Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Понятие о БАД и фиточаях. Индикаторные компоненты 10
1.1 Понятие о БАД и фиточаях 10
1.1.1. Биологически активные добавки к пище 10
1.1.2, Фиточаи 11
1.2. Стандартизация и контроль качества БАД 14
1.3. Понятие индикаторных компонентов в лекарственном растительном сырье 17
1.4 Классификация и выбор индикаторных компонентов 19
Выводы из главы 1 31
Глава II. Физико-химические методы разделения, идентификация и количественного определения индикаторных компонентов 32
2.1. Физические свойства фенольных соединений 32
2.2- Химические свойства фенольных соединений 32
2.3- Выделение растительных фенолов 32
2.4. Идентификация фенольных соединений по цветным реакциям 33
2.5 Физико-химические методы идентификации фенольных соединений 37
2.6- Количественное определение фенольных соединений 38
Выводы из главы II 43
Глава III. Материалы и методы исследования 44
3.1. Оборудование и реактивы 44
3.2. Стандартные образцы 44
3.3- Объекты анализа 51
3.4. Обработка полученных результатов 57
Выводы из главы III 59
Глава IV. Разработка методов определения некоторых индикаторных компонентов в фиточаях и БАД 60
4.1 Методология исследования 60
4.2 Пробоподготовка 61
4.3 Разработка методов анализа индикаторных компонентов чая и продуктов
на его основе 63
4.3.1. Выбор оптимальных условий разделения полифенольных компонентов чая совместно с пуриновыми алкалоидами 63
4.3.2. Выбор оптимальных условий детектирования 65
4.3.3. Количественное определение полифенольных компонентов чая и пуриновых алкалоидов в растительном сырье и БАД на основе Камелии китайской 66
4.4 Разработка метода анализа арбутина и гидрохинона в листьях толокнянки, брусники, корневищах бадана и фитопрепаратах на их основе. 73
4.4. 1. Выбор оптимальных условий разделения арбутина и гидрохинона 73
4.4.2. Выбор оптимальных условий детектирования 74
4.4.3. Количественное определение арбутина и гидрохинона 75
4.4.2. Результаты анализа фитопрепаратов на основе листьев толокнянки, брусники, корневищ бадана 79
4.5 Разработка метода определения флаволигнанов в Расторопше пятнистой и фитопрепаратах на ее основе 84
4.5.1. Выбор оптимальных условий определения флаволигнанов 84
4.5.3. Количественное определение 86
4.5.4. Результаты анализа фитопрепаратов на основе расторопшн пятнистой 90
4.6 Разработка метода определения индикаторных компонентов в Зверобое продырявленном 92
4.6. Ї. Выбор оптимальных условий разделения 92
4.6.2. Выбор оптимальных условий детектирования 94
4.6.3. Количественное определение индикаторных компонентов Зверобоя .94
4.7 Разработка методов определения других индикаторных компонентов в
растительном сырье, широко применяемом при производстве фиточаев и
БАД 98
4.7.1 .Подбор условий хроматографирования 98
4.7.2. Лробоподготовка 100
4.7.3. Количественное определение индикаторных компонентов 103
4.7.4. Результаты определения индикаторных компонентов 105
Выводы из главы IV 113
Выводы 114
Список литературы
- Понятие индикаторных компонентов в лекарственном растительном сырье
- Идентификация фенольных соединений по цветным реакциям
- Обработка полученных результатов
- Разработка метода анализа арбутина и гидрохинона в листьях толокнянки, брусники, корневищах бадана и фитопрепаратах на их основе.
Введение к работе
Актуальность проблемы
Существование большого числа сборов, фиточаев и биологически активных добавок к пище, представляющих собой многокомпонентные смеси растительного сырья делает все более актуальной проблему определения их безопасности и подлинности, а также разработки достоверных критериев идентификации. [В.А. Тутельян, Б.П. Суханов, 1999 г.; Т.Л. Пилат, А.А. Иванов, 2002 г.]
Необходимость определения незначительных концентраций действующих веществ на фоне сложного матрикса БАД предъявляет высокие требования к селективности и чувствительности методов анализа.
Решение этих задач затруднено в связи с отсутствием в большинстве случаев достоверных методов контроля маркеров в составе комплексных БАД. Большинство существующих не хроматографических методов определения индикаторных компонентов растительных БАД неселективные, трудоемки и могут в отдельных случаях приводить к получению ложноположительных результатов, а также к искажению количественных данных.
Одними из наиболее перспективных методов для решения этих задач являются хроматографические методы, сочетающие высокую эффективность разделения компонентов БАД с избирательностью и чувствительностью детектирования. Во многих зарубежных фармакопеях существует тенденция к применению современных методов на основе ВЭЖХ. [USP 29; BP 2004; JP 14]
В виду того, что большинство продуктов вторичного метаболизма растений существуют в виде относительно полярный гликозидов или агликонов полифенольной природы, предпочтительно определение в режиме распределительной обращено фазовой хроматографии, обеспечивающей разделение как по количеству функциональных групп, так и в пределах одного гомологического ряда.
Особенно актуальным является идентификация индивидуальных биологически активных веществ с помощью современных хроматографических методов, в случае оценки качества и стандартизации продуктов, включающих многокомпонентное растительное сырье и особенно экстракты.
Применение современных методов разделения с достоверной идентификацией индикаторных компонентов позволяет точнее установить корреляцию между содержанием вещества, качеством препарата и потенциальной биологической или фармакологической активностью.
В результате анализа составов фиточаев и БАД, существующих в настоящее время на рынке и представленных для государственной регистрации, а также изучения нормативно-методической базы по стандартизации растительного сырья, были определены наиболее широко и часто используемые ингредиенты многокомпонентных смесей, требующие разработки новых методов оценки подлинности и стандартизации.
Все вышесказанное определило цель и задачи исследования.
Цель и задачи исследования
Цель: разработать методики анализа индикаторных компонентов в фиточаях и БАД на их основе, пригодные для рутинного контроля качества.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи.
Изучить физико-химических свойства индикаторных компонентов.
Разработать методики пробоподготовки фиточаев и БАД, обеспечивающие наибольшую эффективность экстракции, характеризующиеся невысокой трудоемкостью.
Подобрать оптимальные хроматографические условия для определения индикаторных компонентов на фоне сложного матрикса.
Оценить параметры пригодности хроматографических систем.
Разработать методики количественного определения индикаторных компонентов в фиточаях.
Оценить метрологические характеристики разработанных методик.
Апробировать разработанные методики на образцах растительного сырья, экстрактов растительного сырья, фиточаях и БАД на его основе.
Научная новизна. Изучены хроматографические свойства катехинов, флаволигнанов, арбутина, гиперозида, гиперицина, рутина, глицирризиновой кислоты, розмариновой кислоты, салидрозида, схизандринов, элеутерозидов, валереновой кислоты.
Впервые изучены спектры флуоресценции арбутина, гидрохинона, салидрозида.
Разработаны оригинальные методики идентификации и количественного определения индикаторных компонентов (для катехинов, флаволигнанов, арбутина, гиперозида, гиперицина, рутина, глицирризиновой кислоты, розмариновой кислоты, салидрозида, схизандринов, элеутерозидов, валереновой кислоты) в многокомпонентных фиточаях и БАД на их основе.
Практическая значимость
Методики идентификации и количественного определения индикаторных компонентов (катехинов, флаволигнанов, арбутина, гиперозида, гиперицина, рутина, глицирризиновой кислота, розмариновой кислоты, салидрозида, схизандринов, элеутерозидов, валереновой кислоты) внедрены и используются при эксертизе в процессе государственной регистрации фиточаев и БАД в ГУ НИИ питания РАМН, ФГУЗ Федеральный центр гигиены и эпидемиологии.
Подготовлен проект дополнения к «Руководству по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище». – М.2004,Р.4.1.1672-03., включающее все разработанные нами методики.
Апробация работы. Результаты работы доложены на Конференции молодых ученых «Окружающая среда и здоровье» (апрель 2005 г., Суздаль); на научных конференциях кафедры фармацевтической химии ММА им. И.М.Сеченова (2003–2006 гг., Москва); на семинаре «Аналитическая химия в контроле безопасности, качества и подлинности пищевых продуктов и биологически активных добавок к пище» AnalyticaExpo-2006, Москва (апрель 2006 г., Москва), конгрессе «Фитофарм 2006» (июнь 2006 г., Санкт-Петербург)
Публикация результатов исследования. По результатам проведенных исследований опубликовано 13 печатных работ.
Связь исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы кафедры фармацевтической химии фармацевтического факультета ММА им. И. М. Сеченова «Совершенствования контроля качества лекарственных средств» (№ государственной регистрации 01.200.110545).
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Разработанные методики хроматографического анализа и пробоподготовки индикаторных компонентов (катехинов, флаволигнанов, арбутина, гиперозида, гиперицина, рутина, глицирризиновой кислоты, розмариновой кислоты, салидрозида, схизандринов, элеутерозидов, валереновой кислоты).
-
Результаты определения содержания индикаторных компонентов в растительном сырье и продуктах на его основе (фиточаях, БАД, лекарственных препаратах – всего 180 образцов).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы из 109 названий (65 из которых зарубежные). Работа иллюстрирована 42 таблицами и 25 рисунками.
Понятие индикаторных компонентов в лекарственном растительном сырье
Существование большого числа сборов, фиточаев и биологически активных добавок к пище, представляющих собой многокомпонентные смеси растительного сырья делает все более актуальной проблему определения их безопасности и подлинности, а также разработки достоверных критериев идентификации. [В.А. Тутельян, Б.П. Суханов, 1999 г.; Т.Л. Пилат, А.А. Иванов, 2002 г.]
Необходимость определения незначительных концентраций действующих веществ на фоне сложного матрикса БАД предъявляет высокие требования к селективности и чувствительности методов анализа.
Решение этих задач затруднено в связи с отсутствием в большинстве случаев достоверных методов контроля маркеров в составе комплексных БАД. Большинство существующих не хроматографических методов определения индикаторных компонентов растительных БАД неселективные, трудоемки и могут в отдельных случаях приводить к получению ложноположительных результатов, а также к искажению количественных данных.
Одними из наиболее перспективных методов для решения этих задач являются хроматографические методы, сочетающие высокую эффективность разделения компонентов БАД с избирательностью и чувствительностью детектирования. Во многих зарубежных фармакопеях существует тенденция к применению современных методов на основе ВЭЖХ. [USP 29; ВР 2004; JP 14]
В виду того, что большинство продуктов вторичного метаболизма растений существуют в виде относительно полярный гликозидов или агликонов полифенольной природы, предпочтительно определение в режиме распределительной обращено фазовой хроматографии, обеспечивающей разделение, как по количеству функциональных групп, так и в пределах одного гомологического ряда.
Особенно актуальным является идентификация индивидуальных биологически активных веществ с помощью современных хроматографических методов, в случае оценки качества и стандартизации продуктов, включающих многокомпонентное растительное сырье и особенно экстракты.
Применение современных методов разделения с достоверной идентификацией индикаторных компонентов позволяет точнее установить корреляцию между содержанием вещества, качеством препарата и потенциальной биологической или фармакологической активностью.
В результате анализа составов фиточаев и БАД, существующих в настоящее время на рынке и представленных для государственной регистрации, а также изучения нормативно-методической базы по стандартизации растительного сырья, были определены наиболее широко и часто используемые ингредиенты многокомпонентных смесей, требующие разработки новых методов оценки подлинности и стандартизации.
Все вышесказанное определило цель и задачи исследования. Цель и задачи исследования Цель: разработать методики анализа индикаторных компонентов в фиточаях и БАД на их основе, пригодные для рутинного контроля качества. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи. Изучить физико-химических свойства индикаторных компонентов. Разработать методики пробоподготовки фиточаев и БАД, обеспечивающие наибольшую эффективность экстракции, характеризующиеся невысокой трудоемкостью. Подобрать оптимальные хромато графические условия для определения индикаторных компонентов на фоне сложного матрикса. Оценить параметры пригодности хроматографических систем. Разработать методики количественного определения индикаторных компонентов в фиточаях. Оценить метрологические характеристики разработанных методик. Апробировать разработанные методики на образцах растительного сырья, экстрактов растительного сырья, фиточаях и БАД на его основе.
Научная новизна. Изучены хроматографические свойства катехинов, флаволигнанов, арбутина, гиперозида, гиперицина, рутина, глицирризиновой кислоты, розмариновой кислоты, салидрозида, схизандринов, элеутерозидов, валереновой кислоты. Впервые изучены спектры флуоресценции арбутина, гидрохинона, салидрозида. Разработаны оригинальные методики идентификации и количественного определения индикаторных компонентов (для катехинов, флаволигнанов, арбутина, гиперозида, гиперицина, рутина, глицирризиновой кислоты, розмариновой кислоты, салидрозида, схизандринов, элеутерозидов, валереновой кислоты) в многокомпонентных фиточаях и БАД на их основе. Практическая значимость
Методики идентификации и количественного определения индикаторных компонентов (катехинов, флаволигнанов, арбутина, гиперозида, гиперицина, рутина, глицирризиновой кислота, розмариновой кислоты, салидрозида, схизандринов, элеутерозидов, валереновой кислоты) внедрены и используются при эксертизе в процессе государственной регистрации фиточаев и БАД в ГУ НИИ питания РАМН, ФГУЗ Федеральный центр гигиены и эпидемиологии.
Подготовлен проект дополнения к «Руководству по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище». -М.2004,Р.4.1.1672-03., включающее все разработанные нами методики. Апробация работы. Результаты работы доложены на Конференции молодых ученых «Окружающая среда и здоровье» (апрель 2005 г., Суздаль); на научных конференциях кафедры фармацевтической химии ММА им.
Идентификация фенольных соединений по цветным реакциям
Фенолы - бесцветные низкоплавкие кристаллические вещества или жидкости с характерным запахом. Двух- и трехатомные фенолы - твердые вещества с более высокими температурами плавления.
Фенол умеренно растворим в воде (8,2% при температуре 15 С). Алкил-замещенные одноатомные фенолы менее растворимы в воде, но легко растворяются в эфире, бензоле, спирте и хлороформе. Многоатомные фенолы хорошо растворимы в полярных органических растворителях [16].
Реакционными центрами в молекулах фенолов являются ароматическое кольцо и фенольная гидроксильная группа, взаимно влияющие друг на друга. Фенольная гидроксильная группа за счет р.л-сопряжения с кольцом является электронодонором, поэтому вектор диполя в фенолах направлен в сторону бензольного кольца.
Сопряжение группы ОН с ароматическим кольцом обусловливает дефицит электронной плотности на атоме кислорода, в результате чего протон гидроксильной группы фенолов становится более подвижным, чем в спиртах, т.е. увеличиваются кислотные свойства.
Благодаря электронодонорному влиянию фенольного гидроксила электронная плотность ароматического кольца повышена по сравнению с бензолом, особенно в орто- и пара- положениях. Это существенно облегчает протекание реакций электофильного замещения и окисления [16].
Для выделения полифенольных соединений используются избирательная экстракция растительного материала жид кость-жид костное распределение, в том числе противоточное распределение, осаждение солями тяжелых металлов, жидкостная хроматография, электрофорез [66].
Различной степени селективности (избирательности) экстракции достигают применением таких растворителей как спирты, водно-спиртовые смеси, этилацетат, эфир, ацетон, водные растворы с различными значениями рН. Для удаления сопутствующих неполярных веществ липидной природы (триглицериды, углеводороды, стерины, воска, смолы) растительное сырье предварительно обрабатывают хлороформом, дихлорэтаном, петролейным эфиром, тетрахлоридом углерода [66, 68].
Для выделения и очистки растительных полифенолов используют комбинации различные процедур разделения, основанных на жидкость-жидкостном распределении (ЖЖР), ЖЖР с кислотно-основной очисткой, тонкослойной хроматографии (ТСХ), бумажной (БХ) и колоночной хроматографии (КХ), а также препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Распространенным реактивом для определения фенольных соединений, основанным на реакции образования хелатов, является хлорид железа (III), при действии которого образуются красные, синие или сине-зеленые комплексы большинства фенолов. Широко используются также соли ряда других металлов - хлорид алюминия, оксихлорид циркония, ацетат магния
Другой тип цветных реакций основан на образовании тг-комплексов. Данная реакция может быть использована для фенольных эфиров, ароматических углеводородов, для некоторых ароматических гетероциклов и других ненасыщенных соединений. Тетрацианоэтилен является самым используемым реагентом для образования -комплексов. Тетрацианоэтилен реагирует с фенольными соединениями в щелочной среде с образованием насыщенно окрашенных /?-трициановин ил фенолятов (рис. 4). р-трициановинил фенолят оранжевый Рис. 4. Образование 7г-комплексов Эта реакция протекает только при свободном пара-положении по отношению к фенольному гидроксилу, или, если пара-положение занято легко подвижной группой, такой как карбоксил или гидроксиметил [104].
Реакция азосочетания фенолов с солями диазония При взаимодействии фенолов с солью диазония образуется азокраситель. Сочетание идет в о- и и- положениях у С5 и С8 молекулы флавонола по отношению к фенольному гидроксилу в щелочной среде (рН 9,0-10,0) (рис. 5). Легче сочетание происходит в и- положении из-за образования длинной цепи сопряженных связей. В нейтральной среде выпадает осадок азокрасителя красного цвета. При рН 10,0 реакция азосочетания потекать не будет из-за перехода соли диазония в соль (диазотат) [26]. С флавонолами реакция протекает быстро, с флавононами -со средней скоростью, с флавонами - медленно [16]. Существует широкий спектр солей диазония: р-диазонийбензенсульфонат, диазотированная сульфаниловая кислота, р-нитрофенилдиазония тетрафторборат и другие [104].
Колориметрические методы основаны на измерении оптической плотности окрашенных растворов в видимой области спектра. Для колориметрии флавоноидов используют реакции взаимодействия с алюминия хлоридом (оптическую плотность окрашенного раствора измеряют при длине волны 400-430 нм); реакция с хлоридом циркония (IV) в буферном растворе (максимум оптической плотности для рутина при длине волны 400 нм, для кверцитрина - 402 нм и для кверцетина - 468 нм); реакция с сернокислым раствором белого стрептоцида с нитритом натрия в щелочной среде (флавоноиды образуют азокрасители, оптическая плотность измеряется при 430-435 нм). Суммарное содержание полифенольных соединений (обычно в пересчете на галловую кислоту, танин или катехин) определяют методом Фолина-Чокальтеу, основанным на образовании раствора окислов вольфрама и молибдена, с максимумом абсорбции при длине волны 750 нм.
В УФ-спектрофотометрии для подтверждения структуры флавоноидов используют поглощение при двух максимумах абсорбции. Первая полоса в области от 320 до 385 нм соответствует поглощению кольца В, и вторая полоса в области от 250 до 285 нм, соответствующая поглощению кольца А. Батохромный эффект обусловлен увеличением числа гидроксильных групп: например, до 367 нм для кемпферола, до 371 нм для кверцетина и 374 нм для мирицетина [47]. Производные флавана - флаваноны, флаван-3-олы и др. имею максимумы поглощения только в области от 250 до 280 нм. [47]
Данные свойства используются при обнаружении полифенольных соединений в процессе их анализа методом тонкослойной хроматографии (ТСХ): флавонол-3-гликозиды, флаваноны, халконы обнаруживаются в УФ-свете в виде коричневых пятен; флавонолы и их 7-гликозиды - в виде желтых или желто-зеленых пятен; ксантоны в виде оранжевых пятен, изофлавоны при этом не проявляются. Флуоресценция усиливается после обработки хроматограмм одним из реактивов (5%-ным спиртовым раствором алюминия хлорида с последующим нагреванием при температуре 105 С в течение 3-5 мин; 5% раствором треххлористой сурьмы в тетрахлориде углерода; 2% спиртовым раствором щелочи) [14].
Обработка полученных результатов
чае (от I70 до 190 мг/Ю0мл с преобладанием эпигаллокатехин галлата), в черном чае содержание катехинов составило от 50 до 70 мг/100мл, которые были представлены в основном эпигаллокатехином и эпикатехином. Содержание кофеина составило в черном чае около 50 мг/100 мл, в зеленом чае - от 30 до 47 мг/100 мл. Эти величины сопоставимы с адекватными уровнями потребления катехинов и кофеина. Теафлавин в количествах от 1 до 4 мг/100мл был обнаружен только в образцах черного чая.
Большинство безалкогольных чайных напитков на основе черного чая характеризовались существенно более низкими концентрациями катехинов (от 0,4 до 16 мг/ЮОмл) и кофеина (от 3 до 16 мг/ЮОмл) при полном отсутствии теафлавина. Более высоким было содержание суммы катехинов в напитках на основе экстракта зеленого чая, но оно также было ниже соответствующих значений для традиционного зеленого чая (от 24 до 64 мг/100мл) Содержание кофеина в напитках было в 3 - 10 раз ниже, чем в традиционном чае.
Катехины являются основными полифенольными компонентами чая и БАД на его основе. Как следует из таблицы 13, содержание катехинов в различных образцах значительно отличается. Если сравнивать с содержанием катехинов в традиционном напитке чая (около ЮОмгЛООмл) с рекомендуемым адекватным уровнем потребления [19] (50-150мг/сутки) и содержанием катехинов БАД, то очевидно, что многие БАД («Грацилак», «Алфавит эффект». «Сарасвати») не могут рассматриваться как существенный регулярный источник катехинов. И лишь некоторые («Менопауза день-ночь», «Эпигал велес», «Тигрин». «Тиавит») могут обеспечить достаточное потребление катехинов. Следует отметить наличие БАД на основе декофеинезированного чая («Эпигал велес», «Тигрин», «Тиавит»), более предпочтительные для лиц которым, потребление кофеина противопоказано или не желательно. Таким образом стандартизация чая и БАД на его основе по содержанию кофеина и катехинов, позволяет выявить не доброкачественные продукты (фальсификаты) и оценить суточное потребление биологически активных веществ в составе данного продукта.
На предварительном этапе исследования, было изучено влияние состава подвижной фазы на разделение гидрохинона и его глюкозида -арбутина. Разделение проводилось в режиме обращено фазовой хроматографии, в частности на колонках С18, при элюировании смесями ацетонитрил—-вода или метанол—вода с небольшим содержанием ортофосфорний или трихлоруксусной кислоты. Эти подвижные фазы удобны для разделения сложных смесей, как фенольных соединений, так и их гликозидов в условиях изократического и градиентного элюирования и допускают использование УФ-детекторов и ФЛМ - детекторов.
Гидрохинон и арбутин по сравнению с полифенольными соединениями обладают более слабыми кислотными свойствами и практически не диссоциируют в условиях подвижной фазы. Поэтому добавление в систему кислоты не приводит к существенному улучшению хроматографических показателей.
В ходе предварительных испытаний нами исследовались разнообразные подвижные фазы. При выборе условий хроматографирования нами сравнивались смеси состава ацетон итрил/вода, метанол/вода в нейтральной среде и с добавлением орто-фосфорной кислоты или фосфатного буфера, применительно к разделению модельной смеси арбутина и гидрохинона. Практически все опробованные системы давали хорошее разделение тестовых соединений. В результате экспериментальных исследований была подобрана изократичная система: метанол-вода (15:85), которая является оптимальной для разделения смеси: арбутин - гидрохинона на колонках «Phenomenex Luna С18» и «Wakosil С18 RS» (табл. 14) Скорость потока элюэнта составляла I мл/мин. Объём вводимой пробы 10 мкл. Перед использованием подвижную фазу фильтровали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и дегазировали обработкой ультразвуком.
Параметры разделения арбутина и гидрохинона в условиях изократического элюирования в системе метанол-вода (15:85), скорость фазы 1 мл/мин, мертвый объем чі=2,1. Стандарт к к N а R Арбутин 3,95 0,88 10200 2,05 5,3 Гидрохинон 5,90 1,81 9700 Подобранная хромато графическая система показала хорошую селективность (2,05) и разделяющую способность (5,3) для арбутина и гидрохинона. Эффективность системы - около 10000 теоретических тарелок для обоих соединений, что позволяет использовать ее для определения арбутина и гидрохинона на фоне сложного матрикса.
Простые фенольные соединения детектируются по УФ поглощению на длине волны 280 нм. Поскольку гидрохинон и его глюкозид, как нами было установлено, обладают флуоресценцией с максимумами возбуждения при длине волны 280 нм и эмиссии при длине волны 330 нм, для повышения селективности и чувствительности количественная оценка арбутина и гидрохинона проводилась по данным флуори метрического детектирования (рис. 11)
Использование флуори метрического детектора позволило увеличить чувствительность методики до 0,01мг/л, а также значительно повысить селективность, в виду того что компоненты экстрактов, обладающие близкой хроматографической подвижностью с арбутином, не обладают флуоресцентными свойствами.
С целью оптимизации процесса экстракции, были изучены различные способы, изучая влияние полного разрушения клеточных стенок при экстракции водно-ацетоново-гексановой смесью, влияние многократной экстракции чистым растворителем в условиях экстракции на аппарате типа «Сокслет», а так же было изучено влияние времени и концентрации этанола при экстракции водно-этанольной смесью при нагревании с обратным холодильником. Жидкостная экстракция образцов смесью ацетон-гексан-вода.
Навеску 5 г измельченных листьев экстрагировали 50мл смеси ацетон:гексан:вода (1:1:1) в течении 1 ч при постоянном перемешивании. Затем добавляли 15г сульфата аммония, после расслоения фаз центрифугировали и органический слой упаривали в вакууме на ротационном испарителе. К маслянистому остатку добавляли 50 мл метанола, нагревали на водяной бане с обратным холодильником до растворения осадка. МетанольныЙ раствор выдерживали в течении 24 часов при - 20 С для осаждения основной части смолистых веществ и других липофильных соединений. Центрифугировали, надосадочную жидкость отделяли и фильтровывали.
Жидкостная экстракция образцов смесью этанол:вода. Навеску 1 г образца измельчали и помещали в круглодонную колбу с обратным холодильником, прибавляли 100 мл 25% раствора этилового спирта и нагревали на водяной бане в течение 30 минут, далее обрабатывали в ультразвуковой бане в течении 5 мин. Затем сырье отжимали, доводили объем экстракта до 100мл 25% раствором этанола, полученный экстракт отфильтровывали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Жидкостная экстракция образцов на аппарате типа «Сокслет»
Навеску 5 г образца помещали в аппарат типа «Сокслет» заливали 100 мл этанола, и проводили экстракцию в течение 6 часов (30 циклов), затем сырье отжимали, объем экстракта доводили до 100 мл этанолом, экстракт отфильтровывали. Пробоподготовка образцов экстрактов:
Около 0,5 г (точная навеска) помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем раствора метанола до метки, после чего тщательно перемешивали.
Как видно из полученных данных многократная экстракция чистым экстрагентом, в случае экстракции на аппарате «сокслет» и экстракция органическим растворителем в случает ацетон-гексан-вода не приводят к существенному увеличению степени извлечения. В связи с этим оптимальным способом, как с экономической точки зрения, так и по трудоемкости является экстракция водно-этанольной смесью при нагревании. В результате изучения влияния времени и концентрации спирта
Разработка метода анализа арбутина и гидрохинона в листьях толокнянки, брусники, корневищах бадана и фитопрепаратах на их основе.
Таким образом. разработанные методики показали высокую эффективность (7000-130000 т.т.) и чувствительность до 1 мг/л и 0,005 мл/л для флуориметрического определения. Относительная погрешность составляла не более 5 %. Предложенные простые варианты экстракгирования, обеспечивают необходимый выход экстракции и не стребуют сложных процедур. Аналогичные полдходы разработки методик могут использоваться и для разработки определения многих других индикаторных компонентов.
Разработанные методики были апробированы на образцах растительных экстрактов и БАД на их основе. На рисунках 19-25 представлены хроматограммы некоторых образцов. В таблицах 36-42 приведены данные по определению индикаторных компонентов в фиточаях и БАД.
Хроматограммы А — экстракта солодки; Б — БАД «Нейче лаке» ООО «Центр новых технологий специализированных продуктов питания»
Как видно из представленных хроматограмм, разработанные методики, отличаются высокой селективностью и спецефичностью. Что особенно важно при анализе многокомпонентных фиточаев.
При определении салидрозида (см. рис. 24) нами был использован флуориметр, что позволило, как и в случае с арбутином, увеличить чувствительность и селективность методики.
Применение градиентного элюирования при опредлении схизандринов, элеутерозидов и сеннозидов, позволило добиться наилучшего разделения компонентов. Оптимизированны условия экстракции и ВЭЖХ-анализа индикаторных соединений (сеннозиды, элеутерозиды, розмариновая кислота, глицирризиновая кислота, схизандрины салидрозид), входящих в состав многих фитопрепаратов. 1. Предложены методики пробоподготовки, хроматографического анализа и количественного определения для катехинов, флаволигнанов, арбутина, гиперозида, гиперицина, рутина, глицирризиновой кислоты, розмариновой кислоты, салидрозида, схизандринов, элеутерозидов, валереновой кислоты. 2. Для всех соединений расчитаны параметры хроматографического разделения, количественного определения и проведена статистическая обработка раезультатов. 3. На примерах определения индикаторных компонентов в образцах БАД и фиточаев, показана адекватность разработанных методик и правильность выбора индикаторных компонентов. 4. Обнаружение образцов с низким содержанием индикаторных компонентов, подтвержает актуальность применения данных методов для контроля качества БАД (в т.ч. фиточаев). 1. Изучены физико-химические свойства (хроматографическая подвижность, уф- и видимые спектры, масс-спектры) выбранных индикаторных компонентов. Для фенолопроизводных и их гликозидов (гидрохинон, арбутин, салидрозид) изучены флуоресцентные свойства и предложен новый метод ВЭЖХ анализа с флуорометрическим определение (? ех=280нм и ет=320нм), отличающийся высокой чувствительностью и селективностью.
2. Изучено влияние растворителя и условий экстракции на степень извлечения индикаторных компонентов из фиточаев и БАД Использование разработанных методик с высокой селективностью и чувствительностью, позволило использовать метод жидкостной экстракции без применения дополнительных методов концентрирования и очистки. Подобраны оптимальные и доступные экстрагенты для изученных соединений. Определено оптимальное время экстрагирования.
3. Подобраны хромато графические системы для определения катехинов, флаволигнанов, арбутина, гиперозида, гиперицина, рутина, глицирризиновой кислоты, розмариновой кислоты, салидрозида, схизандринов, элеутерозидов, валереновой кислоты. Предложено использовать для разделения веществ полифенольной природы подвижные фазы с рН=2,5, для антраценпроизводных {гиперицин и псевдогиперицин) с рН=5,0. Разработаны условия ВЭЖХ с градиентным элюированием для совместного определения большого числа индикаторных компонентов. В случае определения одного или двух компонентов в образце предложены, более простые методики с изократической подачей подвижной фазы.
4. При оценке пригодности хроматографических систем, все разработанные методики показали хорошую эффективность (10000-100000 теоретических тарелок), высокую степень разделения и селективность (R= 1,0-30,0; о 1.0)
5. Разработаны методики количественного определения катехинов, флаволигнанов, арбутина, гиперозида, гиперицина, рутина, глииирризиновой кислоты, розмариновой кислоты, салидрозида, схизандринов, элеутерозидов, валереновой кислоты в многокомпонентных фиточаях и БАД на их основе.
6. Предел обнаружения методик со СФМ детектированием составил 1мг/л, для методик с флуорометрическим детектирование от 0,005мг/. Предел количественного определения составил около бмг/л и 0,03мг/л соответственно. Относительная погрешность составила от 1,1% и не более 5,5%.
7. С помощью разработанных методик было проанализировано около 180 образцов растительного сырья, экстрактов, препаратов, а так же фиточаев и БАД к пище, проходящих экспертизу в ГУ НИИ питания РАМН. Обнаруженное содержание позволило стандартизовать продукт, оценить его качества и уровень потребления биологически активных веществ. Использование разработанных методик позволили установить, что около 10% проанализированных образцов либо не содержали предполагаемых индикаторных компонентов, либо содержали следовые количества, что указывает на фальсификацию или низкое качество продукта.
