Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современное состояние исследований в области систематики, химии и фармакологии рода Echinacea Moench. Обзор литературы .10
1.1. Краткий исторический обзор таксономического изучения Echinacea purpurea 10
1.2. Характерные морфологические признаки и отличия видов Echinacea 11
1.3. Географическое распространение 15
1.4. Химический состав E.purpurea 17
1.5. Фармакологические свойства и применение E.purpurea в традиционной и официальной медицине 20
1.6. Токсичность E.purpurea 27
Выводы по главе 28
Глава 2. Материалы и методы исследований 29
2.1. Методы биологических исследований 29
2.2. Методики идентификации биологически активных веществ 31
2.2.1. Методы спектроскопических исследований, реактивы, аппаратура 31
2.2.2.Методы идентификации полифенольных соединений 32
2.2.3.Методы анализа полисахаридов 32
2.3. Методы технологических исследований 32
2.4. Фармакологические методы 33
2.4.1.Определение острой токсичности 33
2.4.2.Определение хронической токсичности 34
2.4.3.Методы исследования морфоструктуры внутренних органов лабораторных животных 36
2.4.4.Методы оценки аллергизирующего (сенсибилизирующего) действия 36
2.4.5.Изучение интенсивности окислительно- восстановительных процессов в НСТ-тесте 37
Глава 3. Изучение возможности культуры E.purpurea в Ставропольском крае 38
3.1. Семенная репродукция 38
3.2. Вегетативное размножение 43
3.3. Интродукционные исследования 43
Выводы по главе 51
Глава 4. Морфологические и анатомические исследования E.purpurea 52
4.1. Морфологические признаки 52
4.2. Основные морфолого-анатомические диагностические признаки сырья 54
Выводы по главе 72
Глава 5. Биологически активные соединения E.purpurea, выращенной в условиях интродукции 73
5.1. Полифенолы 73
5.1.1.Фенолокислоты 75
5.1.2.Флавоноиды 78
5.1.3.Кумарины 84
5.2. Полисахариды 86
5.2.1.Выделение и очистка полисахаридов 86
5.2.2.Изучение качественного состава полисахаридов 88
5.2.3.Определение количественного содержания полисахаридного комплекса в надземной части E.purpurea 90
5.3. Микроэлементный состав E.purpurea 91
5.4. Определение общих числовых показателей сырья 92
Выводы по главе 94 Глава 6. Разработка оптимальных условий производства лекарственной формы из травы E.purpurea экстракта концентрата и
сиропа на его основе 95
Выводы по главе 105
Глава 7. Фармакологические исследования сиропа "Иммунекс" 106
7.1. Определение острой токсичности сиропа "Иммунекс" 106
7.2. Изучение хронической токсичности сиропа "Иммунекс" 107
7.2.1.Влияние сиропа на гематологические и биохимические показатели крови 109
7.2.2.Влияние сиропа на функциональное состояние печени крыс 116 7.2.3.Влияние сиропа на функциональное состояние почек крыс 121
7.2.4.Влияние сиропа на центральную нервную систему 124
7.2.5.Влияние сиропа на массу и общее состояние крыс 127
7.3. Исследование морфоструктуры внутренних органов лабораторных животных после хронического воздействия сиропа "Им мунекс" и препарата сравнения "Иммунал" 129
7.3.1.Интактные животные (введение воды в течение 2-х недельного срока) 129
7.3.2.Введение "Иммунала" в течение 2-х недель 130
7.3.3.Введение сиропа с сорбитом и лактозой в течение 2-х недель. 131
7.3.4.Энтеральное введение сиропа "Иммунекс" в дозе 1/10 от
ЛД50 в течение 2-х недельного срока 132
7.3.5.Энтеральное введение сиропа "Иммунекс" в дозе 1/50 от ЛД5о в течение 2-х недельного срока 133
7.3.6.Энтеральное введение сиропа "Иммунекс" в дозе 1/100 к ЛД50. 134
7.3.7.Введение "Иммунала" в течение 4-х недель 135
7.3.8.Введение сиропа "Иммунекс" с сорбитом и лактозой в течение 4-х недель 136
7.3.9.Энтеральное введение сиропа "Иммунекс" в дозе 1/10 от ЛД50 в течение 4-х недельного срока 137 7.3.10.Энтеральное введение сиропа "Иммунекс" в дозе 1/50 от
ЛД5о в течение 4-х недельного срока 138
7.3.11 .Энтеральное введение сиропа "Иммунекс" в дозе 1/100
от ЛД50 в течение 4-х недельного срока 140
7.4. Оценка аллергизирующего (сенсибилизирующего) действия сиропа "Иммунекс" 141
7.5. Иммунологические исследования 142
7.5.1.Изучение влияния сиропа "Иммунекс" на формирование первичного иммунного ответа по клеточному типу в организме
животного 142
7.5.2.Влияние сиропа "Иммунекс" на формирование гуморального иммунного ответа в организме животных 144
7.5.3.Изучение влияния сиропа "Иммунекс" на процессы фагоцитоза 145
Выводы по главе 148
Общие выводы 149
Литература
- Географическое распространение
- Методы спектроскопических исследований, реактивы, аппаратура
- Вегетативное размножение
- Основные морфолого-анатомические диагностические признаки сырья
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время отмечается широкое распространение вторичных иммунодефицитов, связанных с урбанизацией, химизацией, повышенной стрессовой нагрузкой, приводящих к срывам в функционировании иммунной системы. Такие состояния нуждаются в иммуно-коррекции. Но, иногда, это трудно осуществимо из-за высокой ценовой стоимости препаратов и их возможных побочных эффектов. В этой связи актуальной проблемой является целенаправленный поиск лекарственных растений, обладающих иммуномодулирующим действием. В развитии современной фармацевтической науки особое место занимают исследования, связанные с внедрением в медицинскую практику лекарственных препаратов растительного происхождения, изучение их химического состава и разработка оптимальных технологий получения на их основе доступных лекарственных средств. Растительное сырьё является экологичным, применение его базируется на глубокой взаимосвязи человеческого организма и природных компонентов и составляет в настоящее время одну треть от общего арсенала лекарственных средств.
Известно, что растительное сырьё по-разному влияет на иммунную систему. Некоторые из лекарственных растений, обладающих иммунотропным действием, оказывают стимулирующее влияние на иммунный статус, но большинство характеризуются как модуляторы. Тем не менее, при применении лекарственных растений и препаратов на их основе, необходима фокусировка на всём лечебном процессе, так как их нельзя рассматривать как простое органическое вещество. По мере того как фармакологические исследования выявляют новые возможности растений, возрастает необходимость изучения биологически активных веществ и механизма их действия на организм животных и человека.
Таким образом, использование лекарственных растений, обладающих иммунотропным действием, потенциально может быть использовано в практике иммуннореабилитации у лиц с вторичными иммуннодефицитными со-
стояниями, в том числе в качестве терапии сопровождения химиотерапии инфекций, при онкологических и аутоиммунных заболеваниях.
Объектом наших исследований является Echinacea purpurea L. Moench семейства Asteraceae.
Цель и задачи исследования. Целью нашей работы явилось проведение комплексных фармакогностических, технологических и фармакологических исследований по введению в культуру E.purpurea в районе Кавказских Минеральных Вод (Ставропольский край), и разработка на её основе новых лекарственных средств.
В соответствии с целью были определены следующие задачи:
Провести интродукционные исследования E.purpurea в условиях ботанического сада Пятигорской государственной фармацевтической академии.
Провести морфолого-анатомические исследования с целью установления основных диагностических признаков сырья и его стандартизации.
Изучить качественный и количественный состав основных биологически активных веществ надземной части культивируемого растения.
Разработать оптимальные условия производства экстракта из надземной части E.purpurea и сиропа на его основе.
Осуществить фармакологическую оценку предлагаемого лекарственного средства, определить эффективность его действия на клеточное и гуморальное звенья иммунной системы.
Разработать НД на траву и сироп на основе экстракта из травы E.purpurea.
Научная новизна. Впервые на основе интродукционных исследований показана возможность культуры E.purpurea в Ставропольском крае. Установлен качественный состав основных классов природных соединений культивируемого растения. Предложены критерии оценки качества и идентификации сырья по его основным морфологическим и анатомическим признакам. На основе разработанного экстракта концентрата из травы E.purpurea предложено оригинальное лекарственное средство — сироп "Иммунекс" с выраженным иммуномодулирующим действием. Предложена методика количе-
ственного определения суммы оксикоричных кислот в пересчёте на цикорие-вую кислоту в сиропе на основе экстракта концентрата из травы E.purpurea с использованием УФ-спектрофотометрии. Установлена специфическая фармакологическая активность сиропа "Иммунекс", подтвердившая правомерность его применения в качестве иммунотропного средства.
Практическая значимость. Результаты, полученные в процессе фар-макогностических, технологических, фармакологических исследований позволили показать возможность интродукции Е. purpurea в условиях Ставропольского края, разработать Фармакопейную статью на траву E.purpurea и предложить из нее лекарственную форму в виде сиропа на основе густого экстракта - "Иммунекс", обладающего иммунотропным действием.
Внедрение результатов исследования. На основании результатов исследований разработаны и внедрены в производство ОАО "АЙ СИ ЭН Лексредство" г. Курск технологическая инструкция, лабораторно-производ-ственный регламент и ФСП на экстракт и сироп из травы. Материалы на препарат "Иммунекс" - сироп из травы E.purpurea получили положительную оценку Фармакологического комитета, и направлены для дальнейших клинических испытаний (письмо 40001.5/2843 от 6.10.03 ОАО "АЙ СИ ЭН Лексредство"; акт сдачи-приёмки научно-технической продукции по договору №199 от 6 мая 1999г.).
Проект ФСП на траву эхинацеи пурпурной принят на экспертизу в Фармацевтический Государственный комитет МЗ РФ (письмо № 425 от 17.12.2002 г.)
Апробация полученных результатов. Основные результаты исследований доложены на научных конференциях Пятигорской государственной фармацевтической академии (1998-2004 г.г.). Диссертационная работа доложена на межкафедральной конференции Пятигорской государственной фармацевтической академии (Пятигорск, 2003г.)
По материалам диссертации опубликовано 10 работ.
Основные положения, выносимые на защиту.
Опыт введения в культуру E.purpurea в условиях Кавказских Минеральных Вод Ставропольского края.
Данные по изучению химического состава биологически-активных веществ интродуцируемой E.purpurea.
Обоснование условий получения сиропа на основе густого экстракта из травы E.purpurea.
Результаты исследования сиропа E.purpurea - "Иммунекс" в качестве им-мунотропного средства, характеризующегося стимулирующим эффектом на процессы фагоцитоза, а также на адаптационные резервы фагоцитов.
Связь задач исследований с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Пятигорской государственной фармацевтической академии (номер государственной регистрации № 01200112164) в рамках проблемы "Фармация" секция № 38 Ученого совета МЗ РФ.
Личный вклад автора. Диссертация представляет собой самостоятельный труд, включающий исследования, проводимые автором с 1998 по 2003 год. В диссертации использованы фрагменты, выполненные совместно с сотрудниками кафедр фармакогнозии, технологии лекарств, фармацевтической химии, биологии, физиологии и патологии Пятигорской государственной фармацевтической академии; кафедры иммунологии Ростовского государственного медицинского университета. Во всех работах, выполненных в соавторстве, вклад автора определяется личным участием в постановке задач, выполнении экспериментальных исследований и обобщении полученных результатов.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 183 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 6 глав, отражающих собственные экспериментальные данные, списка литературы, включающего 213 источников (в том числе 111 иностранных авторов) и приложений; диссертация иллюстрирована 37 рисунками и 63 таблицами.
Географическое распространение
Echinacea не является всецело эндемичным родом Американского Среднего Запада, хотя область наибольшего распространения его видов находится в пространстве, от юга Миссури через восточные центральные поля штата Оклахома.
Естественный ареал Echinacea простирается, кроме того, до южной части центральной Канады (рисунок 1) [170]. И всё же именно южная часть Соединенных Штатов - является наиболее характерной областью произрастания рода Echinacea. Некоторые виды, например, E.tennesseensis Small и E.laevigata Blake встречаются только в юго-восточной части США. E.sanguinea E.simulata E.tennesseensis
Strigosa- эндемична для узкой полосы от южной и центральной части Кан заса до центральной части Оклахомы и северо-востока Техаса. E.atrorubens (рисунок 1) — эндемична в узкой области, с севера на юг по восточным полям Техаса, Оклахомы (запад гор Оачита), и Канзаса. E.laevigata, очень похожая на E.purpurea (рисунок 1) [170] найдена в восточном крае географического ареола рода, от Вирджинии до Каролины к северо-восточному району Джорджии. E.pallida (рисунок 1) произрастает в прериях, степных районах Арканзаса, в Миннесоте, Висконсине, восточной Оклахоме, Канзасе, Небраска. E.purpurea встречается в открытых лесах, просеках; культивируется в садах штатов Мичиган, Огайо до Луизианы, в восточном Техасе, Оклахоме. E.paradoxa Britton var. neglecta McGregor - найдена на юге и центре Оклахомы. E.paradoxa britton var. paradoxa - распространена в Озаркских горах Миссури и Арканзаса. Исторический диапазон обитания E.sanguinea Nutt. -от востока Техаса и северо-запада Луизианы до Арканзаса и юго-востока Оклахомы. E.simulata R.L. McGregor - тянется с юга центрального Миссури на восток через штат Теннеси и северную Джорджию. Сохранились всего пять популяций E.tennesseensis (рисунок 1) в радиусе 14 миль в центре штата Теннеси [145,154].
E.purpurea широко культивируется в Европе. Её культура освоена и в нашей стране. Первое упоминание о выращивании E.purpurea в России относится к 1779 г. В настоящее время для получения лекарственного сырья этот вид выращивают на зональных опытных станциях ВИЛАРа в Краснодарский крае, в Самарской, Воронежской и Белгородской областях.
Из E.purpurea выделены семь групп биологически активных веществ, включающих полисахариды, флавоноиды, кислотные производные кофейной кислоты, жиры, полиацетилены, алкиламиды и разнообразные микроэлементы.
Известно, что количество экстрактивных веществ в корнях и листьях на третий год возделывания у E.purpurea достигает максимума 16,8 % и 17,9-20,3 % соответственно [117]. Количество экстрактивных веществ в соцветиях выше, чем в вегетативных органах и составляет 21,4-28,8 % [155].
Из всех химических соединений, обнаруженных в надземной части E.purpurea, наиболее всесторонне изучены полисахариды [110, 155], именно с присутствием полисахаридов многие учёные связывают способность стимулировать иммунитет [6, 37, 46, 47, 119]. Простые сахара представлены араби-нозой, галактозой, глюкозой, ксилозой, манозой, рамнозой, фруктозой, полисахариды — сахарозой, крахмалом, целлюлозой, гемицеллюлозой, инулином, пектином [37, 114, 138, 212]. В корнях найден фруктозан-инулин [37, ПО]. Имеются данные, что инулин специфически активирует комплемент, а фрук-тозаны обладают противораковой активностью. В надземной части растения обнаружено высокое содержание крахмала, а суммарное содержание клетчатки, пектинов, гемицеллюлозы и других нерастворимых углеводов достигает 38 % в пересчёте на сухое сырьё [138, 212]. Также был выделен из этого вида полисахарид, названный, эхинацинБ [119]. Эхинацин Б образует комплекс с гиалуроновой кислотой, придавая ей устойчивость к гиалуронидазе. В свою очередь, данный комплекс способствует усиленному синтезу гиалуроновой кислоты, фибозы и образованию фибробластов, способствующих заживлению ран [119]. К полисахаридам, обладающим иммуностимулирующими свойствами [46, 47, ПО] относятся гемицеллюлозы - гетероксилан и рамногалактан, извлечённые из сырья водно-щелочным раствором. Было установлено, что гетероксилан представляет собой 4-О-метилглюкуроно-арабиноксилан с основной цепью из остатков р-1,4-Б-ксилозы. Средняя молекулярная масса гетероксилана равна 35000 Д. Другой полисахарид - ара-бинорамногалактан - имеет молекулярную массу 45000 Д с соотношением рамнозы, ксилозы, арабинозы и галактозы 1:0,6:1:1,2. Кроме того, выделен ксилоглюкан с молекулярной массой 79500 Д, а из выжатого сока пектино-подобный полисахарид, обладающий слабым иммуностимулирующим действием [ПО]. Установлено, что иммунную активность проявляют полисахариды с молекулярной массой 1000...5000 Д, 5000...50000 Д, 50000...500000 Д, 500000...750000 Д [203].
Методы спектроскопических исследований, реактивы, аппаратура
ИК-спектры регистрировали на спектрофотометре "Specorol 71-1" "Specorol 75-1" в области 600 - 3600 см"1 в тонком слое вазелинового масла.
Электронные спектры поглощения измеряли на регистрирующем спектрофотометре "Specorol UV-VIS" и "СОР-26" в кварцевых кюветах толщиной рабочего слоя 1 см. Растворитель - этанол, концентрация - 2-Ю"5 моль/л. Моносахаридный состав полисахаридов анализировали методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ). ГЖХ проводили на хроматографе "Хром" с пламенно-ионизационным детектором. Неподвижная фаза -5% ХЕ - 60 на хроматоне N-AW-DMCS (0,2-0,25 мм) в стальных колоннах (1200x3 мм). Скорость газа (гелий 35 мл/мин). Программирование температуры 2 в минуту в диапазоне 140-220. Моносахариды анализировали в виде ацетатов-альдонитрилов.
Углеводную часть гликозидов определяли методом бумажной хроматографии по значениям Rf.
Спектрофотометрические исследования осуществляли на фотоколориметре ФЭК-56М. Удельное вращение измеряли на поляриметре "Golrs" 1=1 дм, при 23±3С. Вязкость определяли вискозиметром Оствальда (с1-0,84мм) при 23±2С. Температуру плавления определяли на столике Кофлера "Mikro-Heirtissh.Bootius". Контроль за чистотой выделенных соединений осуществляли с помощью ТСХ на пластинках "Силуфол UV" и двумерной бумажной хроматографии в следующих системах: Н - бутанол - уксусная кислота - вода в различных соотношениях; 15% - уксусная кислота; этилацитат - му-равьинная кислота - вода (10:2:3); бензол - этилацетат (2:1); хлороформ -метанол — вода (65:35:8).
Для обнаружения целевых продуктов использовали следующие проявители: 1. Моно-олигосахариды, анилин - фталатный реактив [7]. 2. Кумарины - диазореактив. 3. Флавоноиды - хромогенные реактивы [8, 7]. 4. Фенолокислоты - реактив Паули, реактив Гепфнера [9].
Для установления строения полифенольных соединений использовали определение физических констант - температура плавления, брутто формула, проводили кислотный и парциальный гидролиз, изучали УФ-спектры.
Парциальный гидролиз осуществляли 10% уксусной кислотой и 10% муравьиной кислотой в циклогексаноле в соотношении 2:1 [7]. Кислотный гидролиз О-гликозидов, флавоноидов и кумаринов проводили в 5% серной кислоте. Контроль над полнотой гидролиза осуществляли при помощи тонкослойной хроматографии. Для анализа выделенных полисахаридов, были использованы известные методики анализа [4,44, 92,93,97]. Кислотный и парциальный гидролиз проводили по описанным в литературе [2,24] методикам. Получение производных ацетатов альдонитрилов проводили по мето-ДУ [24].
Осмотическую активность растворов вспомогательных веществ определяли гравиметрическим способом по способности поглощать воду через полунепроницаемую мембрану. Навеску сиропа в количестве 10,0 г. наливали на целлофановую мембрану, надетую на диализную трубку. Трубку помещали в диализатор и выдерживали в термостате при температуре 37С. Через каждый час диализные трубки взвешивали на электронных весах и фиксировали увеличение массы.
Микробиологическую чистоту определяли в соответствии с требованиями, предъявляемыми ГФ XI [34].
Токсичность и стимулирующие защитные механизмы экстракта E.purpurea и сиропа определяли на модельной одноклеточной культуре Parametium caudatum. При определении токсичности сиропа на парамециях, на 4 предметных стекла наносили по 2 капли (0,05 мл.) культурной среды, содержащей 8-10 парамеций. Под микроскопом с увеличением 8x15 наблюдали за движением инфузорий при добавлении к ним второй капли разбавленного сиропа, отмечая концентрацию, вызывающую постепенную остановку движения этих биообъектов.
О биологической активности разработанной лекарственной формы судили по развитию устойчивости парамеций под влиянием препарата к воздействию клеточных ядов - этанола и пероксида водорода. Исследования проводили в хроническом опыте: экстракт эхинацеи или сироп добавляли к культуре парамеций и наблюдали за развитием устойчивости к воздействию 14% раствора этанола и 3% раствора пероксида водорода, вызывающих мгновенную остановку у интактных парамеций.
Количественное определение главных биологически активных веществ в растениях и разработанных препаратах с целью их стандартизации проводили спектрофотометрическим методом (оксикоричные кислоты в пересчёте на цикориевую кислоту). Плотность, рН, сухой остаток определяли по методикам ГФ XI [30]. Исследования общетоксического действия сиропа эхинацеи проводили согласно методическим рекомендациям Фармакологического комитета [20, 67].
В процессе эксперимента применяли здоровых животных (мышей и крыс). Животных для исследования получали из питомника лабораторных животных АМН РФ "Рапполово" и содержали в условиях вивария ПятГФА при одинаковом уходе и на стандартном рационе питания согласно дейст вующим стандартным правилам РФ. В аналогичных условиях содержались контрольные животные. Все травматические манипуляции на животных проводили под эфирным наркозом, как в опыте, так и в контроле.
Препарат сравнения "Иммунал" вводили перорально в организм животных через зонд в терапевтической дозе, которую рассчитывали из средней массы человека 70 кг: 60 капель (суточная доза) х 7 (курсовая доза) = 420 капель / 70 кг = 6 капель; 6 х 0,05 мл = 0,3 мл / 1 кг массы животного. Для снижения раздражающего действия препарат разбавляли водой вдвое.
Вегетативное размножение
Прикорневые листья, с длинными, крылатыми черешками, широкоовальные, зубчатые по краям, суженные к черешку, образуют розетку; стеблевые листья - напротив сидячие, яйцевидные или яйцевидно ланцетные, остроконечные, неравнокрупнозубчатые, реже цельнокрайние, с 3-5 продольными жилками, жёсткие, шероховатые от короткощетинистого опушения.
Цветочные корзинки с выпуклым, полым, густоусаженным прицветниками, цветоложем. Обёртка блюдцевидная, трёхрядная; листочки обёртки черепитчато-расположенные, ланцетные, остроконечные, отогнутые, опушенные с внешней стороны, голые по краям. Прицветники узколанцетные, с шиловидным окончанием, превышающие по длине трубчатые цветки. Краевые цветки язычковые, длиной до 6 см. пестичные, бесплодные, с двух-трёхзубчатым отгибом, снаружи опушенным. Срединные цветки трубчатые, обоеполые, с пятизубчатым венчиком. Плоды — семянки обратнопирами-дальные, четырёхгранные, к основанию суженные, с хохолком в виде короны с неравномерными зубчиками. Цвет стеблей зелёный, желтовато-зелёный, иногда с малиновыми или пурпурными пятнами; листьев — зелёный; листочков обёртки - серовато-зелёный или зелёный; цветков - малиновый или пурпурный; плодов - зелёный или зеленовато-бурый.
Сырье (трава) представляет собой куски цилиндрических шершавых стеблей, листьев, цельные и разрушенные цветочные корзинки, цветки, бутоны, редко незрелые плоды. Цветочные корзинки с выпуклым, полым, густо-усаженным прицветниками, цветоложем. Обёртка блюдцевидная, трёхрядная; листочки обёртки черепитчаторасположенные, ланцетные, остроконечные, отогнутые, опушенные с внешней стороны, голые по краям. Прицветники узколанцетные, с шиловидным окончанием, превышающие по длине трубчатые цветки. Краевые цветки язычковые, пестичные, бесплодные, с двух-, трёхзубчатым снаружи опушенным отгибом, до 6 см длины. Срединные цветки трубчатые, обоеполые, венчик пятизубчатый. Плоды - семянки с неравномернозубчатым хохолком, четырёхгранные, к основанию суженные, обратнопирамидальной формы. Цвет стеблей зелёный, иногда местами с желтоватым, малиновым или пурпурным оттенком. Листья зелёного цвета, листочки обёртки серовато-зелёного иногда зелёного цвета. Венчик малинового или пурпурного цвета, плоды - зелёные или зеленовато-бурые. Запах слабый травянистый. Вкус горьковатый, слегка жгучий.
Лист Е.ршригеа имеет дорсовентральное строение (рисунок 10).
Как видно на рисунке 11, на обаксиальной (верхней) стороне листовой пластинки заметны 1-2 слоя столбчатой (полисадной) паренхимы, на адакси-альной (нижней) - рыхлая (губчатая) паренхима. Клетки верхней эпидермы очень крупные. На рисунке 12 изображена верхняя адаксиальная часть листовой пластинки в районе главной жилки. Пучок открытый коллатеральный. Лист покрыт складчатой кутикулой, под ней эпидерма (1 слой), гиподерма (1 слой) далее клетки паренхимы. На абаксиальной стороне на уровне пучка клетки нижней эпидермы содержат пигмент. Имеется 1 слой пластинчатой колленхимы (рисунок 13).
При рассмотрении листа с поверхности видны клетки эпидермы со слегка извилистыми почти прямыми боковыми стенками (верхняя эпидерма) и с глубоко извилистыми боковыми стенками (нижняя эпидерма), устьица овальные, почти круглые, окружены 2-6 (реже) или 4-6 околоустьичными клетками (аномоцитный тип) (рисунок 14).
На нижней эпидерме устьиц значительно больше, чем на верхней (рисунок 15). Волоски четырех типов: четырёхклеточные толстостенные по жилкам листа; двухклеточные грубобородавчатые щетинистые; простые одноклеточные; редко встречаются железистые волоски. При основании волосков клетки образуют розетку. Волоски верховых листьев стебля простые, многоклеточные (2-3 клеточные), покрыты толстым слоем кутикулы, имеющие эмергентное происхождение (в образовании базальной части трихомы участвуют клетки мезофила) (рисунки 16, 17). Вдоль жилок листа видны млечники, содержимое которых, окрашивается раствором азотнокислого серебра в серый цвет (рисунок 18).
На рисунке 19 изображена схема строения черешка листа Е.purpurea на поперечном срезе. Отдельные фрагменты анатомо-гистологического строения показаны на фотографиях (рисунки 20-23).
На поперечном срезе (рисунок 20 А, Б) видны сосудисто-волокнистые пучки (открытые коллатеральные). Вверху 1 ряд эпидермальных клеток, под ними 1 ряд пластинчатой колленхимы. В центре черешка клетки паренхимы склерифицированы, они образуют целую область.
На рисунке 21 представлена абаксиальная сторона поперечного среза черешка листа. Слева прослеживается наличие зоны специализированной паренхимы (хлоренхимы) отделяющей центральную часть черешка от крыла (латеральной части). Латеральная часть представлена клетками кольцевой и пластинчатой колленхимы. На границе колленхимной и склеренхимной области находится небольшой сосудисто-волокнистый пучок. Ксилема пучка образуется клетками вторичной и первичной ксилемы. Сверху со стороны флоэмы имеется очень обширная область склеренхимы. Пучок имеет обкладку из слегка вытянутых паренхимных клеток. Между пучком и эпидермой черешка
Основные морфолого-анатомические диагностические признаки сырья
Выделение и идентификацию полисахаридов E.purpurea проводили по методикам, описанным в литературе [4,44, 92, 93, 97] и представлено на схеме рис 36. Выделение водорастворимых полисахаридов (ВРПС). Для получения водорастворимых полисахаридов воздушно-сухое сырьё последовательно обрабатывали 96% этанолом, хлороформом и водой. Полученные водные извлечения сгущали под вакуумом на роторном испарителе и осаждали 96% этанолом (соотношение экстракт : этанол 1:2). Осадок отделяли центрифугированием, высушивали при t=50C и взвешивали (ш=4%)[93]. Выделение пектиновых веществ (ПВ).
Шрот после выделения водорастворимых полисахаридов заливали смесью 0,5% р-ра оксалата аммония и щавелевой кислоты и экстрагировали 2 часа на водяной бане при температуре 70С, затем пектиновые вещества осаждали 96% этанолом (соотношение 1:1) Осадок отделяли центрифугированием, высушивали при t=50C и взвешивали (со=9%) [4].
Выделение гемициллюлозы (ГЦ).
Шрот после выделения пектиновых веществ экстрагировали 7% и 10% щёлочью NaOH в течение 17 часов. Экстракт сгущали и нейтрализовали ледяной уксусной кислотой до рН 4,5, диализовали дистиллированной водой, при этом выпадал осадок гемициллюлоза А, который отфильтровывали. Осадок отделяли центрифугированием, высушивали при t=50C и взвешивали (ю=2,5%).
В фильтрате гемициллюлозу А осаждали 96% этанолом (соотношение 1:1). Очищали методом Севага [97] и сушили над пятиокисью фосфора до постоянной массы. Гемициллюлозу Б осаждали и очищали фракционным переосаждением из водного раствора этанолом постепенно возрастающих концентраций [4, 15]. Были получены фракции: фракция 1 — соотношение гемициллюлозы А : этанол 1:0,5; фракция 2 - соотношение гемициллюлозы А : этанол 1:0,75; фракция 2 - соотношение гемициллюлозы Б : этанол 1:3. Образовавшиеся в каждом случае осадки отделяли центрифугирова нием. Для характеристики полисахаридов определяли их общий выход и мо носахаридный состав. Для этого все три фракции объединяли и взвешивали (со=5%). Идентификацию полученных веществ полисахаридной природы проводили с помощью методов, описанных в пункте 2.2.3.
Водорастворимые полисахариды (ВРПС) представляют собой порошок кремового цвета, сладковатого запаха, растворимого в воде, и не дают реакцию на крахмал.
Выделенные пектиновые вещества (ПВ) представляют собой волокнистый порошок серого цвета, медленно растворимого в воде, удельное вращение [а +122 (раствор 0,5 М НгО), что указывает на наличие а-гликозидной связи. Водные растворы пектина осаждаются 1% раствором хлорида аммония с образованием пектинов. Молярная масса, определённая вискозиметриче-ским методом [53] составляет 21307.
Гемицеллюлозы (ГЦ) представляли собой после высушивания массу в виде пластинок серо-коричневого цвета, без запаха, труднорастворимую в воде.
Количественное содержание отдельных фракций полисахаридов определяли гравиметрическим методом после высушивания [29] (таблица №15).
Для определения моносахаридного состава водорастворимых полисахаридов, пектиновых веществ и гемицеллюлоз, использовали результаты гидролиза и обработки ГЖХ хроматограмм ацетатов альдонитрилов [2]. Идентифицировали моносахариды методом бумажной хроматографии при сравнении с достоверными свидетелями. Бумага хроматографической марки Filtrak FN-11 использовалась в качестве неподвижной фазы. В качестве под вижной фазы применяли систему растворителей: н-бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:5). Фильтраты после гидролиза выпаривали до небольшого объёма и хроматографировали с достоверными образцами нейтральных моносахаридов (арабиноза, галактоза, глюкоза, ксилоза, маноза, рамноза). Хро-матограмму проявляли раствором анилин-фталатного реактива и сушили в сушильном шкафу при температуре 100-110С. Через 10-15 минут хромато-грамму извлекали и наблюдали наличие коричневых пятен, совпадающих по значениям Rf с соответствующими свидетелями (Rf арабинозы, галактозы, глюкозы, ксилозы, манозы, рамнозы соответственно равны 0,35; 0,29; 0,3; 0,43; 0,28; 0,33)[62, 95]. Относительное содержание моноз определяли методом ГЖХ по площадям пиков на хроматограммах ацетатов альдонитрилов [17]. Результаты проведённого исследования представлены в таблице №15. Из данных, приведённых в таблице видно, что в углеводный комплекс надземной части E.purpurea входят: водорастворимые полисахариды, пектиновые вещества и гемицеллюлозы. Общее содержание полисахаридов составляет 20,5% с преобладанием ПВ, поэтому нами была определена молекулярная масса полисахаридов, содержащихся во фракции ПВ. Определение проводили вискозиметрическим методом. На основе анализа данных ГЖХ можно сделать вывод о том, что в ВРПС преобладают рамноза и глюкоза, в ПВ - арабиноза, в ГЦ - ксилоза. Количественное содержание комплекса полисахаридов в надземной части определяли с помощью гравиметрического метода [29]. Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц 2 мм.
Около 10 г (точная навеска) измельчённого сырья помещали в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, добавляли 200 мл воды, колбу присоединяли к обратному холодильнику и кипятили при перемешивании на электрической плитке в течение 30 минут. Экстракцию повторяли ещё 2 раза, используя первый раз 200 мл, второй раз 100 мл воды. Водные извлечения объединяли и центрифугировали с частотой вращения 5000 об/мин в течение 10 минут и декантировали в мерную колбу вместимостью 500 мл через 5 слоев марли, вложенной в стеклянную воронку диаметром 55 мм и предварительно промытой водой. Фильтр промывали водой и доводили объём раствора водой до метки (раствор А).
