанавливается таким, чтобы удовлетворять потребностям анализа. Воспроизводимость есть мера способности метода давать «одинаковый» результат при многократном анализе одно и того же образца. Воспроизводимость анализа часто выражается в виде относительного стандартного отклонения. Чем меньше относительное стандартное отклонение, тем меньше разброс данных. Оценивая воспроизводимость метода анализа, начиная с этапа отбора образцов и заканчивая интегрированием хроматографичекого пика, мы получаем разброс данных, вызванный проведением анализа. Сопоставляют разброс данных метода и разброс данных анализа разных образцов, если они статистически одинаковы, то можно предположить, что образцы одинаковы.
Линейность - это зависимость между откликом детектора и концентрацией определяемого вещества. Линейность зависимости определяют с помощью регрессионного анализа. Часто она выражается в виде коэффициента корреляции.
Линейный и рабочий диапазон устанавливают экспериментально и определяют с помощью верхнего и нижнего значения. Все точки внутри этого диапазона должны удовлетворять установленному для данного метода критерию правильности, воспрооизводимости и линейности. Когда линейный диапазон определен, полученный график зависимости отклика от концентрации часто называют градировочной кривой.
Приготовление элюэнтов и градуировочных растворов
Моча: 6 мл исследуемой мочи помещали в стеклянный флакон емкостью 20 мл, добавляли 2 мл концентрированной соляной кислоты, закрывали пробкой и фиксировали зажимом. Флакон помещали в кипящую водяную баню на 1 час или в автоклав при 1,1атм. на 30 минут. После охлаждения полученный гидролизат центрифугировали при 3000 об/мин в течение 2 минут, центрифугат переносили во флакон емкостью 20 мл. К осадку добавляли 2 мл воды, перемешивали и повторно центрифугировали. Центрифугаты объединяли.
К полученному центрифугату добавляли 0,3 мл водного раствора налтрексона с концентрацией 0,5 мг/мл, перемешивали и выдерживали 15 минут при комнатной температуре. Затем добавляли 2 мл амилового спирта, встряхивали в течение 2 минут, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 2 минут. Верхний органический слой отделяли. Водную фазу повторно экстрагировали 6 мл диэтилового эфира при описанных выше условиях, органический слой отделяли.
К водной фазе добавляли 2 мл 50% раствора гидроксида натрия, перемешивали и проверяли значение рН (рН смеси должно находиться в пределах 11-12 по универсальному индикатору). Затем к охлажденному раствору добавляли кристаллический гидрокарбонат натрия до насыщения (около 2 г), контролируя рН (значение рН должно быть 8-9 по универсальному индикатору). После этого прибавляли 4 мл смеси хлороформа и изопропилового спирта (9:1), встряхивали в течение 2 минут, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 2 минут. Нижний органический слой отделяли, фильтровали через безводный сульфат натрия (в воронку над ватным тампоном, смоченным хлороформом, помещали около 1 г безводного сульфата натрия), в градуированную пробирку емкостью 10 мл. Экстракцию повторяли еще 2 раза по 4 и 3 мл смеси хлороформ- изопропиловый спирт (9:1), фильтровали в ту же пробирку. Воронку промывали хлороформом, доводя объем полученного извлечения до 9 мл.
Желчь: 6 мл исследуемой желчи (или доступное количество желчи не менее 2 мл, доведенное водой до 6 мл) помещали в стеклянный флакон емкостью 15 мл, добавляли 2 мл концентрированной соляной кислоты, закрывали пробкой и фиксировали зажимом. Флакон помещали в кипящую водяную баню на 1 час. После охлаждения полученный гидролизат центрифугировали при 3000 об/мин в течение 2 минут. Центрифугат переносили во флакон емкостью 20 мл. К осадку добавляли 2 мл воды, перемешивали и повторно центрифугировали. Центрифугаты объединяли.
К полученному раствору добавляли 0,3 мл (или из расчета 0,1 мл на 2 мл желчи) водного раствора налтрексона с концентрацией 0,5 мг/мл, перемешивали и выдерживали 15 минут при комнатной температуре. Далее изолировали также, как мочу.
Печень: К 6 г мелкоизмельченной печени (средняя проба из 30 г) добавляли 10 мл 18% раствора соляной кислоты, гидролизовали в течение 60 минут в термостате в герметично закрытом флаконе емкостью 16 мл при температуре 120оС. Гидролизат охлаждали, фильтровали. Остаток органов и фильтр промывали 18% раствором соляной кислоты до 10 мл общего объема гидролизата.
К фильтрату гидролизата добавляли 0,2 мл раствора налтрексона с концентрацией 0,15 мг/мл, оставляли на 15 минут. Затем экстрагировали в течение 3 минут 2 мл амилового спирта, раствор центрифугировали при 3000 об/мин в течение 3 мин, органическую фазу отбрасывали. После этого водную фазу экстрагировали 4 мл диэтилового эфира в течение 3 минут. Раствор центрифугировали при 3000 об/мин в течение 3 мин., органическую фазу отбрасывали. К водной фазе добавляли 1-2 мл 50% раствора едкого натра до рН = 10 - 11 (по универсальному индикатору), после охлаждения добавляли 1г кристаллического гидрокарбоната натрия до насыщения раствора. Полученный раствор трижды экстрагировали смесью: хлороформ - изопропанол (9:1) порциями по 4 мл. Извлечение фильтровали в градуированную пробирку через слой безводного сульфата натрия, помещенного на небольшой тампон ваты. Объём фильтрата доводили до 12 мл, перемешивали.
Кровь: К 3 мл крови добавляли 1 мл 6% раствора трихлоруксусной кислоты, 2 мл 18% раствора соляной кислоты и гидролизовали в герметично закрытом флаконе емкостью 16 мл в течение 60 минут в термостате при температуре 120С. Гидролизат охлаждали, центрифугировали, фильтровали, фильтр промывали 18% раствором соляной кислоты до 6 мл общего объема гидролизата. Далее изолировали также, как печень.
Подготовка извлечения для определения методом ВЭЖХ 3 мл щелочного извлечения, соответствующие 2 мл желчи или мочи, 2 мл извлечения (соответствующие 1г печени), 12 мл извлечения (соответствующие 3 мл крови) выпаривали досуха в токе азота на водяной бане при температуре не более 60оС. К сухому остатку добавляли 50 мкл хлороформа и 200 мкл 0,2М раствора перхлората лития в 0,01М хлорной кислоте (раствора А). Пробирку закрывали крышкой, встряхивали в течение 2 минут, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 2 минут. 4-10 мкл водной фазы исследовали методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе.
Условия хроматографического определения. Условия хроматографического определения НС методом ВЭЖХ. Жидкостную хроматографию проводили на хромтографе «Милихром А-02» с УФ детектором (ЗАО "ЭкоНова", г. Новосибирск). Условия хроматографирования: колонка Protosil-120-5-C18 AQ размер 2,8 80 мм; подвижная фаза «А» - (4М LiCLO4-0,lM HCL04.) :Н2О (95:5); подвижная фаза «Б» - ацетонитрил марки «для ВЭЖХ»; градиент от 5 до 100% подвижной фазы «Б» в объеме 4000 мкл, затем 100% подвижной фазы «Б» в объеме до 4500 мкл; скорость подачи элюента 100 мкл/мин, температура колонки 40С. Детектирование проводили в многоволновом режиме при длинах волн 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 и 300 нм. Объем вводимой пробы 4 мкл.
Условия хроматографического определения морфина и кодеина методом ВЭЖХ с масс- селективным детектором.
Исследовали на жидкостном хроматографе Agilent 1200, Agilent Technologies (США) с масс - селективным детектором Agilent 6110 Quadrapole LC/MS с источником ионизации электрораспылением (ES). Режим ES - поток газа-осушителя 12 л/мин, температура газа-осушителя (азота) 350оС, давление nebulizer 45 psig.
Режим хроматографирования: колонка стальная размерами 4,6 150 мм, заполнена обращено - фазовым сорбентом Zorbax Eclipse XDB-C18 с размером частиц - 5 мкм. Подвижная фаза: раствор А - 0,1% раствор муравьиной кислоты, раствор В - ацетонитрил. Скорость хроматографирования 1 мл/мин. Хроматографирование проводили в градиентном режиме, изменяя содержание ацетонитрила: начальную концентрацию 5% ацетонитрила выдерживали в течение 1 минуты, далее увеличивали концентрацию ацетонитрила до 70% в течение 20 минут.
Оптимизация методики определения героина методом ВЭЖХ в наркотических средствах с целью установления общности источника происхождения и создания коллекции образцов
По описанной выше методике нами было проведено более 100 определений морфина и кодеина в моче и желчи человека. Исследования выполняли по мере поступления биоматериала в течение 3 месяцев. Для оценки внутрилабораторной воспроизводимости пробоподготовку объектов (изолирование по методике, описанной в разделе 3.4.1.) осуществляли разные эксперты лаборатории. Результаты исследований представлены в таблице №3.33.
Среднее значение площади пика налтрексона в моче составило 33,95 с доверительным интервалом 3,14, для кодеина - 34,41 с доверительным интервалом 2,75, что хорошо коррелирует с результатами анализа модельных смесей (см. табл. 3.32).
Как видно из табл. 3.33, результаты анализа поступивших в судебно-химическое отделение реальных образцов биоматериала хорошо коррелируют с результатами анализа модельных смесей (см. табл. 3.31). Только 5% хроматограмм имели значения отношения площадей меньше контрольных значений, представленных в таблице 3.31.
В 40% проб мочи и 75% проб желчи обнаружен только морфин. Отсутствие кодеина в биожидкостях (или его содержание в концентрациях, ниже предела обнаружения используемого метода), видимо, обусловлено употреблением героина.
Как было сказано выше, основная проблема идентификации пиков - наличие соэкстрактивных веществ в зоне исследуемых компонентов. Для оценки количества соэкстрактивных веществ, попадающих в пробу, по описанной выше методике исследовали 83 образца мочи и желчи, поступающих в судебно-химическое отделение в течение 1 месяца с целью определения опиатов. При этом в 16 образцах (12-моча и 4-желчь) морфин и кодеин не обнаружены, в 54 образцах (16-моча и 38-желчь) был обнаружен только морфин, в 13 образцах мочи идентифицированы морфин и кодеин.
Морфин был обнаружен в образцах мочи в концентрациях от 0,2 мкг до 53,5 мкг в 1 мл объекта, в желчи - от 0,8 мкг до 208,8 мкг в 1 мл объекта. Содержание кодеина в моче составляло от 0,1 мкг до 2,2 мкг в 1 мл объекта.
Концентрации соэкстрактивных веществ рассчитывали, как относительную концентрацию от суммы всех размеченных пиков по формуле: Ссоэк (%) =(Sсумма- Sиден) 100/ Sсумма где Ссоэк - содержание соэкстрактивных веществ, %; Sсумм. - сумма площадей всех пиков; Sидент - сумма площадей пиков морфина, кодеина и налтрексона. Условия разметки хроматограмм: интервал времени от 8 до 22 мин (зона морфин - налтрексон), отбрасываемая площадь 10,0, склон чувствительности 0,5, ширина пика 0,1. Количество соэктрактивных веществ в моче составило от 0,06 до 60 %, в желчи -0,08 до 42%; в пробах, не содержащих морфин и кодеин - от 2 до 33%. Более 30% соэкстрактивных веществ обнаружено только в 7 образцах из 83 , при этом спектральные отношения исследуемых веществ были в допустимых пределах. На основании проведенных исследований можно предложить следующий алгоритм оценки результатов судебно-химического исследования морфина и кодеина в моче и желчи. Идентификация пиков: - идентификацию хроматографических пиков проводят путем сравнения с хроматографическими пиками стандартных растворов морфина, кодеина и налтрексона по основным параметрам: времени удерживания, площади пика, спектральным отношениям и значениям угла . - если отношение площадей пиков морфина (кодеина)/ВС больше 3,0 е.о. мкл, необходимо провести повторное исследование, взяв меньшее количество биообъекта. - если отношение площадей пиков морфина (кодеина)/ВС меньше 0,05 для мочи и 0,003 для желчи, то достоверно провести количественное определение этих объектов невозможно. - если площадь пика налтрексона больше 70 о.е мкл, необходимо исключить его наличие в исследуемом объекте повторным изолированием без добавления налтрексона. - если площадь пика налтрексона меньше 25 о.е мкл, изолирование веществ проведено неудовлетворительно, необходимо повторить пробоподготовку с новой порцией мочи или желчи. - если идентификация пиков по спектральным отношениям не удовлетворительна (значения 5о), то необходимо провести дополнительную очистку извлечения, как описано выше. - если отклонения спектральных отношений вновь превышают допустимые значения, то проводить исследование извлечения данным методом нецелесообразно, при этом остаток извлечения можно исследовать альтернативными методами, например, методом ВЭЖХ-МС или ГХ-МС. - если концентрации морфина и кодеина находятся за пределами определения или отношение площадей пиков ниже минимального значения, провести количественное определение невозможно. В этом случае делают заключение об обнаружении морфина или кодеина в следовых количествах.
Ограничением для качественного и количественного определения являются высокие концентрации соэкстрактивных веществ по сравнению с концентрациями исследуемых веществ.
Таким образом, нами были оптимизированы этапы изолирования, обнаружения и количественного определения морфина и кодеина при судебно химическом и химико-токсикологическом исследовании биологического материала. Разработанная методика позволяет изолировать из биоматериала 40 60% общего морфина и кодеина. Предел обнаружения равен 0,1-0,2 мкг вещества в
Исследование опиатов с применением жидкостного хроматографа с масс - селективным детектором Для судебно-медицинской оценки отравления опиатами, кроме мочи и желчи, необходимо исследовать кровь. Однако представленная выше методика, разработанная для определения на жидкостном хроматографе со спектрофотометрическим детектором, по уровню чувствительности позволяет идентифицировать только достаточно высокие концентрации опиатов в крови – 0,2 мкг/мл и выше. Поэтому для расширения возможности применения разработанной методики мы провели исследование с применением жидкостного хроматографа с масс-селективным детектором (Agilent Technologies 1200). Учитывая особенности детектора, были внесены незначительные изменения в режим хроматографирования и процедуру пробоподготовки. Условия хроматографического разделения описаны в экспериментальной части данной работы (см. гл.2).
В качестве детектора использовали одноквадрупольный масс - селективный детектор (QS) Agilent 6110 Quadrupole LC/MS. Источник ионизации -электрораспыление (ESI), что обусловлено физико-химическими свойствами исследуемых веществ, и чаще всего описывается в литературе [28].
