Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Современное состояние исследований по распространению в растительном мире, методам анализа, изучению биологической активности и использованию в медицине нафтохинонов (обзор литературы) 13
1.1 Характеристика нафтохинонов как класса соединений 13
1.1.1 Классификация, строение и физические свойства хинонов 13
1.1.2 Распространение нафтохинонов в природе 15
1.1.3 Биосинтез нафтохинонов 20
1.1.4 Современные методы выделения, идентификации и количественного определения шиконина и его эфиров 23
1.1.5 Биологическая и фармакологическая активность шиконина и его производных 26
1.1.6 Использование шиконина и его производных в промышленности и медицине 29
1.2 Ботаническая характеристика сем. Boraginaceae и его видов во флоре
России и сопредельных государств 35
1.3 Заключение по обзору литературы 37
Собственные исследования 38
Глава 2 Объекты и методы исследования 38
2.1 Объекты исследования 38
2.2 Методы исследования 42
2.2.1 Химические и хроматографические методы 42
2.2.2 Физико-химические методы 42
2.2.3 Методы ресурсоведческого исследования 43
2.2.4 Метод фенологических наблюдений 45
2.2.5 Методы макро- и микроскопического анализа сырья 45
2.2.6 Фармакологические методы 46
2.2.7 Статистические методы 46
Глава 3 Сравнительный анализ нафтохинонов в образцах сырья некоторых представителей сем. бурачниковых 47
3.1 Качественный анализ нафтохинонов в образцах сырья 47
3.1.1 Цветная, гистохимическая реакции и микросублимация 47
3.1.2 Спектрофотометрическое определение 49
3.1.3 Хроматография в тонком слое сорбента 50
3.2 Количественное определение нафтохинонов в образцах сырья 52
3.3 Выделение нафтохинонов корней синяка русского и их изучение .54
3.3.1 Выбор оптимального экстрагента для извлечения нафтохинонов из корней синяка русского 54
3.3.2 Очистка и разделение нафтохинонов методом колоночной хроматографии 55
3.3.3 Изучение состава нафтохинонов синяка русского 56
3.3.4 Изучение антимикробной активности суммы нафтохинонов синяка русского 59
3.3.5 Выделение шиконина из корней синяка русского 61
3.4 Разработка и валидация методик количественного определения
нафтохинонов в корнях синяка русского 66
3.4.1 Использование метода математического планирования эксперимента для оптимизации процесса извлечения нафтохинонов 67
3.4.2 Разработка и валидация методики спектрофотометрического определения суммы нафтохинонов 69
3.4.3 Разработка и валидация методики количественного определения суммы нафтохинонов с помощью фотоколориметрии 73
3.5 Выводы по главе 78
Глава 4 Ресурсные и интродукционные исследования синяка русского 80
4.1 Ресурсные исследования синяка русского 80
4.1.1 Расчет урожайности корней синяка русского 80
4.1.2 Расчет величины запаса на конкретных зарослях и объемов ежегодных заготовок 83
4.2 Интродукционные исследования синяка русского 84
4.2.1 Место проведения работы 84
4.2.2 Изучение внешнего вида семян 85
4.2.3 Изучение лабораторной, полевой всхожести и глубины заделки семян семян 87
4.2.4 Определение густоты стояния растений, нормы посева и урожайности 89
4.2.5 Фенологические особенности развития синяка русского 90
4.3 Изучение динамики накопления нафтохинонов по фазам вегетации 95
4.4 Выводы по главе 99
Глава 5 Установление морфолого-анатомических диагностических признаков и норм качества корней синяка русского 101
5.1 Макроскопический анализ сырья 101
5.2 Микроскопический анализ сырья 103
5.3 Определение числовых показателей 109
5.3.1 Определение содержания влаги и золы в корнях синяка русского 109
5.3.2 Определение тяжёлых металлов в корнях синяка русского 110
5.3.3 Определение микробиологической чистоты корней синяка русского 111
5.3.4 Определение удельного радиационного фона в корнях синяка русского 112
5.4 Стандартизация корней синяка русского 113
5.5 Выводы по главе 116
Глава 6 Разработка и исследование лекарственных форм, содержащих сумму нафтохинонов 117
6.1 Разработка технологии масляного экстракта 117
6.2 Оценка качества масляного экстракта 119
6.3 Разработка технологии мази с экстрактом корней синяка русского, её биофармацевтические исследования 120
6.3.1 Выбор состава мази 121
6.3.2 Определение термостабильности разработанных лекарственных форм 123
6.3.3 Технологическая схема производства мази 123
6.4 Оценка качества мази с масляным экстрактом корней синяка русского 125
6.5 Изучение фармакологической активности разработанных лекарственных форм 127
6.5.1 Определение антимикробного действия масляного экстракта корней синяка русского и мази, его содержащей 127
6.5.2 Изучение ранозаживляющей активности масляного экстракта корней синяка русского и мази, его содержащей 131
6.6 Выводы по главе 137
Общие выводы 138
Список литературы
- Классификация, строение и физические свойства хинонов
- Химические и хроматографические методы
- Выделение нафтохинонов корней синяка русского и их изучение
- Расчет величины запаса на конкретных зарослях и объемов ежегодных заготовок
Введение к работе
Актуальность темы
Во многих странах мира в XX веке возрос интерес исследователей к хиноидным пигментам. К этому классу природных биологически активных соединений относятся и нафтохиноны, которые вырабатываются бактериями, грибами, морскими иглокожими, лишайниками и растениями. В настоящее время они обнаружены более чем в 20 семействах цветковых растений, в том числе Juglandaceae, Plumbaginaceae, Boraginaceae, Urticaceac, Droseraceae и др. Сырьё, содержащее нафтохиноны, широко используется в традиционной медицине Китая, Тибета, Кореи и Японии для получения жаропонижающих, противоожоговых, ранозаживляющих, противоопухолевых лекарственных средств. Из корней дальневосточного вида воробейника краснокорневого (Lithospermum erythrorhizon Siebold et Zucc.) сем. бурачниковых (Boraginaceae) был выделен нафтохинон шиконин, который проявил себя как эффективный растительный антибиотик, оказывающий противоопухолевое, антибактериальное, противовирусное, амёбоцидное, противовоспалительное и регенерирующее действие.
Шиконин и его эфиры используются в традиционной и научной медицине многих стран, благодаря своему широкому спектру биологической активности. Однако лекарственных средств на его основе за рубежом очень мало, а в России вообще нет. Отечественная продукция, содержащая шиконин и его производные, ограничивается только косметическими или перевязочными средствами. Основная причина такого положения — недостаточная промышленная сырьевая база и отсутствие доступных методов стандартизации. Фармакогностические исследования воробейника краснокорневого, проводимые в 70-е годы XX в., показали бесперспективность заготовки сырья как от дикорастущих, так и от культивируемых образцов этого вида. Фотохимический анализ других представителей сем. бурачниковых выявил, что количество видов, содержащих шиконин достаточно велико. Однако поиск сырь-
евых источников шиконина был прекращён в 80-х годах XX в., уступив место биотехнологии. Широкие исследования в этой области, проводимые в Японии и России, позволили разработать способы промышленного получения шиконина, используемые в настоящее время. Несмотря на полученные положительные результаты, биотехнологический способ производства шиконина остаётся достаточно дорогостоящим из-за сложного технологического процесса и его высокой наукоёмкости.
Таким образом, расширение растительной сырьевой базы источников шиконина и его производных за счет изучения малоизученных видов сем. Во-raginaceae, произрастающих на Северном Кавказе, является актуальной проблемой.
Цель и задачи исследования
Цель настоящей работы - поиск нового перспективного сырьевого источника шиконина среди малоизученных видов сем. бурачниковых флоры Северного Кавказа, разработка методов стандартизации сырья и получение лекарственных средств на основе суммы нафтохинонов.
Для достижения этой цели необходимо решить следующие задачи:
Провести качественный и количественный анализ образцов сырья некоторых северокавказских видов сем. бурачниковых, выявить среди них наиболее перспективный сырьевой источник шиконина.
Определить оптимальные условия извлечения шиконина и его производных и разработать методики для стандартизации этого вида сырья.
Провести предварительные ресурсные и интродукционные исследования выбранного вида на территории Ставропольского края.
Изучить динамику накопления нафтохинонов в зависимости от фазы вегетации и установить оптимальные сроки заготовки сырья.
Определить основные морфолого-анатомические диагностические признаки и числовые показатели сырья выбранного вида.
Разработать проект фармакопейной статьи предприятия на сырьё предлагаемого вида.
Разработать технологию экстракта и мази, содержащих шиконин и его производные, а также методики, пригодные для стандартизации полученных лекарственных препаратов.
Провести предварительные фармакологические исследования разработанных лекарственных препаратов по выявлению специфической микробиологической и фармакологической активности.
Научная новизна исследования
На основании скрининговых фитохимических исследований некоторых видов сем. бурачниковых установлено, что шиконин и его производные содержатся только в корнях синяка русского, синяка обыкновенного, оносмы кавказской, воробейника краснокорневого. Сумма нафтохинонов в корнях различных видов колеблется от 0,1 до 1,9%. Наибольшее количество нафтохинонов накапливается в корнях синяка русского (1,9%). Методом. ТСХ установлено, что в корнях синяка русского наряду с описанным в литературе шиконином впервые идентифицированы ацетилшиконин, изобутирилшико-нин, Р-оксоизовалерилшиконин и дезоксишиконин.
Установлена локализация нафтохинонов в клетках феллодермы корней синяка русского, что позволяет определять специфику заготовки сырья. Впервые выявлены закономерности изменчивости содержания нафтохинонов в корнях синяка русского в зависимости от фазы вегетации, на основании чего установлены сроки заготовки этого вида сырья.
Определены оптимальные условия извлечения суммы нафтохинонов из корней синяка русского. Изучена возможность препаративного хроматогра-фического разделения нафтохинонов и разработан способ получения вещества-стандарта (ГСО шиконина), позволившего обосновать метод стандартизации сырья.
Разработана технология масляного экстракта корней синяка русского и мази, содержащей полученный экстракт.
Изучена антимикробная активность липофильного комплекса корней синяка русского и установлено, что минимальная ингибирующая концентра-
ция составляет в отношении к Staphylococcus aureus 6,25 мкг/мл, в отноше-нии Bacillus subtilis - 12,5 мкг/мл (посевная доза 10 КОЕ/мл). Установлено, что противоожоговое действие разработанных лекарственных препаратов более выражено при низких концентрациях суммы нафтохинонов, антимикробное - при высоких.
Практическая значимость работы и внедрение результатов в практику
Установлены характерные морфолого-анатомические диагностические признаки нового вида лекарственного растительного сырья (синяка русского корни), нормы его качества и разработаны методики определения в нём суммы нафтохинонов. Разработаны методики выделения шиконина из корней синяка русского и его качественного и количественного анализа. Разработаны проекты фармакопейных статей предприятия «Синяка русского корни» и «Шиконин. Государственный стандартный образец», которые приняты ЗАО «Вифитех» г. Москва (акты от 09.04.07). Установлена динамика накопления шиконина и его производных в зависимости от фаз вегетации, определены сроки заготовки корней синяка русского, которые отражены в «Инструкции по сбору и сушке корней синяка русского», утверждённой ООО НПО «Фи-тоЧ» г. Ставрополь (акт внедрения от 12.04.07). Разработана технология производства и методики стандартизации экстракта корней синяка русского масляного и мази, его содержащей, с рабочим названием «Эхион». Апробированы технология производства и методики анализа мази «Эхион» в условиях ЗАО «Центрально-Европейская фармацевтическая компания» г. Москва, о чём получены соответствующие акты от 16.11.06.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава (№ госрегистрации 01.200.112164).
Положения, выдвигаемые на защиту:
Результаты фитохимического скрининга по содержанию шиконина и его производных в некоторых видах сем. бурачниковых флоры Северного Кавказа.
Результаты экспериментальных исследований по разработке методик выделения и количественного определения суммы нафтохинонов в корнях синяка русского.
Способ получения стандартного образца шиконина, разработка методик его анализа с использованием различных физико-химических методов.
Результаты ресурсных и интродукционных исследований сырья синяка русского на территории Ставропольского края.
Результаты морфолого-анатомического диагностического изучения сырья синяка русского.
Результаты изучения состава и изменчивости содержания нафтохинонов корней синяка русского по фазам развития растения. .
Обоснование технологии масляного экстракта корней синяка русского и мази, его содержащей.
Результаты изучения антимикробной активности выделенного из корней синяка русского липофильного комплекса, содержащего сумму нафтохинонов, а также ранозаживляющего и антимикробного действия разработанных лекарственных средств.
Апробация работы и публикации
Основные положения диссертационной работы доложены на 60-й, 61-й и 62-й межрегиональных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2005-2007 гг.), IV научно-практической конференции молодых учёных и студентов Краснодарского края (Анапа, 2006 г.), научной конференции «Актуальные проблемы фармации» (Владикавказ, 2007 г.). По материалам диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 2 статьи - в журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации
Работа изложена на 155 страницах текста компьютерного набора и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, общих выводов, списка цитируемой литературы, включающего 154 источника, из которых 68 на иностранном языке, и приложения. Диссертация иллюстрирована 46 рисунками и 42 таблицами.
Классификация, строение и физические свойства хинонов
Хиноны - класс органических соединений, по своей структуре являющихся циклогексадиенонами, тесно связанный с фенолами, так как они легко образуются окислением последних (особенно двух- и трехатомных) и, в свою очередь, легко восстанавливаются до фенолов.
Основная хиноновая структура представляет собой ненасыщенный циклический дикетон, являющийся производным моноциклического или полициклического ароматического углеводорода. Так, простейшими примерами служат бензохиноны. Хиноны могут происходить от различных ароматических углеводородов и соответственно получают свои названия и порядок нумерации углеродных атомов от исходного углеводорода (рисунок 1). В природных хиноновых пигментах основной хиноновый скелет обычно содержит замещенные группы (наиболее часто метальные, гидрокси- и метоксигруп-пы). Фенольные гидроксогруппы могут быть гликозилированы (особенно у высших растений).
Классифицируются хиноны по двум структурным признакам: 1) ароматическому углеводороду, к которому они привязаны углеродным скелетом (бензохиноны, нафтохиноны, антрахиноны); 2) по взаимному положению карбонильных групп в молекуле (о-бензохиноны, п-бензохиноны, 1,4-нафтохиноны).
Мы придерживались классификации по первому признаку, так как такая система более точно отражает место нафтохинонов среди других классов хиноидных соединений.
Почти все природные хиноны представляют собой твёрдые вещества и легко кристаллизуются. Большинство из них хорошо растворимы в органических растворителях, тогда как гликозиды и некоторые карбоновые кислоты способны растворяться в воде. Хиноны, которые одновременно являются фенолами или карбоновыми кислотами, растворимы в щелочных водных растворах. Высшие полициклические хиноны ведут себя подобно полимерам и довольно трудно растворяются в водной или органической среде [8].
Хиноны встречаются в высших растениях, лишайниках, грибах, бактериях и беспозвоночных животных (особенно членистоногих и иглокожих), крайне редко их находят в минералах [61].
Нафтохиноны (около 150 соединений) обнаружены в 20 семействах высших растений, в том числе Juglandaceae, Plumbaginaceae, Boraginaceae, Ebenaceae, Droseraceae, Lythraceae, Rubiaceae Balsaminaceae, Steraliaceae и Ulmaceae [61]. 1,4-Нафтохиноны обнаруживают в различных тканях высших растений - в листьях, цветках, плодах, корнях, коре и древесине. Эти БАС обычно встречаются в восстановленной и гликозидированной форме. В процессе экстрагирования они часто окисляются и выделяются в виде окрашенных продуктов [8].
Из нафтохинонов в семействе Boraginaceae обнаружены только шико-нин (алканнин) и его эфиры.
Имеются сведения о том, что производные шиконина содержатся не только в органах представителей сем. Boraginaceae. Например, из окрашенных ствола и ветвей Jatropha glandulifera Roxb. (сем. Euphorbiaceae) был выделен 3,3-диметилакрилшиконин и небольшое количество ацетилшиконина [95].
Нафтохиноны обнаружены в подземных органах 34 видов из 16 родов сем. бурачниковых, произрастающих на территории Российской Федерации. Из них во флоре Кавказа встречаются 16 видов из 8 родов. Обобщённая информация о содержании нафтохинонов в различных органах видов сем. бурачниковых представлена в таблице 1. Причём данные по содержанию нафтохинонов дословно процитированы из литературных источников, на которые даётся ссылка.
Как следует из данных, представленных в таблице 1, в растениях сем. бурачниковых шиконин содержится чаще всего в виде ацильных производных, а также в свободном виде, локализуясь, как правило, в подземных органах, в некоторых случаях имеется более конкретное указание, что в коре корня. Только у трёх видов (Arnebia guttata, Lithospermum erythrorhizon, Lithospermum officinale) он найден как в подземных, так и в надземных органах.
Однако литературные данные не дают исчерпывающий ответ по содержанию шиконина и его эфиров в видах сем. бурачниковых. Например, приводятся данные о содержании нафтохинонов в сумме, без идентификации индивидуальных соединений. Часто сведения разных авторов противоречат друг другу. Что касается количественного содержания, то в большинстве случаев приводятся ориентировочные данные (например, «низкое содержание», «среднее содержание»), без указания конкретных значений. Так, из 34 видов (таблица 1), произрастающих на территории России, процентное содержание нафтохинонов приведено только для 15 видов.
Более подробно изучены только виды воробейника, для которых приведены достаточно полные данные по качественному и количественному содержанию шиконина и его производных по органам растений. Изученность других видов в этом отношении нельзя назвать удовлетворительной.
Химические и хроматографические методы
Из физико-химических методов, главным образом, использовали оптические методы: спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой области (СФ-46, СФ-56), фотоэлектроколориметрия (КФК-3-01).
Тареева Н.В. с соавторами предложила методику количественного определения шиконина и его производных в корнях, основанную на образовании синей окраски при взаимодействии шиконина с раствором натрия гидроксида с последующим измерением оптической плотности полученного раствора [70].
Указанная методика (модифицированная) заключается в следующем: около 0,5 г (точная навеска) измельчённых корней помещали в коническую колбу ёмкостью 100 мл, снабжали обратным холодильником, приливали. 15 мл диэтилового эфира и кипятили 15 мин на водяной бане. Извлечение фильтровали через вату в делительную воронку. Сырьё вновь заливали 15 мл диэтилового эфира и кипятили 15 мин. Эфирное извлечение фильтровали через ту же вату, присоединяя фильтрат к первому извлечению. Колбу и вату промывали дважды эфиром (по 10 мл). К эфирному экстракту в делительной воронке приливали 15 мл раствора натрия гидроксида 5% и встряхивали в течение 5 минут. После отстаивания водный слой сливали в мерную колбу ёмкостью 50 мл, жидкость в делительной воронке взбалтывали с новыми порциями раствора натрия гидроксида по 10 мл до прекращения окрашивания их в синий цвет. Объём раствора доводили раствором натрия гидроксида 5% до метки, перемешивали и измеряли оптическую плотность на фотометре КФК-3-01 в кювете с толщиной слоя 10 мм при 597 нм относительно раствора натрия гидроксида 5%. Параллельно измеряли оптическую плотность рабочего стандартного образца шиконина в растворе натрия гидроксида 5%. Содержание нафтохинонов в пересчёте на шиконин в сырье в % (X) вычисляли по формуле: где С - концентрация шиконина, найденная по калибровочному графику (в %); / — толщина кюветы (в см); W - содержание влаги (в %); а — навеска сырья (в г).
Методика спектрофотометрического количественного определения шиконина описана для анализа суспензионной культуры тканей Arnebia euchroma [9]. Эта методика также включает этап реэкстракции нафтохинонов щелочным раствором: к 5,0 г отфильтрованной культуры ткани с влажностью 95% приливали 100 мл этанола, смесь подкисляли до рН 2,0 раствором кислоты серной. Экстракцию проводили 2 ч при перемешивании. К отфильтрованному супернатанту прибавляли последовательно по 100 мл хлороформа и воды. Смесь интенсивно перемешивали 5 мин. Хлороформный слой отделяли и реэкстрагировали 20 мл 0,1 М раствора калия гидроксида при перемешивании. Водный слой отделяли, а хлороформный вновь экстрагировали 15 мл 0,1 М калия гидроксида. Объем объединенных водных растворов доводили до 500 мл 0,1 М раствором калия гидроксида, пробу анализировали в стеклянной кювете толщиной 10 мм на спектрофотометре при длине волны 614 нм. В качестве стандарта применяли раствор шиконина с известной концентрацией. Раствором сравнения служил ОД М раствор калия гидроксида.
Определение сырьевой базы синяка русского проводили в соответствии с методическими указаниями по изучению запасов дикорастущих лекарственных растений способом определения запасов на конкретных зарослях [33].
Способ определения запасов на конкретных зарослях предусматривает определение двух показателей: площади заросли и плотности запаса сырья (урожайность). Урожайность определяли методом модельных экземпляров. Площадь зарослей определяли, приравнивания её очертания к геометрической фигуре (прямоугольнику) и измеряя параметры (длину, ширину), необходимые для расчета площади. Измерения проводили шагами, из расчета 1 шаг равен 0,6 м.
Подсчёт численности экземпляров проводили на учётных площадках. Закладывали по 3 учетные площадки размером 25 м" на расстоянии 15м друг от друга. Возрастное состояние особей определяли, используя критерии возрастных состояний, выявленные при изучении фенологических характеристик синяка русского в условиях культуры. Определение массы подземной части 1 экземпляра проводили на каждой площадке на 50 особях. Особи других возрастных групп не анализировались.
Для определения массы модельного экземпляра выкапывали каждый третий экземпляр, встреченный по маршрутному ходу. Образцы сырья взвешивали с точностью до ± 5% в сыром и воздушно-сухом состоянии.
Выделение нафтохинонов корней синяка русского и их изучение
Количественное определение нафтохинонов в заготовленных образцах сырья мы проводили по модифицированной методике Н.В. Тареевой [70], подробно описанной в главе «Объекты и методы исследования» (раздел 2.2.2 с. 42).
Для построения градуировочного графика готовили серию разведений шиконина (выделен из корней синяка русского п. 3.3.3) в растворе натрия гидроксида 5%. Концентрация первоначального раствора составила 0,022%, концентрации разведений составляли 0,0165%; 0,011%; 0,00825%; 0,0055%; 0,002888%; 0,00275%). Оптическую плотность растворов измеряли на фотометре КФК-3-01 при длине волны 597 нм в кювете с толщиной рабочего слоя 1 см. По полученным данным строили график зависимости оптической плотности от концентрации шиконина (рисунок 9).
Рисунок 9 - Градуировочный график шиконина в растворе натрия гидроксида 5% При образовании слишком интенсивной окраски испытуемого раствора мы использовали десятикратное разведение. Результаты эксперимента представлены в таблице 5.
Как следует из данных, приведённых в таблице 5, содержание нафтохинонов в корнях выращенного в Ботаническом саду Пятигорской ГФА воробейника краснокорневого (0,35%) ниже, чем по данным литературы, приводимым для дикорастущих экземпляров (3,2%), но почти в 1,5 раза выше, чем при выращивании его в Московской области [35, 58]. Наиболее перспективным источником шиконина и его производных среди видов сем. бурачни ковых, произрастающих на Северном Кавказе, является синяк русский (1,67%), изучению которого посвящены наши дальнейшие исследования.
Шиконин и его эфиры хорошо растворимы в органических растворителях, растительных и минеральных маслах. Поэтому наиболее целесообразным методом их выделения из корней синяка русского мы сочли исчерпывающую экстракцию органическим растворителем в аппарате Сокслета.
Для подбора подходящего экстрагента мы определяли содержание экстрактивных веществ в корнях синяка русского по методике ГФ XI [11]. Количественное определение нафтохинонов в сумме экстрактивных веществ проводили по методике Н.В. Тареевой [70], подробно описанной в главе «Объекты и методы исследования» (раздел 2.2.2, стр. 42). Результаты эксперимента представлены в таблице 6.
Как следует из данных, приведённых в таблице 6, наибольшее количество экстрактивных веществ извлекается спиртом этиловым, а наименьшее — петролейным эфиром. Вместе с тем, наибольшая доля шиконина среди экстрактивных веществ наблюдается при экстрагировании хлороформом, наименьшая - спиртом этиловым. Таким образом, для выделения шиконина и его производных следует использовать хлороформ, так как этот растворитель наиболее полно экстрагирует нафтохиноны из корней синяка русского.
Очистка извлечений, содержащих нафтохиноны, основана на различной растворимости шиконина в кислой и щелочной среде. Извлечение из лекарственного растительного сырья, полученное экстракцией не смешивающимся с водой органическим растворителем, обрабатывают раствором натрия гидроксида 5-10%. Шиконин и его эфиры вступают в реакцию с натрия гидроксидом и переходят в водный слой, а основная масса сопутствующих веществ остаётся в органическом растворителе. Затем к водному раствору нафтохинонов добавляют кислоту для перевода в исходное состояние и органический растворитель.
Однако экстракция раствором натрия гидроксида не позволяет избавиться от некоторых примесей липофильного характера, обладающих сходными с шиконином и его эфирами свойствами. Поэтому мы сочли целесообразным провести очистку и разделение нафтохинонов методом колоночной хроматографии.
Хлороформный раствор суммы липофильных веществ корней синяка русского, полученный при экстракции в аппарате Сокслета до полного истощения сырья, пропускали через стеклянную колонку диаметром 2 см, заполненную силикагелем (10 г), элюентом служил хлороформ.
Расчет величины запаса на конкретных зарослях и объемов ежегодных заготовок
Так как спектр хлороформного извлечения из корней синяка русского при измерении оптической плотности в диапазоне 250-600 нм имеет четыре чётких характерных пика, мы сочли целесообразным разработать методику количественного определения нафтохинонов в корнях синяка русского, отличающуюся от известных методик отсутствием стадии дополнительной очистки.
Методика: аналитическую пробу корней синяка русского измельчали до частиц размером 1 мм. Около 0,2 г (точная навеска) сырья помещали в коническую колбу, приливали 10 мл хлороформа, присоединяли обратный холодильник, нагревали на водяной бане 15 мин. Извлечение фильтровали в мерную колбу объёмом 25 мл через воронку с бумажным фильтром. Экстракцию повторяли дважды. Колбу с сырьём, фильтр и воронку промывали хлороформом, извлечение доводили до метки тем же растворителем и перемешивали. 5 мл полученного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводили хлороформом до метки, перемешивали и измеряли оптическую плотность при длине волны 525 нм на спектрофотометре СФ-56 относительно хлороформа в кювете толщиной 1 см. Концентрацию шиконина определяли с использованием удельного показателя поглощения (, 2=230). Содержание нафтохинонов в пересчёте на шиконин в абсолютно сухом сырье в % (X) вычисляли по формуле: 230-а-/-5-(Ю0-»0 где А - оптическая плотность; а — навеска сырья; W - влажность сырья.
Для определения специфичности разработанной методики количественного анализа суммы шиконина и его производных в корнях синяка русского использовали хлороформные извлечения из измельчённого сырья на-тивные и после удаления из них нафтохинонов путём экстракции раствором натрия гидроксида 5%. В ходе эксперимента было доказано, что извлечения, не содержащие нафтохинонов, в области спектра от 250-600 нм максимумов поглощения не имеют, либо имеют оптическую плотность в пределах ошибки прибора.
Валидационную оценку методики проводили в соответствии с проектом ОФС «Валидация фармакопейных методов» по таким характеристикам как специфичность, линейность, правильность (точность), воспроизводимость.
Специфичность определяется при валидации методов идентификации лекарственных веществ, примесей, установления количественного содержания вещества, как в образце, так и в лекарственной форме. При анализе спектра поглощения шиконина, было установлено, что он имеет четыре чётких максимума в области 273, 492, 524 и 565 нм, согласующихся с литературными данными и соответствующих шиконину. Полос наложения, сдвигов и других максимумов поглощения зафиксировано не было, что говорит о достаточной специфичности методики.
Между случайными величинами обычно существует связь, при которой с изменением одной величины изменяется; другая. При анализе зависимости случайных величин друг от друга различают корреляцию (существует ли взаимосвязь между величинами и как она, сильна) и регрессию (какой вид имеет зависимость) [18, 85]. ,
Корреляционный анализ проводили, рассчитывая величины ковариа-ции Sxy, стандартные отклонения х и у (Sx и Sy) и коэффициент корреляции г, используя данные эксперимента, представленные в таблице 13. Таблица 13 - Исходные данные для определения зависимости оптической плотности от концентрации шиконина
Корреляция между величинами х и у признаётся только в том случае, когда коэффициент корреляции значимо отличается от нуля (-1 г +1). Как следует из данных, представленных в таблице 11, имеет место жёсткая положительная зависимость между концентрацией шиконина в хлороформном растворе и оптической плотностью данного раствора, измеренной при длине волны 525 нм.
При обработке экспериментальных данных находят уравнение приближённой регрессии. Замена точной математической связи между измеряе-, мыми величинами приближённой называют аппроксимацией. При этом предполагается, что погрешность измерения одной величины много меньше погрешности измерения другой. Для определения регрессии строили график зависимости оптической плотности от концентрации по данным, представленным в таблице 11. Аппроксимирующая кривая и величина достоверности аппроксимации R были определены при помощи Microsoft Excel и представлены на рисунке 17.
Полученные значения указывают на то, что данная зависимость вида у=Ьх+а имеет линейный характер.
Мерой линейности является величина достоверности аппроксимации (R ). Если величина достоверности аппроксимации близка единице, то совокупность пунктов можно описать прямой линией.
В нашем случае величина достоверности аппроксимации R 0,98, что позволяет использовать предложенную методику для количественного определения шиконина.
Для оценки точности метода были подготовлены пробы сырья величиной 80, 90, 100, ПО и 120% по отношению к декларированной величине в аналитическом методе (то есть навеска измельчённого сырья составляла 0,16; 0,18; 0,20; 0,22 и 0,24 г). Теоретическое содержание шиконина в отдельных пробах устанавливали на основании перерасчёта его средней величины (Х=1,42%) на миллиграммы. Подобным образом был произведен расчёт результатов, полученных во время анализа
