Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы по исследованным объектам. Методы анализа флавоноидных соединений 9
1.1 Общий биосинтез флавоноидов 9
1.2 Распространение флавоноидов 12
1.3 Основные классификации флавоноидных соединений 13
1.4 Фармакогностическая и фармакологическая характеристика прополиса 17
1.4.1 Общие сведения о прополисе 17
1:4.2 Химический состав и свойства прополиса 20
1.4.3 Фармакологическая характеристика флавоноидов прополиса 22
1.5 Фармакогностическая и фармакологическая характеристика растения шлемник
байкальский Scutellaria baicalensis Georgi 23
1.5.1. Морфологические характеристики шлемника байкальского ...23
1.5.2. Химический состав шлемника байкальского 26
1.5.3. Фармакологическая характеристика флавоноидов шлемника байкальского 26
1.6 Фармакогностическая и фармакологическая характеристика растения петрушка
кудрявая Petroselinum crispum (Mill.) A. W. Hill 29
1.6.1. Ботаническая и фармакогностическая характеристика петрушки кудрявой... 29
1.6.2. Химический состав петрушки кудрявой... 31
1.6.3. Фармакологические свойства биологически активных веществ петрушки кудрявой 32
Выводы по главе I: 33
Глава II. Методы анализа флавоноидных соединений в растительных объектах и продуктах на их основе 34
2.1. Физические свойства флавоноидных соединений 34
2.2. Химические свойства флавоноидных соединений 34
2.3. Выделение растительных флавоноидов 35
2.4. Качественные реакции флавоноидных соединений 36
2.5 Спектральные методы анализа флавоноидных соединений 37
2.6. Хроматографические методы анализа флавоноидных соединений 39
2.7.Фармакопейные методики анализа препаратов, содержащих прополис 43
2.8. Методики анализа препаратов, содержащих шлемник байкальский 45
Выводы по главе II 49
Глава III. Материалы и методы исследования 50
3.1. Оборудование и реактивы 50
3.2: Стандартные образцы 50
3.3. Объекты исследован 53
Выводы из главы III 58
Глава IV. Разработка химических критериев подлинности комплексных растительных препаратов на основе прополиса, шлемника байкальского, петрушки кудрявой и методов их контроля 59
4.1. Анализ производных флавона в лекарственном сырье и фитопрепаратах на основе прополиса 59
4.1.1. Подготовка проб для хроматографического анализа 59
4.1.2. Подтверждения флавоноидного состава прополиса с помощью химической модификации.' 63
4.1.2. Выбор оптимальных условий для разделения флавоноидов прополиса 65
4.1.3 Выбор оптимальных условий детектирования 68
4.2.3 Параметры количественного определения и метрологические характеристики методики 68
4.1.5. Результаты анализа флавоноидов в опытных образцах 71
4.2. Анализ флавонов в лекарственном сырье и фитопрепаратах на основе шлемника байкальского 74
4.2.1. Подготовка проб для хроматографического анализа 74
4.2.3. Оптимизация условий ВЭЖХ 76
4.2.4 Количественное определение байкалина методом ВЭЖХ в фитопрепаратах и растительном сырье шлемника байкальского 80
4.2.5 Параметры количественного определения и метрологические характеристики методики 81
4.2.6. Результаты анализа байкалина в опытных образцах содержащих компоненты растения шлемника байкальского 81
4.3. Анализ флавонов в сырье и фитопрепаратах на основе петрушки кудрявой Petroselinum crispum (Mill.) A.W. Hill 85
4.3.1 Подготовка проб для хроматографического анализа 85
4.3.3. Оптимизация условий ВЭЖХ 87
4.2.3. Количественное определение апиина методом ВЭЖХ в фитопрепаратах и растительном сырье 91
4.2.5. Результаты анализа апиина в опытных образцах содержащих компоненты растения петрушки кудрявой 92
Выводы из главы IV 94
Общие выводы
- Основные классификации флавоноидных соединений
- Выделение растительных флавоноидов
- Стандартные образцы
- Подготовка проб для хроматографического анализа
Введение к работе
Флавоноидами называется группа природных полифенольных биологически активных соединений - производных бенз-у-пирона, в основе которых лежит фенилпропановый скелет, состоящий из С6-СЗ-С6 углеродных единиц. К основным классам флавоноидов относятся флавоны, флаваноны, дигидрохалконы, халконы, антоцианидины, флаванонолы (дигидрофлавонолы), флавонолы, и изофлавоноиды. Разнообразие флавоноидов обуславливается наличием большого числа гидроксилированных, метилированных, ацилированых, О- и С-гликозилированных производных в ароматических ядрах А и В, а также асимметрических атомов углерода в пирановом гетероцикле. К классу флавонов (выделено около 20 агликонов) относятся окисленные флавоноиды, не имеющие гидроксила в 3-м положении (кольцо В).
Интерес к природным флавонам связан с их выраженными антиоксидантными свойствами, для ряда флавонов показаны их антиаллергенные, противоспалительные, антивирусные, антибактериальные свойства и другие типы биологической активности.
Наиболее ценными источниками флавонов являются прополис, трава петрушки кудрявой и корни шлемника, содержание флавонов в этих объектах превышает 2-2,5 %.
На основе прополиса разработан целый ряд препаратов, среди которых широко известны «Прополиса настойка», мазь «Пропоцеум», аэрозоль «Пропосол» и др. Шлемник байкальский используется как сырье для приготовления настойки гипотензивного и седативного действия. Петрушка кудрявая является традиционным пищевым растением. Также прополис, шлемник байкальский и петрушка кудрявая входят в состав зарегистрированных биологически активных добавок (БАД) к пище.
В настоящее время становится все более актуальной проблема безопасности и подлинности сборов лекарственных трав и биологически активных добавок, а также разработки достоверных критериев их идентификации.
Необходимость определения незначительных концентраций действующих веществ на фоне сложного матрикса БАД предъявляет высокие требования к селективности и чувствительности методов анализа.
Решение этих задач тормозится отсутствием в большинстве случаев достоверных методов контроля действующих начал в составе комплексных БАД. Большинство существующих нехроматографических методов определения индикаторных компонентов растительных БАД неселективны, трудоёмки и могут в отдельных случаях приводить к получению, как ложноположительных результатов, так и к искажению количественных данных.
Одними из наиболее перспективных методов для решения этих задач являются хроматографические методы, сочетающие высокую эффективность разделения компонентов БАД с избирательностью и чувствительностью детектирования.
Цель и задачи исследования
Цель: разработать методики анализа флавонов в наиболее ценных источниках этих веществ: прополисе, корнях шлемника и траве петрушки. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи.
• Изучить физико-химические свойства флавонов;
• Разработать методики пробоподготовки сырья и продуктов на его основе, обеспечивающие наибольшую эффективность экстракции, характеризующиеся невысокой трудоемкостью;
• Подобрать оптимальные хроматографические условия для определения флавонов на фоне сложного матрикса;
• Оценить параметры пригодности хроматографических систем;
• Разработать методики количественного определения флавонов;
• Оценить метрологические характеристики разработанных методик; • Апробировать разработанные методики на образцах растительного сырья, экстрактов растительного сырья, лекарственных препаратов, БАД и обогащенных продуктов на его основе.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук
Диссертационная работа выполнена в рамках НИР кафедры фармацевтической химии ММА им. И.М. Сеченова «Совершенствование контроля качества лекарственных средств», № госрегистрации 01.200.110545.
Научная новизна результатов исследования
Разработаны оригинальные методики идентификации и количественного определения индикаторных флавонов в лекарственных препаратах, БАДах и пищевых продуктах: определение апигенина, акацетина и хризина в прополисе, определение байкалина в шлемнике байкальском, определение апиина и малонилапиина в петрушке кудрявой.
Практическое значение работы
Разработанные методики использовались при гигиенической экспертизе более 80 БАД и сырья для БАД к пище в ГУ НИИ Питания РАМН. Методики определения апигенина, акацетина и хризина в прополисе, определение байкалина в шлемнике байкальском, определение апиина и малонилапиина в петрушке кудрявой включены в «Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище» (дополнение к Р4.1.1672-03, Минздрав РФ).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.
Апробация работы
Результаты исследований доложены на межрегиональной научно-практической конференции «Питание здорового и больного человека» (май 2007 г., г. Рязань); на научных конференциях кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии ММА им. И.М.Сеченова (2005 - 2007 гг.); на Международной научно-практической конференции Apimondia (июль 2005 г., г. Дублин); на семинаре «Аналитическая химия в контроле безопасности, качества и подлинности пищевых продуктов и биологически активных добавок к пище» AnalyticaExpo-2006 (апрель 2006 г., Москва), конгрессе «Фитофарм 2006» (июнь 2006 г., Санкт-Петербург)
Объем и структура работы
Диссертация изложена на 106 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов исследования и их обсуждения, выводов и библиографического указателя, включающего 115 источников. Работа иллюстрирована 19 рисунками и 23 таблицами.
Положения, выносимые на защиту:
• Метод количественного ВЭЖХ-определения индикаторных производных флавоноидов прополиса: кемпферола, изорамнетина, апигенина, хризина, акацетина, кемпферида, галангина, пиноцембрина и пиностробина;
• Метод количественного ВЭЖХ-определения флавона байкалина в корнях шлемника байкальского Scutellaria baicalensis Georgi;
• Метод количественного ВЭЖХ-определения флавона апиина в траве петрушки кудрявой Petroselinum crispum (Mill.) A. W. Hill;
• Результаты сравнительной оценки качества и подлинности различных лекарственных фитопрепаратов, БАД и пищевых продуктов на основе прополиса, петрушки кудрявой и шлемника байкальского.
Основные классификации флавоноидных соединений
Прополис (пчелиный клей, уза, пчелиная или- восковая смола) представляет собой клейкое смолистое вещество, которое является в улье ремонтно-строительным и антисептическим материалом. С помощью прополиса пчелы склеивают между собой все более или менее подвижные части своего жилища; замазывают отверстия, щели, чтобы избежать сквозняков, излишней влажности, укрепляют соты, полируют внутренние стенкш улья и ячейки сотов перед кладкой яиц и тем самым улучшают микроклимат улья. Прополис используется пчелами в качестве антисептического материала, так как в условиях концентрации, составляющей 50-60 тысяч пчел в улье, приобретает исключительное значение свойство защищаться, от любого, патогенного агента (вирусы, бактерии, грибы). При такой скученности1 заразные- болезни" привели , бы к. полной гибели семьи. Прополис находит применение для бальзамирования попавших в- улей и умерщвленных животных (мыши, ящерицы, шершни, муравьи, слизни, лягушки) [43].
Название этого продукта происходит от двух слов, латинского и греческого происхождения: "про" - впереди, "полис" - крепость, город. Это, по-видимому, связано- с тем, что с помощью прополиса пчелы регулируют отверстие летка, складывают прополис у летка, образуя- широкий "ковер", по которому проходят все входящие в улей или выходящие»из него пчелы. Таким образом, прополисовый коврик выполняет функцию дезифицирующего» барьера.
По вопросу происхождения- прополиса существуют различные теории. Сторонники теории внешнего происхождения прополиса считают, что пчелы собирают его со смолистых выделений коры, почек, березы, тополя, ивы, конского каштана т других хвойных и лиственных деревьев. [17]. Они утверждают, что прополис собирается следующим образом: сначала пчела забирает при- помощи? мандибул кусочек, смолы или выделения, которые перерабатывает, а затем помещает их в корзиночку одной?задней ножки. Таким образом, пчела делает обножки, как и при сборе пыльцы. С этим грузом; смольг пчела летит вулей; где другие пчелы забирают у нее обножку, и используют по назначению:
Согласно теории внутреннего происхождения прополис является смолистым остатком от первой фазьь переваривания- пыльцы. Рабочие пчелы глотают пыльцу, в кишечнике пыльцевые зерна набухают и лопаются. Из них вытекает плазма» которую пчелы используют для кормления; молодых пчел -кормилищ расплода. Из. оболочек пыльцевых зерен, образуется бальзам, который пчелы выделяют в виде капель. Этот бальзам; и является» основной составной? частью; прополиса; С. А. Поправко [98] подтверждает растительное происхождение прополиса идентичностью химического состава- его и экстрактов? почек березы бородавчатощ тополя; черного т других представителей растительного царства: Изг спиртовых экстрактов бёрезьь бородавчатой ВеЫш verrucosa Е. им& были; выделены и идентифицированы такие же соединения :И! примерно в такой-же концентрации как и изпрополиса:: флавоны, флавонолы и; флаваноны. На основании-этих данных и исследований образцов прополиса, собранных в, пределах большой географической зоны Европейской части РФ он считает, что наиболее распространенным (65 %) типом, прополиса-является; "березовый". Вторым по распространенности (15 %) является "тополиный" тиш прополиса;. Его1 химический, состав- коррелирует с выделениями- тополиных почек {Populus nigra .),. в- составе которых преобладают флавоны хризин; флавонол галангин и флавонон пиноцембрин. Третий по; распространенности тип прополиса - "березово-тополиный". Считалось, что в улье есть специальные прополисные пчелы,, которые перерабатывают цветочную пыльцу, добавляют свою; слюну, воск и небольшое количество посторонних механических примесей, и рассматривает прополис как сложный комплекс, содержащий вещества растительного и животного происхождения [5].
Лечебные свойства прополиса были известны людям с древнейших времен. Особенно хорошо были знакомы с прополисом в Древнем Египте. За несколько тысячелетий до нашей эры прополис был хорошо известен жрецам, в чьих руках были сосредоточены, медицина, химияи искусство мумифицировать трупы. Сведения о прополисе имеются в сочинениях Галена и Варрона. В известном сочинении «Канон врачебной науки» Абу али Ибн Сина (Авиценна) писал, что «черный воск (прополис) имеет свойство вытягивать концы стрел и шипы, он разрежает, слегка очищает и сильно мягчит». Ввиду того, что цена на прополис была высокая, его стали постепенно- заменять более дешевыми средствами-(тополевым маслом). Из аптечной практики прополис совершенно исчез к концу XVIII века. Через некоторое время его опять ввели в медицину как средство при лечении ран, мозолей и злокачественных новообразований. Это длилось вплоть до-XIX столетия. Во время англо-бурской войны (1900) препарат на основе прополиса «Ирополизин» применялся- для лечения огнестрельных ран. В- годы Великой Отечественной- войны прополис был испытан в- двух хирургических клиниках г. Свердловска и при лечении раненных дал хороший результат. Однако, применение прополиса в медицине, как и в ветеринарии, носило эпизодический характер. Даже в середине шестидесятых годов XX века французский ученый Реми Шовен констатировал: «Что касается прополиса, прибывшего последним в группу апитерапевтических препаратов, несколько работ указывают на то, что его действие может быть очень интересным в различных областях клиники». После всестороннего изучения свойств прополиса прополиссодержащие препараты с конца шестидесятых и начала семидесятых годов стали широко внедряться в медицинскую практику.
Выделение растительных флавоноидов
Для количественного определения флавоноидов в лекарственном растительном сырье используют физико-химические методы анализа, преимущественно фотоэлектроколориметрические и спектрофотометрические методы. Фотоэлектроколориметрический метод (ФЭК) ФЭК основан на измерении оптической плотности окрашенных растворов, полученных по реакции флавоноидов с солями металлов и азосочетания с солями диазония.
Предварительно сырье очищают хлороформом, получают спиртовое извлечение флавоноидов, затем проводят реакцию образования азокрасителя с диазотированным стрептоцидом и измеряют оптическую плотность окрашенного раствора при 430-435 нм с помощью ФЭК. Содержание суммы флавоноидов расчитывают по калибровочному графику, построенному по стандартному образцу рутина.
Суммарное содержание полифенольных соединений (обычно в пересчете на галловую кислоту, танин или катехин) определяют методом Фолина-Чокальтеу, основанным на образовании раствора окислов вольфрама и молибдена, с максимумом абсорбции при длине волны 750 нм. Спектрофотометрический метод (СФМ)
СФМ основан на способности флавоноидов или их окрашенных комплесов поглощать монохроматический свет при определенной длине волны. Существуют три основных подхода к СФМ анализу флавоноидов: 1. Получают спиртовое извлечение и измеряют собственное поглощение 2. Получают спиртовое извлечение, затем проводят реакцию образования комплекса с 2 %-ным спиртовым раствором алюминия хлорида и измеряют оптическую плотность. Принцип метода заключается в том, что реагент образует кислотоустойчивые комплексы с С-4 кетогруппой и/или с С-3 или С-5 гидроксильной группой флавонов и флавонолов. Кроме того, хлорид алюминия образует кислотонеустойчивые комплексы с дигидроксигруппами в орто положении А и В колец флавоноидов. Максимумы поглощения комплексов флавонолов с С-3 и С-5 гидроксигруппами (галангин, морин, кемпферол) и с дигидроксигруппами в орто положении (рутин, кверцетин, кверцитрин и мирицетин) составляют 415-440 нм. Максимум абсорбции комплексов, образованных хризином и апигенином (флавоны), у которых есть только С-5 гидроксил и С-4 кетогруппы, составляет 395 и 385 нм, соответственно. 3. Получают извлечение антоцианов 1 %-ным раствором хлороводородной кислоты из цветков василька синего, при этом образуются окрашенные оксониевые соли, у которых измеряют оптическую плотность.
В УФ-спектрофотометрии для подтверждения структуры флавоноидов используют поглощение при двух максимумах абсорбции. Первая полоса в области от 320 до 385 нм соответствует поглощению кольца В, а вторая полоса в области от 250 до 285 нм - поглощению кольца А. Батохромный эффект обусловлен увеличением числа гидроксильных групп: например, до 367 нм для кемпферола, до 371 нм для кверцетина и 374 нм для мирицетина. Производные флавана - флаваноны, флаван-3-олы и др. имеют максимумы поглощения только в области от 250 до 280 нм.
Данные свойства используются при обнаружении полифенольных соединений в процессе их анализа методом тонкослойной хроматографии (ТСХ): флавонол-3-гликозиды, флаваноны, халконы обнаруживаются в УФ-свете в виде коричневых пятен; флавонолы и их 7-гликозиды- - в виде желтых или желто-зеленых пятен; ксантоны в виде оранжевых пятен; изофлавоны при этом не проявляются. Флуоресценция- усиливается после обработки хроматограмм одним из реактивов (5 %-ным спиртовым раствором алюминия хлорида с последующим нагреванием при температуре 105 С в течение 3-5 мин; 5 % раствором треххлористой сурьмы в тетрахлориде углерода; 2 % спиртовым раствором щелочи). [2]
Наиболее распространенным методом идентификации и количественного определения флавоноидов в настоящее время является ВЭЖХ. Ввиду относительно высокой полярности полифенольных соединений практически не используется НФ-ВЭЖХ на силикагеле. Наиболее широко используется ОФ-ВЭЖХ, т.е. хроматографический процесс, при котором неподвижная фаза менее полярна, чем подвижная.
В обращенно-фазовой жидкостной хроматографии часто используется химически модифицированный длинноцепочечными (С 18, С16, С8) алкилсиланами силикагель (химически привитая обращенная фаза), поверхность которого становится малополярной в результате образования устойчивых к гидролизу обычно при рН 2-8 Si-0-Si-C связей. Силикагель переводят в обращено-фазовый сорбент путем реакции с алкилтрихлорсиланом, чаще всего октадецил-трихлорсиланом. В результате поверхность силикагеля модифицируется химически связанным Ci8 - углеводородными цепями. В отличие от НФ-ВЭЖХ на силикагеле, при ВЭЖХ на химически привитых фазах механизм разделения основан не только на явлениях адсорбции (за счет гидрофобных взаимодействий между разделяемыми компонентами и углеводородными цепями сорбента), но включает и ЖЖР между ПФ и слоем растворителя, удерживаемого неполярной поверхностью сорбента.
В анализе фенольных соединений методом ВЭЖХ в качестве элюэнта наиболее часто используются водные смеси с полярными, водорастворимыми органическими растворителями: метанол, ацетон, ацетонитрил. Величина рН среды является одним из главных факторов, особенно, при разделении ионизированных соединений, таких как антоцианы. Чаще всего используются такие кислоты как муравьиная, уксусная, фосфорная кислоты, а таюке кислотный фосфатный буфер, для подавления диссоциации полифенолов при кислотных рН и образования неионогенных форм фенольных соединений.
Не существует определенной фиксированной длины волны для детектирования всех классов флавоноидных соединений в УФ-видимой области. Область 350-370 нм широко используется для определения флавоноловых агликонов, а длина волны 280 нм - для флаванонов, флаванонолов, флаван-3-олов и танинов. [52]
Флуориметрический детектор по чувствительности и селективности превосходит спектрофотометрический, однако, ввиду отсутствия удобных для детектирования максимумов эмиссии в видимой области спектра, используется намного реже спектрофотометрии.
Стандартные образцы
На долю метилированных флавоноидов приходится более 50 % от общей суммы флавоноидов, такое соотношение является уникальным, не имеющим аналогов в растительном мире. Следует отметить, что характерным для прополиса является преобладание флавоновых и метилированных агликонов. Высокие абсолютные концентрации флавонов в прополисе (2-3 %) практически не встречаются в многочисленных растительных источниках флавоноидов.
Российский- прополис отличается более разнообразным составом флавоноидов, высокое содержание моно- и диметилпроизводных кемпферола является его характерной особенностью. Для южно-американского и китайского прополиса является специфичным преобладание хризина (его содержание в Л ,5-2 раза выше, чем в российском) и производных флаванона: пиноцембрин и пиностробин (их содержание в 4-5 раз, выше чем в российском).
Суммарное содержание флавоноидов находится в пределах от 5 - 8 %, что делает прополис одним из самых богатых источников флавоноидов.
Невысокие концентрации флавоноидов в образцах №10; 12г и 20 обусловлены плохой очисткой- и низким качеством сырья.
В. лекарственных препаратах были обнаружены все индикаторные компоненты, полученные результаты являются достоверным подтверждением качества данных образцов.
По результатам анализа только «Прополис с витамином С на фруктозе» и мед с прополисом «Коломенский» может рассматриваться в качестве существенного источника флавоноидов, во всех остальных добавках-флавоноиды. присутствуют в следовых количествах, либо не обнаружены. Подтвержден тот факт, что в отличие от других растительных источников в прополисе преобладают агликоны, а не гликозиды, что связанно с энзиматической активностью пчелиной слюны [43].
Проведенное исследование подтверждает необходимость тщательного контроля содержания флавоноидов в сырье, лекарственных препаратах, БАД и других продуктов на основе прополиса. Разработанный метод позволяет оценивать качество и компонентный состав прополиса на фоне сложных матриксов БАД и лекарственных препаратов при его присутствии в концентрации- от 0,1 % (по хризину), а также делает возможным оценку его происхождения.
Подготовка проб для хроматографического анализа
Пробоподготовка образцов заключается в экстракции байкалина из корней шлемника. Содержимое капсул или растёртых таблеток, содержащее около 0,1 г сухого экстракта или 0,5 г порошка корней шлемника взвешивали с точностью до четвертого знака и помещали в круглодонную колбу объёмом 100 мл, прибавляли 80 мл смеси этанол вода (7:3), экстракцию проводили при нагревании на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 45 минут. Экстракт охлаждали до комнатной температуры, надосадочную жидкость фильтровали.через целлюлозный или тефлоновый фильтр с размером пор до 0,45 мкм в мерную колбу объёмом 100 мл. Объём экстракта доводили спиртом до 100 мл, перемешивали.
Оптимизация условий экстракции байкалина
Для идентификации всего состава флавонов водно-спиртовых экстрактов корней S.baicalensis, необходимо использовать сложные смеси труднодоступных стандартов флавонов и их глюкоронидов, что не представляется возможным. В этой связи наиболее информативным и адекватным является анализ байкалина (7-О-глюкоронид- байкалеина), относительное содержание которого составляет более 80 % от общей суммы флавонов. В процессе работы нами оптимизировались условия проведения экстракции флавоноидов шлемника из лекарственных форм (состав экстрагента, время, температурный режим). Выбор экстрагента
При выборе растворителя, учитывали растворимость испытуемого вещества, его совместимость с подвижной фазой и прозрачность при используемых для, детектирования длинах волн. Согласно литературным данным, для экстракции байкалина наиболее удобными являются водно-спиртовые смеси, содержащие 60-90 % спирта.
Нами применялись смеси содержащие от 70 до 80 % этанола. Были исследованы варианты смесей этанол - вода, (6:4), (7:3), (8:2), (9:1). 90 мл каждого варианта водно-этанольной смеси с различной концентрацией помещали в круглодонную колбу объёмом 100 мл, содержащую одинаковое количество измельченных корней шлемника байкальского., экстракцию проводили при нагревании на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 45 минут. После охлаждения, смесь фильтровали и доводили, водой, до 100 мл. Контроль полноты экстракции байкалина, осуществляли по методике ВЭЖХ. Оптимальной признана смесь этанол - вода (7:3).
Проводились испытания влияния времени на полноту экстракции. В каждую из четырёх колб содержащих одинаковое количество порошка корней шлемника байкальского , добавляли 90» мл смеси этанол - вода (7:3) и проводили экстракцию на кипящей водяной бане в течение 15, 30, 45 и 60 минут, соответственно. После охлаждения и фильтрации объём экстракта доводили до 100 мл.
Подготовка проб для хроматографического анализа
По разработанной методике проведён анализ травы петрушки, проанализированы некоторые БАД, изготовленные на ее основе (таблетки, капсулы, порошоки, фильтр-пакеты). Рассчёт концентраций апиина проводили по площадям пиков, используя метод внешнего стандарта. Полученные результаты представлены в таблице 23.
Образцы содержащие петрушку кудрявую Наименование образца Декларируемое содержание Содержание апиина Содержаниемалонил-апиина Суммарное содержание флавонов 1 2 3 4 5 БАД к пище «Traditional Arth», мг/капс. Не декларируется 0.14 0,10 0,24 БАД к пище «Нейчерс - Вей -12овощей», мг/капс. Не декларируется 0.25 0,15 0,40 БАД к пище «Эко плюс», мг/пил. Не декларируется 0,27 0,14 0,41 БАД кпище «Овощной натуральный экстракт Саша Натура»,мг/ЮОмл Не декларируется 0,35 0,19 0,44 1 2 3 4 5 БАД к пище«БиоСпектрум»,мг/таб. 1 мг листьев и корня петрушки 0,07 0,05 0,12 БАД к пище «Витабаланс 2000», мг/таб. Листья петрушки 30 мг 0,52 0,31 0,83 БАД к пище «Вита Грин Плюс (Живая зелень)», мг/г Петрушка 1,500 г в банке (228г-1 банка) 0,24 0,17 0,41 БАД к пище «Грин Чи» мг/ г Петрушка 1,000 г (136г-1 банка) 0,09 0,07 0,16 БАД к пище «Дискавери» мг/таб. Петрушка (лист) 50 мг 1,12 1,04 1,16 БАД к пище «Диуресс Формула» мг/капс. петрушка, порошок семян илистьев - 32 мг 0,05 0,04 0,09 БАД к пище «Д-красота», мг/капс. Листья петрушки 40 мг 0,10 0,08 0,18 БАД к пище «Зеленая защита»,мг/г петрушка 3,5 мг/г 0,02 0,01 0,03 БАД к пище«ОстеоПлюс»,мг/таб. Петрушка 150 мг 2,9 1,7 4,6 БАД к пище «Ренсепт» мг/таб. Петрушка (лист) 25 мг/таб. 0,5 0,2 0,7 БАД к пище «Слим Комплекс» мг/капс. листья петрушки 70 мг 0,61 0,44 0,15 БАД к пище «Фиторен», мг/таб Петрушка (лист) 25 мг 0,47 0,35 0,82 Сухие листья петрушки «Перекресток», % 100% петрушка 1,9 0,9 2,8 Сухие листья петрушки «Котани», . % 100% петрушка 2,7 2,1. 4,8 Сухие листья петрушки «Аппетита», % 100% петрушка 1,7 1,3 2,8 Сухие листья петрушки «Магия востока», % 100% петрушка 2,1 1,2 3,3 По результатам наших исследований апиин является доминирующим по отношению к другим флавонам. Содержание апиина может рассматриваться как достоверный критерий качества исходного сырья травы петрушки, а также использоваться для выявления неправильного этикетирования и фальсификации продукции.
В результате проведенных исследований нами установлено, что содержание апиина в траве петрушки составляет 2,5-5,0 %. Данные о содержании флавона могут использоваться в оценке их уровня потребления с биологически активными добавками или лекарственными препаратами. Рекомендуемый профилактический адекватный уровень потребления флавонов составляет 5 мг/сутки.
Таким образом, разработанная нами методика может быть использована для стандартизации и контроля качества лекарственных препаратов, сборов, биологически активных добавок и фиточаев, содержащих измельченную траву петрушки.
Выводы из главы IV
1. Предложены методики пробоподготовки, хроматографического анализа и количественного определения флавоноидов в прополисе, байкалина в шлемнике байкальском и апиина и малонилапиина в петрушке кудрявой.
2. Для всех флавонов расчитаны параметры хроматографического разделения, количественного определения и проведена статистическая обработка результатов.
3. На примерах определения флавонов в опытных образцах сырья, лекарственных препаратов, БАД и пищевых продуктов, показана адекватность разработанных методик и правильность выбора соответствующего флавона в качестве маркера.
4. Обнаружение образцов с низким содержанием флавонов, подтверждает актуальность применения данных методов для контроля качества сырья, лекарственных препаратов, БАД и пищевых продуктов. Общие выводы
1) Изучены физико-химические свойства (растворимость, хроматографическая подвижность, уф- и видимые спектры, масс-спектры) флавонов, входящих в состав прополиса, шлемника байкальского и петрушки кудрявой.
2) Разработаны универсальные методики пробоподготовки для сырья, лекарственных препаратов, БАД и пищевых продуктов. Изучено влияние растворителя и условий экстракции на степень извлечения флавонов из сырья лекарственных препаратов, БАД и обогащенных продуктов. Подобраны оптимальные и доступные оаствопители лля извлечения (Ьлавонов. Опоелелено
7) С помощью разработанных методик было проанализировано около 90 образцов растительного сырья, экстрактов, лекарственных препаратов, БАД к пище и обогащенных продуктов, проходящих экспертизу в ГУ НИИ питания РАМН. Обнаруженное содержание позволило стандартизовать продукт, оценить его качества и уровень потребления биологически активных веществ. Использование разработанных методик позволили установить, что около 10 % проанализированных образцов либо не содержали предполагаемых индикаторных компонентов, либо содержали следовые количества, что указывает на фальсификацию или низкое качество продукта. Была показана целесообразность использования разработанных методик для включения в нормативную документацию на сырье, экстракты, лекарственные препараты, БАД к пище, содержащие прополис, шлемник байкальский и петрушку кудрявую.
![Разработка параметров качества сырья наперстянки шерстистой Digitalis lanata Ehrh. Определение ланатозида С и активности эндогенных ферментов [Электронный ресурс]](/i/i/4381/182678.png "Разработка параметров качества сырья наперстянки шерстистой Digitalis lanata Ehrh. Определение ланатозида С и активности эндогенных ферментов [Электронный ресурс] Балакина Мария Владимировна")