Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 12
1.1 Биологическая роль лактобактерий 12
1.1.1. Иммуностимулирующая активность лактобактерий 14
1.1.2. Лекарственные препараты и применение ИМП 20
1.2. Способы получения микробных гидролизатов 24
1.3. Общая характеристика и методы анализа основных биологически активных веществ микробных гидролизатов 27
1.3.1. Общая характеристика и методы анализа белковых веществ, входящих в состав микробных гидролизатов 27
Глава 2 Разработка методик анализа биологически активных веществ гидролизатов молочнокислых бактерий 36
2.1. Разработка методики количественного определения общего белка 36
2.2. Разработка методики количественного определения общего содержания пептидов с молекулярной массой менее 1500 50
2.3. Разработка методики количественного определения общего содержания аминокислот 55
2.4. Разработка методики количественного определения ГМДП в гидролизатах молочнокислых бактерий методом капиллярного электрофореза 60
Глава 3. Разработка оптимального способа получения гидролизата молочнокислых бактерий 79
3.1. Получение гидролизатов методом термокислотного гидролиза 79
3.2. Получение гидролизатов методом ферментативного гидролиза 84
3.3. Выбор оптимального консерванта 96
3.4. Разработка методики качественного и количественного определения нипагина методом ВЭЖХ 102
Глава 4. Стандартизация лекарственного препарата на основе гидролизата молочнокислых бактерий («Биолактон») 110
4.1. Описание 110
4.2. Сухой остаток 110
4.3. Подлинность 111
4.4. Потенциометрическое определение раствора (рН) 114
4.5. Номинальный объем 115
4.6. Микробиологическая чистота 115
4.7. Количественное определение 118
4.8. Определение срока годности «Биолактона» 132
Глава 5 Изучение фармакологической активности лекарственного препарата «Биолактон» 136
5.1. Методы исследования 137
5.1.1. Моделирование интоксикации 137
5.1.2. Определение малонового диальдегида ТБК 138
5.1.3. Определение активности лизоцима в сыворотки крови 139
5.1.4. Определение активности [3-лизинов в сыворотке крови 139
5.1.5. Определение БАСК 139
5.1.6. Определение фагоцитарной активности нейтрофилов крови... 140
5.2. Результаты исследования 140
5.2.1. Влияние курсового введения лекарственных препаратов на массу тела подопытных животных в условиях экспериментальной нормы и при интоксикации четыреххлористым углеродом 140
5.2.2. Изучение эффективности профилактического введения препаратов с целью коррекции нарушений, обусловленных интоксикацией четыреххлористым углеродом 143
Общие выводы 152
Список литературы 154
- Способы получения микробных гидролизатов
- Разработка методики количественного определения общего содержания пептидов с молекулярной массой менее 1500
- Получение гидролизатов методом ферментативного гидролиза
- Потенциометрическое определение раствора (рН)
Введение к работе
Актуальность темы. Современная отечественная промышленность для получения лекарственных препаратов, как правило, использует лекарственное растительное сырье и продукты химического синтеза, и значительно реже для этих целей применяются бактерии. Вместе с тем, использование бактерий в качестве сырья может быть достаточно перспективным ввиду высокого содержания в них важных биологически активных веществ. Кроме того, высокая скорость роста бактерий позволяет культивировать их в больших количествах за достаточно короткое время, что делает использование бактерий в качестве сырья рентабельным.
Пробиотические молочнокислые бактерии находят широкое применение для профилактики и лечения инфекционно-воспалительных заболеваний у человека и животных. Среди многочисленных видов лактобацилл, применяемых в производстве лечебно-профилактических препаратов, ведущая роль принадлежит виду Lactobacillus acidophilus.
Наряду с перечисленными свойствами лактобациллы также обладают иммуностимулирующей активностью.
Среди иммунотропных лекарственных препаратов в последнее время стремительно развивается подгруппа иммуномодуляторов микробного происхождения (ИМП). Это связано, прежде всего, с высокой эффективностью и практически полной безвредностью подобных лекарственных средств. Их иммуностимулирующий эффект реализуется через воздействие на клетки врожденной иммунной системы нескольких видов химических структур, характерных для многих микроорганизмов. Эти структуры получили название «патоген-ассоциированные молекулярные образы», а соответствующие им рецепторы врожденной иммунной системы – «образраспознающих рецепторов». Наиболее известными «патоген-ассоциированными молекулярными образами» являются бактериальные гликопептиды.
Гликопептиды бактерий являются производными мурамилдипептида и образуются в ходе гидролиза пептидогликана клеточной стенки бактерий.
ИМП применяются как в виде самих лизатов микроорганизмов, это такие лекарственные препараты как: «Бронхо-мунал», «Иммудон», «ИРС–19», «Постеризан», так и в виде минимальных биологически активных фрагментов (гликопептиды мурамилдипептидного ряда), полученных синтетическим путем, например «Ликопид», «Ромуртид», «Мурабутид».
Однако в нашей стране аналогов данным лекарственным препаратам не существует. Это связано с тем, что не разработаны эффективные способы получения гидролизатов бактерий, а также нет валидированных методик оценки их качества.
В связи с этим актуальным является проведение исследований по разработке лекарственного препарата на основе гидролизата лактобактерий, изучение его качественного и количественного состава, стабильности и биологической активности.
Цели и задачи исследования. Разработка методик анализа основных биологически активных веществ гидролизатов молочнокислых бактерий, стандартизация и первичная фармакологическая оценка лекарственного препарата на основе гидролизата бактерий Lactobacillus acidophilus.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
-
Провести сравнительную оценку спектрофотометрических методик количественного анализа общего содержания белков и пептидов на возможность их определения в гидролизатах молочнокислых бактерий.
-
Изучить возможности использования методов ВЭЖХ и капиллярного электрофореза (КЭ) для качественного и количественного определения ГМДП в гидролизатах молочнокислых бактерий, полученных различными способами и использовать данные методы для оценки их стабильности.
-
Изучить факторы, влияющие на разделение фенилизотиокарбамил (ФТК)-производного ГМДП от сопутствующих ФТК-производных других пептидов и аминокислот.
-
Обосновать параметры пригодности системы для электрофоретического разделения ФТК-производного ГМДП от сопутствующих ФТК-производных других пептидов и аминокислот.
-
Выбрать оптимальный способ получения гидролизата с помощью методов термокислотного и ферментативного гидролиза и предложить эффективный консервант.
-
Провести исследования по стандартизации лекарственного препарата на основе гидролизата молочнокислых бактерий («Биолактон») и обосновать сроки его годности.
-
Провести первичную фармакологическую оценку действия препарата «Биолактон» на показатели клеточного и гуморального иммунитета экспериментальных животных.
Научная новизна. Впервые проведена валидационная оценка фотометрических методик количественного определения белков, низкомолекулярных пептидов и аминокислот. При этом установлено, что максимальную точность и воспроизводимость результатов определения общего содержания белков и пептидов обеспечивает методика с реактивом Бенедикта, а для определения общего содержания аминокислот – методика количественного определения с суспензией меди фосфата (II).
Теоретически обоснованы и экспериментально подтверждены условия электрофоретического определения ФТК-производного ГМДП в присутствии ФТК-производных других пептидов и аминокислот. Показано, что полное разделение может быть достигнуто с использованием мицелярного капиллярного электрофореза, где в качестве мицеллообразующей добавки использовали натрия додецилсульфат. Установлено, что основными факторами, влияющими на электрофоретическое разделение, являются ионная сила буферного раствора, формирующая -потенциал, а также добавка мицеллообразующего компонента.
Изучены показатели для определения пригодности электрофоретической системы. Впервые использована величина диффузного потенциала электролита в качестве критерия пригодности системы.
При проведении выбора условий получения гидролизата молочнокислых бактерий штамма L. acidophilus В 2505 установлено, что максимальное накопление биологически активных веществ обеспечивает метод термокислотного гидролиза, который был положен в основу создания лекарственного препарата «Биолактон».
Обоснованы показатели и нормы качества лекарственного препарата «Биолактон». В условиях естественного хранения установлены сроки его годности – 2 года. Предложен эффективный консервант, обеспечивающий микробиологическую стабильность в ходе хранения лекарственного препарата.
В опытах на животных показано положительное влияние разработанного лекарственного препарата на общее физиологическое состояние, а также на показатели клеточного иммунитета.
Практическая значимость. Доказана возможность использования методов количественного определения общего содержания белков, пептидов и аминокислот при их совместном присутствии. Впервые разработана методика количественного определения ГМДП методом капиллярного электрофореза в присутствии других пептидов и аминокислот. Предлагаемые методики могут использоваться в практике анализа любых объектах, содержащих белки пептиды и аминокислоты.
Предложены способы оценки пригодности электрофоретической системы, которые могут быть использованы для анализа других веществ методом капиллярного электрофореза.
Оптимизированы способы ферментативного и термокислотного гидролиза бактериальной массы, которые могут быть широко использованы для глубокой переработки микробиологических объектов. На основании сравнительного изучения указанных способов для практического использования рекомендован термокислотный способ гидролиза.
Внедрение результатов исследований в практику. Разработан проект ФСП на лекарственный препарат «Биолактон», представляющий собой термокислотный гидролизат молочнокислых бактерий, который передан для внедрения на опытном производстве НИИ комплексного использования молочного сырья (НИИКИМ), г. Ставрополь.
Положения, выдвигаемые на защиту:
-
Результаты сравнения метрологических характеристик (линейности, прецизионности и точности) методик спектрофотометрического определения суммы белков и пептидов.
-
Итоги разработки методики количественного определения суммы аминокислот в присутствии белков и пептидов.
-
Материалы исследования электрофоретического поведения ГМДП в различных буферных растворах и в присутствии реагентов, модифицирующих электроподвижность аминокислот и пептидов
-
Результаты разработки методики количественного определения ГМДП методом мицелярного электрофореза.
-
Результаты сравнительной оценки качественного и количественного состава гидролизатов молочнокислых бактерий, полученных термокислотным и ферментативным способом.
-
Материалы исследований по стандартизации лекарственного препарата «Биолактон», созданного на основе термокислотного гидролизата молочнокислых бактерий штамма Lactobacillus acidophilus В 2505.
-
Результаты первичной фармакологической оценки лекарственного препарата «Биолактон».
Апробация и публикации результатов исследований. Основные положения диссертационной работы доложены на:
-
XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005г.).
-
II конференции по медицинской биотехнологии (Анапа, 2005г.);
-
Научно-практической конференции «Современные методы стандартизации и контроля качества лекарственных средств» (Москва, 2006г.).
-
Ежегодных научных конференциях ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава (Пятигорск, 2005 и 2006г.).
По теме диссертации опубликовано 8 работ.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Работа выполнена в соответствии с соглашением о взаимодействии по созданию научно-технической продукции и использованию результатов работ научно-технической деятельности между Федеральным агентством по здравоохранению и социальному развитию и ГОУ ВПО «Пятигорская ГФА Росздрава», номер 06/1049.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 163 страницах машинописного текста, содержит 41 таблицу и 45 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, 4 глав экспериментальных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 116 источников, из которых 38 на иностранных языках, и приложений.
Способы получения микробных гидролизатов
В общем смысле гидролиз белковых веществ представляет собой расщепление молекулы с деструкцией первичной структуры (полипептидной цепи). Гидролиз пептидной цепи происходит в результате воздействия физических факторов (температуры, давления), химических реагентов (кислот, щелочей) или протеолитических ферментов. Продуктами полного гидролиза белковых веществ являются аминокислоты, частичного -аминокислоты и пептиды. Гидролизаты, получаемые для практического использования (например, гидролизаты бактерий), обычно содержат как аминокислотную, так и пептидную фракцию, каждая из которых влияет на свою, независимую иммунорегуляторную систему [68, 69].
В практических условиях преимущественно используют химические или ферментативные способы гидролиза. Среди химических методов выделяют кислотный и щелочной гидролиз. Однако, щелочной гидролиз нельзя использовать для гидролиза бактериальной массы, ввиду того, что происходит рацемизация большинства аминокислот, а также разрушение лизина, входящего в состав пептидогликана.
Кислотный гидролиз проводят, преимущественно, с помощью минеральных кислот при повышенных температурах.
В результате кислотного гидролиза рвутся пептидные связи, хотя и с разной скоростью, в зависимости от природы радикалов. К тому времени, когда последние переходят в раствор, первые уже успевают частично разрушиться.
Привлекательной стороной кислотного гидролиза является возможность получения гидролизатов в короткие сроки, варьируя концентрацией кислоты, а также температурой и (или) давлением. Еще одним положительным моментом является образование бактерицидных условий в ходе процесса, что предотвращает микробную контаминацию и позволяет хранить гидролизат без консервации продолжительное время.
Однако кислотный гидролиз имеет и свои отрицательные стороны. Как указывалось выше, разрушается часть аминокислот, что может сопровождаться образованием летучих соединений. В литературе имеются сведения, что в низкомолекулярных пептидах (каковыми являются МДП, ГМДП и др.) при кислотном гидролизе образуются концевые структурные деформации, в результате чего они остаются не узнанными рецепторами клеток [68, 70]. При кислотном гидролизе белковых веществ, помимо разрыва пептидной связи, протекают различные сопутствующие реакции. Так дипептиды могут образовывать циклическую форму, а при расщеплении цикла давать дипептид с обратным расположением аминокислотных остатков. Кроме того, нейтрализация кислоты в конце гидролиза связана с образованием высоких концентраций солей. А повышение концентрации анионов в ряде случаев может служить фактором токсичности.
Ферментативные методы гидролиза являются более мягкими и щадящими в сравнении с химическими, благодаря чему их широко используют в производстве. Гидролиз проходит в зонах рН, соответствующих максимумам активности ферментов, чаще в нейтральной, слабощелочной или слабокислой среде. Оптимум температур соответствует, как правило, 35-50 С.
Ферменты, в отличие от кислот и щелочей, действуют только на определенные группы соединений. В частности, протеолитические ферменты расщепляют только белки и пептиды.
Для гидролиза белков в практических условиях используют, как правило, не индивидуальные протеазы, а их комплексы [68]. Например, панкреатин, основными компонентами которого являются трипсин и химотрипсин, обладающий высокой протеолитической активностью. Его применяют, в основном, для получения гидролизатов из животного и микробного материала. Входящий в состав панкреатина трипсин катализирует гидролиз связей, образованных карбоксильными группами лизина и аргинина [53], что очень важно при гидролизе бактериального пептидогликана. Оптимум действия панкреатина находится при рН 7,5 - 8 и температуре процесса 50 - 55 С. При гидролизе панкретином наблюдается высокая скорость высвобождения а-аминогрупп, что заметно снижает время проводимого гидролиза, по сравнению с другими ферментными препаратами [68].
Еще одним ферментом, который активно гидролизует бактериальную клетку является лизоцим, на этом, собственно, и основано его антибактериальное действие. Он катализирует гидролиз полисахарида, входящего в состав клеточных стенок ряда бактерий. Однако, бактериальный полисахарид, является весьма сложным нерастворимым соединением, в связи с чем, продолжительность гидролиза увеличивается [53]. Кроме того, некоторые бактерии рода Lactobacillus обладают устойчивостью к действию лизоцима, a L. fermentum даже продуцируют его, что в сочетании с лизоцимом слизистой оболочки кишечника способствует устойчивости последней к действию патогенной микрофлоры [2, 71, 72].
Разработка методики количественного определения общего содержания пептидов с молекулярной массой менее 1500
Ввиду того, что иммуномодулирующее действие гидролизатов связано именно с пептидами низкой молекулярной массы, то важным представляется определение общего содержания данной фракции. При разработке методики количественного определения пептидов за основу была взята методика определения общего белка с реактивом Бенедикта. Однако в качестве стандарта был использован ГМДП.
Данная методика также была оценена по показателям: линейность, прецизионость и точность [89].
Определение линейности методики. Около 0,2 г ГМДП (точная навеска) растворяли в воде и доводили водой до метки в мерной колбе, вместимостью 50 мл. 0,10; 0,25; 0,50; 0,75 и 1,00 мл полученного раствора доводили водой до 2 мл, прибавляли 2 мл раствора натрия гидроксисда с концентрацией 6 г/100мл и 0,5 мл реактива Бенедикта. Растворы перемешивали, центрифугировали при 5000 мин"1 5 мин и измеряли их оптическую плотность при 527 нм на спектрофотометре СФ-2000 в кювете с толщиной рабочего слоя 10мм. В качестве раствора сравнения использовали смесь этих же реактивов без добавления раствора ГМДП (рис. 8).
Установлено, что в данной области концентраций измеряемого раствора ГМДП (0,009-0,09 г/100мл) график имеет линейный характер (рис. 9) и описывается уравнением: у=2,5671х+0,0045. Коэффициент корреляции равен 0,9999, что позволяет использовать данную методику для количественного определения общего содержания низкомолекулярных пептидов в данной области концентраций.
Определение прецизионности методики. Определение прецизионности методики проводили согласно рекомендациям ІСН (см. выше).
Для этого около 0,2 г ГМДП (точная навеска) растворяли в воде и доводили водой до метки в мерной колбе, вместимостью 50 мл. Оттуда брали по 1,00 мл (6 параллельных определений) и далее поступали как при определении линейности данной методики.
Концентрацию исходных растворов рассчитывали по уравнению градуировочного графика. В результате получили 6 значений (таб. 7).
Определение точности методики. Определение точности методики проводили согласно рекомендациям ICH (см. выше). Результаты исследования представлены в таб. 8:
В ходе работы было установлено, что все показатели разрабатываемой методики удовлетворяют требованиям, предъявляемым материалами ICH, что предполагает использование данной методики для количественного определения общего содержания низкомолекулярных пептидов в изучаемых объектах [89].
Получение гидролизатов методом ферментативного гидролиза
На состав гидролизата, при использовании ферментативного способа, существенное влияние оказывают как природа фермента, так и условия проведения ферментации.
Так как полученный гидролизат должен содержать наибольшее количество гликопептидов, являющихся производными МДП (например ГМДП) и обладающих иммуномодулирующей активностью, то необходимо использовать только ферменты, способные разрушать пептидогликан бактерий. В литературе описано несколько таких групп ферментов: мурамидазы (мутанолизин и лизоцим), протеолитические ферменты (трипсин, проназа, панкреатин, лизоамидаза) [68, 101-107].
В [102-104] описывается способность мурамидаз гидролизовать бактериальную массу некоторых видов бактерий, в т.ч. и лактобактерий, с выходом производных мурамилдипептида. Также показано стимулирующее влияние данной фракции на иммунную систему (сильная активизация моноцитов, увеличение продукции цитокинов).
Такие протеолитические ферменты как трипсин и проназа обладают высокой активностью, в т.ч. и в отношении бактерий, что также приводит к выходу иммунокомпетентных фрагментов [68,105,106]. А комплексные ферментные препараты из-за содержания в них нескольких ферментов способны еще и лизировать большее количество субстратов. Например, панкреатин действует как на растительные, так и на животные белки, расщепляет белки микробного происхождения, в том числе - клеточные стенки микроорганизмов [68, 107].
В работе были использованы следующие ферменты: из группы мурамидаз - лизоцим, т.к. по сравнению с мутанолизином он значительно дешевле и поэтому предпочтительно его использование в производстве; среди протеолитических ферментов, кроме панкреатина, были выбраны проназа и трипсин, как обладающие наибольшей протеолитической активностью.
При получении всех гидролизатов использовалось предварительное кипячение. Данный процесс приводит к денатурации белка, что выражается в разрушении его третичной структуры. Это, в свою очередь, облегчает контакт активных центров фермента с субстратом. Кроме того, в живых бактериальных клетках есть своя антилизоцимная система (липополисахарид наружной мембраны), которая, связывая фермент, останавливает его работу [108]. Однако, ввиду того, что лизоцим является наиболее специфичным из используемых ферментов, представляло интерес выявить, достоверно ли влияние данного фактора (предварительная термическая обработка) на выход биологически активных веществ.
Т.к. оптимум действия данных ферментов находится на одном уровне (рН 7-8, и t=37C), то во всех гидролизатах использовался один буфер и одинаковая температура опыта. В работе использовался трис-буфер, т.к. он несет слабую ионную нагрузку и вследствие этого более физиологичен. Кроме того, повышенная концентрация солей усиливает связывание лизоцима с липополисахаридами живых бактерий, результатом чего может являться инактивация фермента [108]. Поэтому в работе проводилось предварительное кипячение субстрата, а также использовался буфер с низкой ионной силой.
Переменными же условиями при получении ферментативных гидролизатов было количество фермента и время проводимого гидролиза.
На первом этапе работы необходимо было выбрать оптимальное соотношение между ферментом и субстратом. Получение гидролизатов проводили при рН 7,5-8 и температуре опыта 37 С - это условия оптимума действия всех используемых ферментов. Время гидролиза изначально выбиралось произвольно, и было равно 2 часам. Количество всех ферментов варьировалось от 0,5 до 5 мг/мл.
Качество полученных гидролизатов определяли по количественному содержанию пептидов с М.м. 1500 (см. методику на стр. 48). В ходе эксперимента в каждом из способов гидролиза были получены несколько гидролизатов при одинаковых соотношениях бактериальной массы и воды.
Очистку всех полученных гидролизатов осуществляли следующим образом: после прохождения гидролиза, полученную взвесь охлаждали, центрифугировали при 5000 мин" 20 мин, супернатант декантировали, разливали во флаконы и хранили в холодильнике. Затем определяли содержание пептидов по указанной методике (см. стр. 48). Результаты определения зависимости содержания пептидов от количества вносимых ферментов представлены на рис. 24-28. Таким образом, для каждого из способов были выбраны оптимальные концентрации соответствующего фермента: для проназы, лизоцима с предварительным кипячением субстрата и трипсина - 2 мг/мл, а для панкреатина и лизоцима без предварительного кипячения субстрата - 4 мг/мл.
Следующим этапом работы стала оптимизация времени гидролиза. При этом постоянными условиями также были рН (7,5 - 8) и температура опыта (37 С). Переменным же условием было время (от 1 до 5 часов). В ходе эксперимента были получены 5 различных гидролизатов для каждого из способов при одинаковых соотношениях бактериальной массы и буфера, а также процедурах очистки гидролизатов.
Качество полученных гидролизатов определяли также по количественному содержанию низкомолекулярных пептидов. Результаты зависимости содержания пептидов от времени гидролиза представлены на рис. 29-33
Потенциометрическое определение раствора (рН)
рН препарата «Биолактон», измеренного потенциометрически, в течение двух лет естественного хранения находилось в пределах от 2,8 до 3,5.
Отбирали по 5 контейнеров от каждой серии препарата и измеряли его объем в откалиброванном мерном цилиндре. Объем препарата в каждой упаковке должен быть 100±5 мл.
Для оценки качества препарата применялся показатель «микробиологическая чистота». С целью выбора методики исследования было предварительно проведено изучение антимикробных свойств препарата в условиях испытания.
Были подготовлены образцы тест - штаммов микроорганизмов Bacillus subtilus АТСС 6633, Bacillus cereus АТСС 10702, Escherichia coli АТСС 25922, Pseudomonas aeruginosa ГИСК 453, Staphylococcus aureus ATCC 6538 -P, Candida albicans ATCC 885 - 653, Aspergillus niger BKMF 1119. Тест — штаммы высевали из ампул в пробирки с питательной средой. Для бактерий использовали среду № 8, для грибов - среду № 2 без агара (среда Сабуро). Пробирки с бактериями инкубировали при 33С, с Candida albicans - при 22С в течение 24 часов, а с Aspergillus niger - 48 часов при 22С. Затем делали еще один пассаж на те же среды и через 24 - 48 часов проводили пересев на чашки Петри для получения изолированных колоний. Культуры Bacillus subtilus и Bacillus cereus пересевали на среду № 1, Escherichia coli — на среду № 4, Pseudomonas aeruginosa - на среду № 9, Staphylococcus aureus -на среду № 10. Candida albicans и Aspergillus niger пересевали на среду № 2.
После инкубирования типичные колонии при помощи бактериологической петли пересевали на скошенный агар в пробирки -бактерии на среду № 1, грибы - на среду № 2 и инкубировали как указано выше. Выросшие культуры смывали 5 мл стерильного фосфатного буферного раствора (рН = 7,0), конидии с культуры Aspergillus niger смывали стерильным фосфатным буферным раствором с 0,05% твина - 80. Затем все культуры разводили до содержания 109КОЕ/мл, с этой целью использовали
фотометрический метод. Приготовленные инокуляты микроорганизмов использовали для проведения испытания.
Для выявления разведения, не обладающего антимикробной активностью, готовили серию разведений в соотношении 1:10, 1:20, используя воду очищенную.
Каждое разведение вносили по 1 мл в чашки Петри, в одни из которых добавляли по 0,2 мл взвеси культуры Bacillus subtilus и Bacillus cereus, а в оставшиеся - по 0,2 мл культуры Candida albicans и Aspergillus niger. В чашки с Bacillus subtilus и Bacillus cereus вносили по 7 - 10 мл расплавленной среды № 1 при температуре 47,5±2,5С, в чашки с культурами Candida albicans и Aspergillus nige-то же количество среды №2.
Каждое разведение лекарственного препарата вносили по 1 мл в пробирки с жидкой питательной средой № 3 и № 8. В пробирки со средой № 3 добавляли по 1 мл взвеси культуры Escherichia coli, в пробирки со средой № 8 - по 1 мл культур Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus и Staphylococcus abony, каждую отдельно. В контрольные чашки и пробирки вместо разведений лекарственного препарата вносили такое же количество буферного раствора.
Посевы на средах № 1, 3 и 8 инкубировали при температуре 32,5±2,5С в течение 2 суток (среды № 3 и 8) и 5 суток - среда № 1. Посевы на среде № 2 инкубировали при температуре 22,5±2,5С в течение 5 суток. Полученные результаты представлены в таб. 20.
Данные таблицы свидетельствуют о том, что в разведении 1:10 препарат обладает способностью несколько уменьшать рост микроорганизмов, однако при разведении 1:20 рост более выражен. В этой связи можно считать целесообразным выполнять данное исследование из разведения 1:20.
Стандартизацию препарата по данному показателю проводили с помощью разработанных методик количественного определения общего содержания белков, низкомолекулярных пептидов, аминокислот и ГМДП, а также определения нипагина.
Согласно материалам ICH в качестве критериев показателя «количественное определение» используются специфичность, предел количественного определения, диапазон измерения, линейность, точность и прецизионность.
Специфичность. Данный показатель определяли по сопоставлению спектров поглощения растворов стандартных образцов и препарата, полученных по соответствующим методикам количественного определения содержания изучаемых веществ.
Специфичность методики количественного определения общего содержания белков (см. стр. 78). В качестве раствора сравнения использовали смесь этих же реактивов без добавления раствора BSA и препарата. Спектры поглощения полученных растворов имеют одинаковые полосы поглощения при данной длине волны (см. рис. 40).
