Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 15
1.1. Общая структура, классификация и биосинтез иридоидов 15
1.2. Физико-химические свойства иридоидов 17
1.3. Распространенность и таксономическое значение иридоидов 18
1.4. Характеристика объектов исследования 19
1.4.1. Листья вахты трехлистной (Folia Menyanthidistrifoliatae) 19
1.4.2. Трава пустырника (Herba Leonuri) 21
1.4.3. Листья подорожника большого (Folia Plantaginis majoris) 22
1.4.4. Плоды кизила обыкновенного 23
1.5. Оценка подлинности и качества исследуемого растительного сырья в отечественной нормативной документации 24
1.5.1. Листья вахты трехлистной 24
1.5.2. Трава пустырника 25
1.5.3. Листья подорожника большого 26
1.6. Фармакопейные методики анализа иридоидов в растительном сырье 27
1.6.1. Фармакопейные методики качественного обнаружения иридоидов 27
1.6.2. Фармакопейные методики определения содержания иридоидов 28
1.7. Физико-химические методы в анализе иридоидов в растительном сырье 29
1.8. Современные подходы к валидации аналитических методик 33
Выводы по главе 1 36
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 37
2.1. Объекты исследования 37
2.2. Оборудование и реактивы 40
2.3. Стандартные образцы 41
2.4. Обработка полученных результатов 44
Выводы по главе 2 46
ГЛАВА 3. Изучение состава бав в листьях вахты трехлистно с использованием метода ВЭЖХ 47
3.1. Разработка методики идентификации и количественного определения
иридоидов в пересчете на логанин в листьях вахты трехлистной 47
3.1.1. Изучение оптимальных условий детектирования 47
3.1.2. Изучение оптимальных условий хроматографического разделения 49
3.1.3. Изучение оптимальных условий пробоподготовки 50
3.1.4. Методика количественного определения иридоидов в листьях вахты трехлистной 51
3.1.5. Хроматографические характеристики, параметры пригодности хроматографической системы и метрологические характеристики методики 53
3.1.6. Валидационные характеристики методики 54
3.1.7. Определение содержания иридоидов в сырье и препаратах вахты трехлистной с использованием разработанной методики 58
3.2. Определение состава и содержания флавоноидов и гидроксикоричных кислот листьев вахты трехлистной 60
3.2.1. Флавоноиды 60
3.2.2. Гидроксикоричные кислоты 62
Выводы по главе 3 64
ГЛАВА 4. Изучение состава бав травы пустырника с использованием метода ВЭЖХ 66
4.1. Разработка методики идентификации и количественного определения иридоидов в пересчете на гарпагид в траве пустырника 66
4.1.1. Изучение оптимальных условий детектирования 66
4.1.2. Изучение оптимальных условий хроматографического разделения 68
4.1.3. Изучение оптимальных условий пробоподготовки 70
4.1.4. Методика количественного определения иридоидов в траве пустырника 71
4.1.5. Хроматографические характеристики, параметры пригодности
хроматографической системы и метрологические характеристики методики 73
4.1.6. Валидационные характеристики методики 75
4.1.7. Определение содержания иридоидов в сырье и препаратах пустырника с использованием разработанной методики 78
4.2. Определение состава и содержания флавоноидов и гидроксикоричных кислот траве пустырника 81
4.2.1. Флавоноиды 81
4.2.2. Гидроксикоричные кислоты 83
Выводы по главе 4 86
ГЛАВА 5. Изучение состава бав листьев подорожника с использованием метода ВЭЖХ 89
5.1. Разработка методики определения содержания аукубина в листьях подорожника большого 90
5.1.1. Изучение оптимальных условий детектирования 90
5.1.2. Изучение оптимальных условий хроматографического разделения 90
5.1.3. Изучение оптимальных условий пробоподготовки 91
5.1.4. Методика количественного определения аукубина в листьях подорожника большого 92
5.1.5. Хроматографические характеристики, параметры пригодности хроматографической системы и метрологические характеристики методики. 94
5.1.6. Валидационные характеристики методики 95
5.1.7. Определение содержания аукубина в сырье и препаратах подорожника большого с использованием разработанной методики 99
5.2. Изучение состава и содержания иридоидов листьев подорожника ланцетного и подорожника среднего 101
5.3. Определение состава и содержания гидроксикоричных кислот и флавоноидов листьев подорожника 101
5.3.1. Гидроксикоричные кислоты 101
5.3.2. Флавоноиды 105
Выводы по главе 5 110
Глава 6. Изучение состава и определение содержания иридоидов плодов кизила обыкновенного 113
Выводы по главе 6 115
ГЛАВА 7. Сравнительное изучение состава баврастительного сырья 117
Выводы по главе 7 122
Общие выводы 124
Список литературы 128
- Характеристика объектов исследования
- Обработка полученных результатов
- Изучение оптимальных условий пробоподготовки
- Изучение оптимальных условий детектирования
Характеристика объектов исследования
При непосредственном участии автора были определены цели и задачи исследования, разработаны методологические подходы к их выполнению. Автором был проведен анализ научной литературы, отечественной и зарубежной нормативной документации. Автору принадлежит ведущая роль в разработке и валидации методик анализа, работе по идентификации и определению содержания основных БАВ в исследуемых объектах, статистической обработке и анализе полученных результатов, написании публикаций по теме исследования. Диссертация и автореферат написаны автором лично. Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Научные положения диссертационной работы соответствуют формуле специальности 14.04.02 – «Фармацевтическая химия, фармакогнозия». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пункту 6 паспорта фармацевтическая химия, фармакогнозия.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематикой и планом: «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований». Номер государственной регистрации 01.2.00606352.
Результаты исследований доложены на XVI - XVIII Международном съезде «Phytopharm» (2012 - 2014 гг.), конференции НИИ Фармации «Современные аспекты использования растительного сырья и сырья природного происхождения в медицине» (28 февраля 2013 г., г. Москва), научно-методической конференции «II Гаммермановские чтения» (3-6 февраля 2014 г., г. Санкт-Петербург); XХIII – XХV Московских международных гомеопатических конференциях «Развитие гомеопатического метода в современной медицине» (2013 - 2015 гг., г. Москва), XIV Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов с международным участием «Алиментарно-зависимая патология: предиктивный подход» (3 - 5 декабря 2013 г., г. Москва), Международном фармацевтическом форуме молодых ученых России и Германии «Новое поколение в фармации» (11-12 ноября, 2014, г. Москва), на научных конференциях кафедры фармакогнозии ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» (2012 – 2014 гг.).
Диссертация изложена на 166 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, пяти экспериментальных глав, выводов и библиографического указателя, включающего 133 источника, из которых 98 на иностранных языках. Работа иллюстрирована 43 рисунками и 44 таблицами, включает 3 приложения.
Во введении обоснована актуальность проблемы, сформулированы цели и задачи исследования, охарактеризована научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы. Первая глава представлена обзором литературы, в котором даны общие сведения об иридоидах, их структуре, свойствах и распространенности. Дана характеристика объектам исследования, оценен уровень стандартизации исследуемого растительного сырья в отечественной нормативной документации (НД). Проведено сравнительное изучение методов оценки иридоидов ЛРС и ЛП в отечественной и зарубежной НД. Дана характеристика современным физико-химическим методам, использующимся в анализе иридоидов растительного сырья, описаны подходы к валидации аналитических методик. Вторая глава описывает объекты и методы исследования. Третья, четвертая и пятая главы посвящены разработке и валидации методик идентификации и определения содержания иридоидов в лекарственном растительном сырье (листьях вахты трехлистной, траве пустырника, листьях подорожника большого, ланцетного и среднего) и препаратах из него. Подобраны оптимальные условия пробоподготовки и ВЭЖХ анализа иридоидов. С использованием разработанных методик определен состав и содержание иридоидов в ЛРС и препаратах. С использованием метода ВЭЖХ изучен состав и содержание других БАВ (флавоноидов, ГКК). Шестая глава посвящена изучению состава и определению содержания иридоидов в плодах кизила обыкновенного. В седьмой главе проведено сравнительное изучение состава и содержания иридоидов и других БАВ растительного сырья.
Обработка полученных результатов
Приготовление исходных стандартных растворов Для приготовления стандартного раствора логанина для методики определения содержания иридоидов в листьях вахты трехлистной с концентрацией 0,5 мг/мл 25 мг предварительно высушенного вещества помещали в мерные колбы вместимостью 50 мл, растворяли в метаноле и доводили объем до метки.
Для приготовления стандартного раствора гарпагида для методики определения содержания иридоидов в траве пустырника с концентрацией 0,05 мг/мл 5 мг предварительно высушенного вещества помещали в мерные колбы вместимостью 100 мл, растворяли в метаноле и доводили объем до метки.
Для приготовления стандартных растворов аукубина и каталпола для методики определения содержания иридоидов в листьях подорожника с концентрацией 0,2 мг/мл 20 мг предварительно высушенного вещества помещали в мерные колбы вместимостью 100 мл, растворяли в метаноле и доводили объем до метки.
Для приготовления стандартных растворов флавоноидов и ГКК с концентрацией 0,05 мг/мл 5 мг предварительно высушенного вещества помещали в мерные колбы вместимостью 100 мл, растворяли в метаноле и доводили объем до метки. Стандартные растворы хранили при температуре -18С не более 6 месяцев. Приготовление раствора внутреннего стандарта аукубина Для приготовления раствора внутреннего стандарта аукубина для методики определения содержания иридоидов в траве пустырника с концентрацией 100 мкг/мл 10 мг предварительно высушенного вещества помещали в мерные колбы вместимостью 100 мл, растворяли в метаноле и доводили объем до метки.
Приготовление рабочих стандартных растворов
Для приготовления рабочих стандартных растворов логанина с концентрацией 4, 10, 20, 50 и 200 мкг/мл 2мл исходного стандартного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 250 мл, а также 2, 4, 10 и 40 мл - в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем до метки метанолом.
Для приготовления рабочих стандартных растворов гарпагида для методики определения содержания иридоидов в траве пустырника с концентрацией 0,5, 1, 2, 4, 8, 16 и 32 мкг/мл 1, 2, 4, 8, 16, 32 и 64 мл исходного стандартного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем до метки метанолом.
Для приготовления рабочих стандартных растворов аукубина и каталпола с концентрацией 2, 5, 10, 20 и 50 мкг/мл 1, 2,5, 5, 10 и 25 мл исходного стандартного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем до метки метанолом.
Для приготовления рабочих стандартных растворов флавоноидов и ГКК с концентрацией 0,5; 1; 2,5 и 5 мкг/мл 1, 2, 5 и 10 мл исходного стандартного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем до метки метанолом.
Рабочие стандартные растворы хранили в холодильнике при температуре -1-2С не более месяца. Статистическую обработку проводили в соответствии с требованиями ОФС 42-0111-09 «Статистическая обработка результатов химического эксперимента». Использовали t-критерий Стьюдента. Метрологические характеристики разработанных методик анализа представляли в виде следующей таблицы:
Изучение оптимальных условий пробоподготовки
Для оценки ошибки единичного определения аукубина были рассчитаны метрологические характеристики методики. Данные, полученные при определении содержания аукубина в одном лабораторном образце извлечения подорожника большого в 6 независимых повторностях, представлены в табл. 5.1.5.2.
Метрологические характеристики методики определения содержания аукубина в листьях подорожника большого (n=6) Как видно из данных табл. 5.1.5.2., относительная ошибка единичного определения с 95 % доверительной вероятностью составляет +2,2%, что свидетельствует о воспроизводимости методики. Относительная ошибка при
Валидацию методики проводили по следующим характеристикам: специфичность, линейность, предел обнаружения и предел количественного определения, правильность, прецизионность.
Хроматограмма СО аукубина представлена на рис. 5.1.6.1. Рис. 5.1.6.1. Хроматограмма СО аукубина с концентрацией 0,05 мг/мл.
Зависимость сигнала детектора от содержания аукубина была определена в диапазоне концентраций СО аукубина 0,002 – 0,2 мг/мл (соответствует выбранному диапазону применения методики - 0,1 - 10,0 мг/г сырья) по 6 точкам, для каждой точки было выполнено 3 измерения. Калибровочный график приведен на рис. 5.1.6.2. совместно с уравнением калибровочной кривой. В указанном диапазоне зависимость линейная с коэффициентом корреляции 0,9998. Предел обнаружения метода (соотношение сигнал-шум 3:1) составил 0,03 мг/г, предел количественного определения (соотношение сигнал-шум 10:1) - 0,1 мг/г.
Калибровочный график зависимости площади пика аукубина от его концентрации. Специфичность была доказана путем проверки чистоты УФ и масс-спектра пика аукубина.
Правильность методики доказывалась методом добавок СО аукубина к исследуемому образцу с известной концентрацией определяемого вещества. Добавку проводили на уровнях 50, 100 и 150% от содержания аукубина в образце. Аналитическая методика воспроизводилась трижды для каждого уровня. Результаты представлены в табл. 5.1.6.1. Таблица 5.1.6.1. Результаты оценки правильности методики Содержаниеаукубина в образце, мг/г Добавка аукубина, мг Найденноесодержание,мг/г Заданноесодержание,мг/г Отклик, %
Доверительный интервал (Р=95%), % 97,50 - 100,06 Величина относительного стандартного отклонения (1,7%) свидетельствует об отсутствии систематической ошибки. Фактор отклика с 95% доверительной вероятностью составляет 97,5 - 100,1%.
При проверке прецизионности разработанной методики была установлена сходимость и промежуточная прецизионность. Сходимость результатов была показана на 6 подготовленных пробах из однородного образца. Для оценки промежуточной прецизионности использовался набор данных, полученных в другой день вторым сотрудником лаборатории (табл. 5.1.6.2.).
Содержание аукубина в промышленных образцах измельченного сырья составило от 0,186% до 0,707%. Концентрация аукубина в настоях варьировала от 4,8 до 21,3 мг%, что в пересчете на сухое сырье составило от 0,095 до 0,462%. Таким образом, степень перехода вещества в водные извлечения составила от 44,9 до 60,3%.
Содержание аукубина в промышленных образцах сырья в фильтр-пакетах составило от 0,117 до 0,508%. В приготовленных настоях концентрация варьировала от 2,2 до 8,1 мг%, что в пересчете на сухое сырье составило от 0,072 до 0,270 %. Таким образом, степень перехода аукубина в водные извлечения составила от 53,1 до 61,5%, что в среднем превышает аналогичный показатель для измельченного сырья.
Определено достаточно высокое содержание аукубина в настойке и соках подорожника большого. Содержание аукубина в соках С1 и С2 составило 29,8 и 41,4 мг% соответственно, в настойке Н1 - 38,0 мг%.
На основании полученных данных предложена норма содержания аукубина в высушенном сырье подорожника большого - не менее 0,1%.
Изучение состава и содержания иридоидов листьев подорожника ланцетного и подорожника среднего
Содержание аукубина в листьях подорожника ланцетного составило 0,59 и 2,59%, каталпола – 1,37 и 1,93%. В листьях подорожника среднего обнаружено 0,19 и 0,82% аукубина.
Идентификация и определение содержания ГКК проводилась с помощью ВЭЖХ с фотометрическим (длина волны - 330 нм) и масс-детектированием по методике [21]. Листья подорожника большого содержали в качестве основного вещества кофеоилфенилэтаноидный гликозид плантамайозид (кофеоил-диглюкозил-тирозол) (рис. 5.3.1.1.).
Изучение оптимальных условий детектирования
С использованием разработанных ВЭЖХ-методик определен состав и содержание иридоидов в растениях, относящихся к различным семействам: вахтовых, яснотковых, подорожниковых, кизиловых. Иридоидные гликозиды изучаемого растительного сырья принадлежат к различным классам и являются таксономическими маркерами.
Показано, что в листьях вахты трехлистной преобладают C-10 иридоидные гликозиды логанинового типа (логаниновая кислота, логанин) и соответствующие им секоиридоиды (секологаниновая кислота, сверозид). Дитерпеновые производные данных соединений (дигидрофолиаментин, фолиаментин, ментиафолин) являются уникальными маркерами рода вахта, содержащимися в сырье в значительном количестве (около 1%). Суммарное содержание иридоидов в листьях вахты трехлистной составило 1,38 – 2,65%.
Иридоиды логанинового типа также идентифицированы в плодах кизила обыкновенного. Основным иридоидом плодов кизила является логаниновая кислота, идентифицированы логанин, сверозид. В качестве маркерного компонента обнаружен корнузид. Содержание иридоидов в пересчете на сухое сырье составило от 0,72 до 2,26%.
Иридоиды травы пустырника относятся к С-9 иридоидным гликозидам. Выявлены значительные различия в составе и содержании иридоидов двух фармакопейных видов пустырника, позволяющие однозначно определить видовую принадлежность растительного сырья. В качестве основных маркерных иридоидных гликозидов травы пустырника пятилопастного идентифицированы гарпагид, галиридозид и гарпагида ацетат. Суммарное содержание иридоидов в изученном сырье составило 0,05-0,33%.Маркерами травы пустырника сердечного являются аюгол, галиридозид и аюгозид. Суммарное содержание иридоидов в траве пустырника сердечного значительно превысило полученные значения для пустырника пятилопастного и составило 1,57 %. Основным иридоидным гликозидом листьев подорожника большого, ланцетного и среднего является С-9 иридоидный гликозид аукубин, являющийся маркерным соединением растений рода подорожник. Сырье подорожника большого и среднего характеризовалось схожим содержанием аукубина (0,12 - 0,57% и 0,19 - 0,82% соответственно), в листьях подорожника ланцетного определено 0,59 - 2,39% аукубина. Идентифицирован индикаторный иридоид подорожника ланцетного - каталпол, содержавшийся в сырье в значительном количестве (1,37 – 1,93%).
Изучен состав и содержания производных ГКК растительного сырья методом ВЭЖХ. В сырье вахты трехлистной среди ГКК преобладали кофеоилхинные кислоты (хлорогеновая, неохлорогеновая, 4-кофеоилхинная, дикофеоилхинные кислоты), широко распространенные в растениях и не являющиеся индикаторными соединениями. В качестве основного компонента идентифицирована хлорогеновая кислота (0,28 – 0,41%). Хлорогеновая кислота также была обнаружена в пустырнике пятилопастном (0,03 – 0,32%) и сердечном (0,09%), а также в листьях подорожника ланцетного (0,02 – 0,04%).
Однако преобладающей группой производных ГКК в сырье видов пустырника и подорожника являлись кофеоилфенилэтаноидные гликозиды. Вербаскозид идентифицирован в пустырнике пятилопастном (0,02 – 0,4%), пустырнике сердечном (0,06%), подорожнике ланцетном (0,63 – 0,94%) и подорожнике среднем (0,56 – 0,99%). В траве пустырника наряду с вербаскозидом присутствовал лавандулифолиозид (0,03 – 0,4% в пятилопастном, 0,09% в сердечном). В качестве основного кофеоилфенилэтаноидного гликозида листьев подорожника большого идентифицирован плантамайозид (1,08 – 1,33%), который может быть отнесен к маркерным соединениям для данного вида сырья. Суммарное содержание производных ГКК в листьях вахты трехлистной составило 0,43 – 0,86%, траве пустырника пятилопастного – 0,16 – 1,57%, траве пустырника сердечного – 0,29%, листьях подорожника большого – 1,18 – 1,50%, подорожника ланцетного – 0,99 – 1,49%, подорожника среднего – 0,84 – 1,48%.
Методом ВЭЖХ получены данные по составу и содержанию флавоноидов в изучаемом растительном сырье. В листьях вахты трехлистной и траве пустырника преобладали флавоноловые гликозиды. Идентифицированы гликозиды кверцетина: рутин, гиперозид и изокверцитрин, во всех образцах преобладал рутин (0,12 – 0,16% в листьях вахты трехлистной, 0,04 – 0,29% в траве пустырника пятилопастного, 0,09% в траве пустырника сердечного). В сырье вахты трехлистной также обнаружен рутинозид кемпферола – никотифлорин. Значительных видовых отличий в составе флавоноидов пустырника пятилопастного и сердечного отмечено не было, маркеров не выявлено. В листьях изучаемых видов подорожника обнаружены флавоновые гликозиды - производные апигенина, лютеолина, скутелляреина, трицетина.
Состав основных флавоноидов видов подорожника индивидуален. В листьях подорожника большого преобладали гликозиды скутелляреина и его метокси производного (6-метоксискутелляреина), являющиеся маркерными соединениями. Идентифицированы гомоплантагинин, плантагинин, непетин-7 О-глюкозид, скутелляреин-7-О-малонилглюкозид, гиспидулин-7-О 122 малонилглюкозид, апигетрин. В листьях подорожника среднего в качестве маркеров обнаружены глюкурониды флавонов. В качестве основного соединения обнаружен лютеолин-7-О-глюкуронид (0,37 - 0,39%). Идентифицированы также апигенин-7-О-глюкуронид, трицин-7-О-глюкуронид, хризоэриол-7-О-глюкуронид. В листьях подорожника ланцетного идентифицирован лютеолин-7-О-глюкуронид (0,02 - 0,04%), маркерные соединения не были идентифицированы. Суммарное содержание флавоноидов в листьях вахты трехлистной составило 0,21 - 0,31%, траве пустырника пятилопастного – 0,06-0,46%, траве пустырника сердечного – 0,12%, листьях подорожника большого – 0,62 - 1,11%, подорожника ланцетного – 0,59 - 0,75%, подорожника среднего – 0,83 - 0,91%.
![Разработка параметров качества сырья наперстянки шерстистой Digitalis lanata Ehrh. Определение ланатозида С и активности эндогенных ферментов [Электронный ресурс]](/i/i/4381/182678.png "Разработка параметров качества сырья наперстянки шерстистой Digitalis lanata Ehrh. Определение ланатозида С и активности эндогенных ферментов [Электронный ресурс] Балакина Мария Владимировна")