Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время в практике судебной медицины и токсикологии встречаются случаи отравления -адреноблокаторами лиц различных возрастных групп. Наиболее часто встречаются отравления метопрололом, атенололом, пропранололом, бисопрололом, талинололом, бетаксололом (Ходасевич А.П., Вольграм Е.Н., 1983; Анохин В.Т. с соавторами, 1983; Belson, M.G., Geller, R.S., 2000; Кутяков В.А., 2006; Семьянов с соавторами, 2007; Кнауб В.А., 2009; Лагуткина Т.П. с соавторами, 2011).
Используемые в судебной химии и токсикологии методики не позволяют однозначно идентифицировать -адреноблокаторы, поскольку в литературе в основном описаны методики обнаружения отдельных –адреноблокаторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола) методом тонкослойной хроматографией (ТСХ), где в качестве проявляющих реагентов используются йодсодержащие реактивы. Кроме того, информация по идентификации –адреноблокаторов при их совместном присутствии ограничена, а проявители (йодсодержащие реагенты), используемые для их проявления, не позволяют однозначно интерпретировать полученные результаты, так как окрашивают все азотсодержащие вещества в оранжевый или коричневый цвет.
Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с УФ-детектированием позволяет идентифицировать многие лекарственные вещества, имеющие поглощение в области УФ-спектра, в том числе и –адреноблокаторы (Барам Г.И. с соавторами, 2002; 2003; 2005; Федорова Г.А., Кожанова Л.А., 2007). Однако применение метода ВЭЖХ ограничивается отсутствием в практике судебной химии и токсикологической химии оптимальных методик пробоподготовки биологических объектов (оптимальные условия для высокой степени излечения –адреноблокаторов), обеспечивающих наилучшую эффективность экстракции и характеризующиеся невысокой трудоемкостью.
В случае летальных исходов при судебно-химических исследованиях и острых отравлениях наиболее удобными объектами исследования являются кровь и моча. Поэтому разработка надежных и достоверных методик изолирования –адреноблокаторов из крови и мочи, их идентификации и количественного определения является актуальной проблемой.
Цель работы и основные задачи исследования. Целью настоящего исследования является разработка эффективной методики выделения – адреноблокаторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола) из биологических объектов (кровь и моча), их идентификации и количественного определения.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
- разработка методик извлечения, обеспечивающих эффективную экстракцию –адреноблокаторов из биологических жидкостей;
- подбор чувствительных цветных реакций при анализе методом тонкослойной хроматографии для идентификации атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола;
- подбор хроматографических систем, позволяющих разделять и идентифицировать –адреноблокаторы методом ТСХ;
- разработка оптимальных условий метода ВЭЖХ, определение хроматографических характеристик (время удерживания, спектральные отношения) для идентификации исследуемых –адреноблокаторов.
- разработка методики количественного определения атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола в биологических объектах (крови и моче) методом ВЭЖХ.
- апробирование разработанных методик на образцах биологического материала, полученного для судебно-медицинского и токсикологического исследования в работе ГБУЗ НСО «Новосибирское областное бюро судебно-медицинской экспертизы».
Научная новизна. Разработаны оптимальные условия извлечения (рН среды, соотношения органических растворителей в смеси экстрагентов) –адреноблокаторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола) из биологических объектов (крови и мочи), позволяющие извлекать из них до 80-90% вещества (атенолола из крови извлекается 54%, из мочи - 63%).
Разработаны условия тонкослойной хроматографии (подобраны системы растворителей и чувствительные цветные реакции) для разделения и идентификации индивидуальных –адреноблокаторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола) и при их совместном присутствии в биологических объектах.
Определена чувствительность методик идентификации атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола методами ТСХ и ВЭЖХ.
Разработаны условия для идентификации атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола методом ВЭЖХ с многоволновым УФ-детектированием в биообъектах (крови и моче), установлены спектральные характеристики (времена удерживания и спектральные отношения) для атенолола, бетаксолола, бисопролола и талинолола.
Разработана и валидирована методика количественного определения атенолола, бетаксолола, бисопролола и талинолола методом ВЭЖХ в биологических объектах (крови, моче).
Установлено, что при очистке биологических объектов от соэкстрактивных веществ гексаном, происходит потеря –адреноблокаторов.
Практическая значимость. Разработанные методики извлечения, качественного обнаружения и количественного определения –адреноблокаторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола) в биологических жидкостях (крови, мочи) методами ТСХ и ВЭЖХ внедрены в работу судебно-химического отделения ГБУЗ НСО «Новосибирское областное бюро судебно-медицинской экспертизы», судебно-химического отделения КГБУЗ «Алтайское краевое бюро судебно-медицинской экспертизы» (г. Барнаул), КГБУЗ «Красноярское краевое бюро судебно-медицинской экспертизы».
Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе (в лекционном материале и практических занятиях) на кафедре фармацевтической химии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, на кафедре судебной медицины ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, на кафедре судебной медицины ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет» Минздрава России, на кафедре судебной медицины ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Минздрава России.
Материалы диссертационной работы рекомендованы к использованию в работе контрольно-аналитической лаборатории ОАО «Фармация» (г. Новосибирск).
По результатам диссертационной работы разработаны Методические рекомендации «Определение некоторых –адреноблокаторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола) в биологических жидкостях» (рекомендованы к изданию советом межрегиональной общественной организации «Судебные медики Сибири», протокол № 17 от 24.06.2011 г.).
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России в соответствии с планом научно-исследовательских работ по теме «Поиск, изучение, создание и внедрение новых лекарственных средств растительного и синтетического происхождения и организация форм фармацевтической деятельности» (государственная регистрация № 01200807420).
Положения, выдвигаемые на защиту:
1. Методика извлечения –адреноблокаторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола) из биологических жидкостей (крови, мочи) методом жидкость-жидкостной экстракции.
2. Методики идентификации –адреноблокаторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола) методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) и методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
3. Методика количественного определения –адреноблокаторов (атенолола, бетаксолола, бисопролола, метопролола, пропранолола и талинолола) в биологических объектах методом ВЭЖХ.
Апробация работы. Результаты исследования обсуждались на заседаниях кафедры судебно-медицинской экспертизы ГБОУ ВПО «Новосибирский Государственный медицинский университет» Минздрава России (2006 – 2011 гг.), на заседаниях методического совета ГБУЗ НСО «Новосибирское областное бюро судебно-медицинской экспертизы» (2007 – 2011 гг.). Результаты исследования докладывались на научно–практических конференциях Межрегиональной общественной организации «Судебные медики Сибири» (июнь 2009 г, май 2010 г., июнь 2011 г.), на конференции, посвященной 55-летию Красноярского краевого бюро судебно–медицинской экспертизы (май 2006 г.), на II Всероссийской научно–практической конференции с международным участием «Ученые Урала и Сибири – развитию отечественной фармации: от синтеза до инновационных лекарственных средств», посвященной 300–летию М.В.Ломоносова», г. Новосибирск (6 - 7 октября 2011 г.).
Публикации. По результатам исследований опубликовано 7 статей, 3 из которых - в журналах, рекомендованных ВАК.
Экспериментальные исследования по теме диссертационной работы выполнены в судебно-химическом отделении ГБУЗ НСО «Новосибирское областное бюро судебно-медицинской экспертизы», а также в сотрудничестве с коллективами других научных организаций: ЗАО «Институт хроматографии «Эконова» (г. Новосибирск), контрольно-аналитической лаборатории ОАО «Фармация» (г. Новосибирск).
Личный вклад автора. Все экспериментальные результаты, приведенные в диссертации, получены самим автором. Автором выполнены исследования по оценке параметров пригодности хроматографических систем, позволяющих разделять и идентифицировать –адреноблокаторы методом ТСХ; автором апробированы и подобраны наиболее оптимальные хромогенные реактивы для достоверной идентификации исследуемых –адреноблокаторов в условиях ТСХ. Автором разработаны оптимальные условия извлечения –адреноблокаторов из биологических объектов (крови, мочи) и установлены степени их извлечения, подобраны условия исследования методом ВЭЖХ и определены их хроматографические характеристики, построены калибровочные графики для количественного определения. Автор самостоятельно рассчитал метрологические характеристики методики количественного определения и провел ее валидацию.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной объектам и методам исследований, собственных исследований, выводов, а также списка литературы, включающего 189 наименований, в т.ч. 34 источника иностранных авторов. Работа изложена на 110 страницах машинописного текста, включает 30 таблиц, 8 рисунков и 5 приложений, включающих 2 таблицы и 9 рисунков.
