Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 7
1.1. Систематическое положение, степень химической изученности и применение в народной медицине растений рода альфредия .7
1.2. Характеристика ноотропных лекарственных средств, основные пути поиска новых препаратов синтетического и природного происхождения 11
Глава 2. Объект и методы исследования 33
2.1. Объект исследования 33
2.2. Методы исследований 34
Глава 3. Фнтохимическая характеристика основных групп биологически активных веществ и элементный состав надземной части альфредии поникшей 44
Глава 4. Способы получения и идентификация биологически активных веществ фармакологически активного экстракта альфредии поникшей и его фракций 49
Глава 5. Разработка нормативной документации на лекарственное растительное сырье и жидкий экстракт альфредии поникшей .73
5.1. Стандартизация травы альфредии поникшей 73
5.1.1. Определение морфолого-анатомических признаков травы альфредии поникшей 73
5.1.2. Разработка методик качественного обнаружения и количественного определения флавоноидов в траве альфредии поникшей 80
5.1.3. Определение динамики накопления флавоноидов в траве альфредии поникшей 92
5.1.4. Определение товароведческих показателей травы альфредии поникшей 93
5.2. Стандартизация жидкого экстракта альфредии поникшей 95
Выводы 103
Список литературы 105
Благодарности Приложение
- Характеристика ноотропных лекарственных средств, основные пути поиска новых препаратов синтетического и природного происхождения
- Способы получения и идентификация биологически активных веществ фармакологически активного экстракта альфредии поникшей и его фракций
- Разработка методик качественного обнаружения и количественного определения флавоноидов в траве альфредии поникшей
- Определение товароведческих показателей травы альфредии поникшей
Введение к работе
Актуальность темы. В структуре современного фармацевтического рынка неуклонно растет доля средств, разработанных на основе лекарственного растительного сырья. По данным Всемирной организации здравоохранения, около 80 % населения используют фитопрепараты для лечения и профилактики различных заболеваний. Широкий спектр их действия объясняется многокомпонентностью химического состава и мягким комплексным воздействием на организм (Лекарственные растения …, 2008; Theodoratou, 2007; Tin, 2007; Wang, 2007; Fang, 2008; Mariani, 2008; Tiwari, 2008; Yimin, 2008).
Ограниченный ассортимент ноотропных лекарственных средств синтетического происхождения, вызываемые ими побочные эффекты и широкое распространение невротических расстройств, диктует необходимость создания фитопрепаратов ноотропного действия из растений флоры России.
Альфредия поникшая (сем. Asteraceae) – многолетнее травянистое растение, произрастающее на территории Кузнецкого Алатау, Республики Горный Алтай и Алтайского края. Данное растение успешно культивируется на экспериментальной базе Сибирского ботанического сада Томского государственного университета. В народной медицине надземную часть альфредии используют в качестве противосудорожного и болеутоляющего средства, в сборах – при энурезе, неврастении, шизофрении.
Учитывая широкое применение растения народами Сибири при неврологических патологиях и малую степень его изученности, определены выбор объекта и цель наших исследований.
Цель работы. Фармакогностическая характеристика надземной части альфредии поникшей и разработка на ее основе экстракта, обладающего ноотропной активностью.
Для достижения поставленной цели исследования необходимо было решить следующие задачи:
1) определить основные группы биологически активных веществ надземной части дикорастущей и культивируемой альфредии поникшей;
2) разработать рациональный способ получения экстракта альфредии поникшей, изучив влияние основных факторов экстракции на выход биологически активных веществ;
3) изучить химический состав фармакологически активного экстракта и его фракций, установить строение выделенных индивидуальных соединений;
4) определить морфолого-анатомические диагностические признаки травы и разработать методики анализа для оценки критериев подлинности и количественного содержания действующих веществ в траве и жидком экстракте;
5) разработать нормативную документацию на лекарственное растительное сырье и жидкий экстракт альфредии поникшей.
Научная новизна. Установлены микроскопические диагностические признаки травы альфредии поникшей, заключающиеся в наличии простых многоклеточных тонкостенных и толстостенных, звезчато-лучистых и двухрядных волосков на эпидермисе листа, цветка и стебля.
Впервые определен химический состав биологически активных веществ, макро- и микроэлементов надземной части альфредии поникшей.
Разработан рациональный способ получения экстракта надземной части растения на этаноле, рекомендуемого в качестве ноотропного средства.
Впервые установлен химический состав фармакологически активного экстракта альфредии поникшей, выделены из активного экстракта флавоноиды (кверцетин, изокверцитрин, рутин), сумма тритерпеновых спиртов (- и -амирин, моретенол, лупеол), лигнан (арктиин) и органические кислоты (коричная, ванилиновая, хлорогеновая).
Разработаны методики качественного обнаружения хроматографией в тонком слое силикагеля и количественного определения методом дифференциальной спектрофотометрии флавоноидов (изокверцитрин), положенные в основу стандартизации травы и жидкого экстракта альфредии поникшей.
Практическая значимость. На основании данных фитохимического, фармакологического и товароведческого анализа разработаны проекты ФС «Альфредии поникшей трава» и «Альфредии поникшей экстракт жидкий». Разработаны методики определения подлинности и количественного содержания действующих веществ в траве и жидком экстракте альфредии поникшей.
Полученные результаты внедрены в учебный процесс кафедры биологической химии с курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии, кафедры биологии с экологией и курсом фармакогнозии Красноярского государственного медицинского университета им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого, кафедры фармации Омской государственной медицинской академии, кафедры геоэкологии и геохимии Национального исследовательского Томского политехнического университета.
Положения, выносимые на защиту:
-
Химический состав надземной части дикорастущей и культивируемой альфредии поникшей представлен простыми фенолами, флавоноидами, кумаринами, органическими кислотами, лигнанами, стеринами, тритерпеновыми соединениями, каротиноидами, полисахаридами, аминокислотами, макро- и микроэлементами.
-
Рациональный способ получения экстракта альфредии поникшей на 70 % этаноле, из которого выделены лигнаны (арктиин), флавоноиды (кверцетин, изокверцитрин, рутин), органические кислоты (коричная, ванилиновая и хлорогеновая) и тритерпеновые спирты (-амирин, -амирин, моретенол, лупеол).
-
Микроскопические диагностические признаки сырья альфредии поникшей, заключаются в наличии различных типов волосков на эпидермисе листа, стебля и цветка.
-
Методики качественного обнаружения флавоноидов (изокверцитрина) в траве и жидком экстракте растения методом хроматографии в тонком слое силикагеля и количественного определения методом дифференциальной спектрофотометрии по реакции с алюминия хлоридом в видимой области спектра.
Апробация работы и публикации: Основные положения работы доложены и обсуждены на IV Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, 2006), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Л.Н. Березнеговской (Томск, 2006), III и IV Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2007, 2009), VIII Международном конгрессе молодых ученых «Науки о человеке» (Томск, 2007), VI Всероссийском научном семинаре с молодежной научной школой «Химия и медицина» (Уфа, 2007), II Международной научной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» (Алматы, Казахстан, 2007), V Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2008), ежегодной конференции «Фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2009), конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2009).
Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 18 научных работах, из них 4 – в периодических изданиях, рекомендованных ВАК МО и науки РФ, 3 патента РФ на изобретение.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 127 страницах машинописного текста, содержит 37 таблиц, 18 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, 3 глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 203 источника, из которых 50 – зарубежные, и приложения.
Характеристика ноотропных лекарственных средств, основные пути поиска новых препаратов синтетического и природного происхождения
В 1972 году в исследовательской лаборатории фирмы UCB (Бельгия), являющейся одной из крупнейших фармацевтических фирм Западной Европы, Giurgea и сотрудники установили, что под влиянием пирацетама облегчаются процессы обучения, улучшается память. При этом действие пирацетама не сопровождается побочными эффектами, характерными для психостимулирующих средств: двигательное и речевое возбуждение, истощение функциональных возможностей организма, привыкание и пристрастие. Результаты этих исследований привели к созданию нового класса веществ - класса ноотропов [174].
Ноотропы (от "noos" — мышление, разум; "tropos" — стремление, сродство), по определению Giurgea (1982), —это вещества, способные активировать интегративную деятельность мозга, оказывать стимулирующие влияние на обучение, улучшать память и умственную деятельность, особенно при их нарушении, а также повышать жизнедеятельность мозга и устойчивость организма к воздействию повреждающих факторов (гипоксия, интоксикация, травма, стресс и др.) [33, 46, 57].
Классификация веществ с ноотропным действием Современная классификация ноотропных препаратов, предложенная Т. А. Ворониной и С. Б. Середениным (2007), основана на представлениях о механизмах действия веществ и учитывает их химическое строение. 1. Ноотропные препараты — активаторы метаболизма мозга и белково-нуклеинового синтеза 1.1. Производные пирролидона (рацетамы): пнрацетам, дипрацетам, ролзирацетам, оксирацетам, этирацетам, фенотропил, анирацетам, прамирацетам, небрацетам, изацетам, нефирацетам, детирацетам и др. 1.2. Вещества природного происхождения и близкие к ним: церебролизин, аналоги церебролизина№РЕР-12 и Е021, актовегин, церебрал, липоцеребрин, цереброкурин, кортексин, пиритинол, пиявит, пантогематоген, полидан и др. 2. Ноотропные препараты, реализующие действие через нейромедиаторные системы 2.1. Холинэргические вещества, 2.1.1. Вещества, вызывающие усиление синтеза ацетилхолина и его выброса: холин хлорид, фосфотидилсерин, лецитин, ацетил-Ь-карнитин, МКС-231, ююбеттропщ, тиоперамин GT-2016, иодопроксифан, UCL-1390, AQ-0145, 2К9346-бетакарболин, линопирдин (DUP 996) и др. 2.1.2. Ингибиторы ацетилхолинстеразы: физостигмин, такрин, галантамин, донепезил, ривастигмин, амиридин, нейромедин, метрифонат, велнакрина малеат, эртастигмин, зифросинол, минаприн, капроктамин, гаперзин А, фенсерин и др. 2.1.3. Агонисты jw-холинергических рецепторов: оксотреморин, бетанехол, ксаномелин, меламелин, сабкомелин, AF102B, цевимелин, алвамелин, УМ-796, AF151, талсаклидин (WAL2014FU), SCH-57790, SCH-72788 и др. 2.1.4. Агонисты w-холинергических рецепторов: АВТ098, АВТ089, АВТ418, ТС1734, МЕМ3453, Sffi-1553A, SSR180711, GTS21, эпибатид, анабазин и др. 2.2. Вещества, влияющие на систему возбуждающих аминокислот: глутаминовая кислота, глицин, нооглютил, Д-циклосерин, мемантин, мелацемид, ампалекс, унифнрам, сушіфирам, 4-аминопиперидины, димебон, СР101606,ЫР81506идр. 2.3. Вещества, влияющие на систему ГАМК: гаммалон, пантогам, пикамилон, щжотинамид, фенибут, натрия, лития и кальция оксибутират (нейробутал), габапентин, PCALC36, SB737552, NS105 и др. 2.4. Вещества, влияющие на серотонинергическую систему: антагонист 5НТ6 рецепторов SB742457, частичный агонист 5НТ4 рецепторов SL650155, агонисты 5-НТ1А рецепторов - халипроден, 8-OH-DPAT и др., антагонисты 5 НТЗ рецепторов - ондансетрон и мирисетрон. 2.5. Вещества, влияющие на дофаминергическую систему и ингибиторы МАО: пирибедил, сумаринол, ВР897 и АВТ431, NS2330, лазабемид, селегилин, расагилин и др. 2.6. Вещества, влияющие на аденозиновую систему, фосфодиэстеразу: кофеин, пропентофиллин, ролипрам, МЕМ1414, НТ0712 и др. 2.7. Вещества, влияющие на гистаминовую систему: А349821 и др. 2.8. Вещества, влияющие на каннабиноидную систему. 3. Нейропептиды и их аналоги: АКТГ 1 - 10 и его фрагменты, соматостатин, вазопрессин, тиролиберин и их аналоги (NC1900, FK960 и др.), ангиотензин-Н, субстанция Р, эбиратид, семакс, ноопент, нейропептид Y, холецистокинин-8, ингибиторы пролилэндопептидазы (JTP-4819, S17092, ЗП 20, ЗП-22 и др.), беглимин и др. 4. Неиростеронды и мелатонші: 7-р-зстрадіюл, эстрадерм, J811, J861, дегидроэпиандростерон (DHEA) и его сульфат (DHEAS), карбеноксолон, мелатонин. 5. Антиокспданты: мексидол, дибунол, фосфотидилсерин, пиритинол, меклофеноксат, атеровит, эксифон, цитидиндифосфохолин, тирилазад месилат, а-токоферол, гинкго билоба и др. 6. Антогонисты кальция: нимодипин, циннаризин, флунаризин, ыивалдипин и др. 7. Церебральные вазодшттаторы: винкамин, ницерголин, винпоцетин, винконат, гидергин, виндебунол, нафтидрофурил и др. 8. Вещества, влияющие на протеинкиназы: этимизол, СЕР 1347, А8601245идр. 9. Витамины и их аналоги, пищевые добавки, вещества растительного происхождения: витамины Е, В6, В\2, фолаты, тиамин, лецитин (фосфотидилхолин), фосфотидилсерин, а-липоевая кислота, L-карнитин, ацетил-Ь-карнитин, гинкго билоба, женьшень, лимонник и др. 10. Вещества, влияющие на нейротрофиновую систему: прямые (фрагменты NGF92 в р-поворотной конформации, сурамин), и непрямые (аналоги аденозина) активаторы Тгк рецепторов; вещества, влияющие на экспрессию и секрецию нейротрофинов (неотрофит, семакс, идебенон, агонисты и позитивные модуляторы АМРА-рецепторов); модуляторы нейротрофиновой системы (церебролюин, СЕР-1347, NDD-094). 11. Вещества, влияющие на процесс нейродегенерации при болезни Альцгеймера: вещества, уменьшающие синтез и влияющие на агрегацию, деагрегацию и депонирование р-амшюида и производящие «очистку» амилоидных бляшек, хелатирующие металлы, вещества, уменьшающие гиперфосфорилирование белка тау и блокаду тау-агрегацина, увеличивающие уровень шаперонов, противовоспалительные средства, статины и др.
Способы получения и идентификация биологически активных веществ фармакологически активного экстракта альфредии поникшей и его фракций
Выделение фенольных и тритерпеновых соединений из хлороформной фракции осуществляли методом адсорбционной колоночной хроматографии на силикагеле (L 100/250 Lachema). Для этого 20 г хлороформной фракции вносили в колонку с сорбентом в соотношении 1:10 (диаметр — 5,5 см, высота - 72 см). Элюирование осуществляли последовательно хлороформом, смесью хлороформ-этанол (с увеличением градиента гидрофильности, 98:2— 80:20) и этанолом. Фракции собирали по 250 мл и упаривали досуха. Контроль за разделением суммарной фракции осуществляли методом хроматографии в тонком слое силикагеля в системах растворителей I, V, VI, IX, используя для обнаружения фенольных соединений фильтрованный УФ - свет, раствор гидроксида калия, диазореактив и ванилин-фосфорный реактив; для тритерпеновых соединений и стеринов — ванилин-фосфорный реактив. Фракции с аналогичной хроматографической картиной объединяли. При элюировании хлороформом получили фракцию жирного масла, а далее фракции, содержащие по хроматографическим данным, вещества тритерпеновой и стериновой природы. С помощью хроматографии в тонком слое силикагеля и на бумаге во фракции, элюированной в последующем хлороформом, идентифицировали ванилиновую и коричную кислоту. При элюировании смесью хлороформ-этанол 93:7—90:10 получили фракцию, в которой согласно хроматографии в тонком слое и на бумаге, доминируют вещества фенольной природы.
Во фракции, составляющей 30 % от массы хлороформной фракции и элюированной хлороформом, согласно хроматографическим данным, обнаружили не менее шести веществ тритерпеновой и стериновой природы. Для ее разделения использовали рехроматографию: 6 г фракции вносили в колонку (диаметр - 3 см, высота - 70 см) с силикагелем (L 100/250 Lachema) в соотношении 1:20, элюируя гексаном, смесью гексан-ацетон в различных соотношениях (98:2— 90:10) и ацетоном. Фракции собирали по 150 мл. При промывании колонки смесью гексан-ацетон 98:2 получили однородную по хроматографии в тонком слое смесь веществ 1-4. Во фракции, полученной системой гексан-ацетон 95:5, по хроматографической подвижности в тонком слое силикагеля в сравнении с достоверным образцом выявили наличие 0-ситостерина.
При элюировании смесью хлороформ-этанол 93:7-90:10 получена фракция, содержащая, по хроматографическим данным, не менее шести фенольных соединений. С целью очистки от примеси тритерпеновых и стериновых соединений 3,8 г указанной фракции предварительно обрабатывали ацетоном. При этом после декантации получили осадок (0,8 г или 4 % от массы хлороформной фракции), содержащий тритерпеновые и стериновые соединения, и ацетоновый раствор, который упаривали (3 г или 15 % от массы хлороформной фракции) и подвергали рехроматографии. Для этого 3 г полученной фракции вносили в колонку (диаметр — 2 см, высота -72 см) с силикагелем (L 40/100 Lachema) в соотношении 1:25, элюируя хлороформом, смесью хлороформ-ацетон в различных соотношениях (98:2— 50:50) и ацетоном. Фракции собирали по 100 мл. При промывании колонки смесью хлороформ-ацетон 6:4 с последующим противоточным распределением в системе растворителей хлороформ-метанол-вода (5:6:4) из нижней фазы получили индивидуальное вещество 5 - доминирующее во фракции.
Смесь веществ 1-4 — белый мелкокристаллический порошок, т. пл. 160-161С (этанол), растворим в гексане, хлороформе, не растворим в этаноле, метаноле и воде. УФ-спектр (C6HU), Хт , нм: 210, (220). ИК-спектр (КВг), vmax, см"1: 1043, 1072, 1085, 1110, 1138 (ОН), 1189, 1217, 1253, 1273, 1298, 1360, 1381, 1454, 1463 (СН3, СН2, СН), 1641 (С=С), 2660, 2725 (ОН), 2872, 2962 (СНз, СН2, СН), 3387, 3614 (ОН). Выход - 1,6 г. На пластинке «Silufol UV-254» в системах растворителей V и VII имеет одно пятно красно-фиолетового цвета с Rf 0,70 и 0,45 соответственно.
Разделение указанной смеси явилось сложной экспериментальной задачей, поэтому для исследования применяли метод хромато-масс-спектрометрии (ГХ/МС). В результате во фракции идентифицировали р-амирин (олеан-12-ен-З-ол, 27,48 %, tr 53,58 мин), а-амирин (урс-12-ен-З-ол, 27,52 %, tr 57,72 мин), моретенол (гоп-22(29)-ен-Зр-ол, 25,52 %, tr 66,11 мин) и лупеол (луп-22(29)-ен-Зр-ол, 19,48 %, tr 66,96 мин).
Вещество 5 - белый порошок, 86 С (газообразные выделения), 250 С (с разложением), растворим в метаноле, этаноле, ацетоне, хлороформе, не растворим в воде. УФ-спектр, А ах, нм: 224, 255, 274, 299. ИК-спектр (КВг), vmax, см"1: 1026, 1074, 1140, 1157, 1194 (ОН), 1235, 1264 (=С-0-С), 1332, 1349, 1383, 1421, 1453, 1464 (СН3, СН2, СН), 1515, 1592, 1606 (С=С), 1766 ( о w), 2598, 2839, 2866 (ОСН3), 2921, 3014, 3419 (ОН). Выход - ОД г. На пластинке «Сорбфил ПТСХ-П-А» в системах растворителей хлороформ-этанол 8:1 и эти л ацетат-этанол 8:1 имеет одно пятно темно-серого цвета с Rf 0,11 и 0,23 соответственно.
ЯМР спектр 13С содержит 27 сигналов, их которых шесть четвертичных и шесть третичных ароматических, шесть принадлежат молекуле глюкозы (табл. 9). В молекуле содержится также алифатический компонент, состоящий из шести углеродных атомов. Три из них принадлежат метиленовым группам, одна из которых является карбинольной. В алифатический фрагмент входит также карбонильная группа и два третичных углеродных атома. Кроме того, в соединении присутствуют три метоксильные группы.
Химический сдвиг карбонильной группы 178,7 м.д. и полоса поглощения в ИК-спектре 1766 см" предполагает наличие у-лактонного фрагмента. Анализ одно- и двумерных спектров ЯМР показал, что в веществе содержатся несвязанные между собой два тризамещенных ароматических кольца.
Разработка методик качественного обнаружения и количественного определения флавоноидов в траве альфредии поникшей
Содержание флавоноидов и экстрактивных веществ устанавливали извлечением их из измельченной травы альфредии поникшей 70 % этанолом, учитывая наибольшую фармакологическую активность данного экстракта. Содержание флавоноидов колебалось в пределах от 0,58 до 1 %, содержание экстрактивных веществ, извлекаемых 70 % этанолом - от 15,41 до 21,15 %. Учитывая возможность варьирования данных показателей в зависимости от места и года сбора образца, целесообразным явилось установить следующие нормы: содержание флавоноидов — не менее 0,5 %, экстрактивных веществ, извлекаемых 70 % этанолом, не менее 14 % (табл. 30).
Сушку сырья рекомендуется проводить в хорошо проветриваемых помещениях. Влажность воздушно-сухого сырья колебалась в пределах от 8,33 до 11,67 %, поэтому предлагаем установить норму по данному показателю не более 13 % (табл. 30).
Содержание золы общей и золы, нерастворимой в 10 % растворе хлористоводородной кислоты, колебалось от 5,63 до 10,00% и от 0,15 до 0,19% соответственно. Исходя из полученных результатов, предлагаем установить пределы указанных показателей не более 13 % и не более 1 % соответственно (табл. 30).
Принимая во внимание морфологические особенности растения, в проект ФС заложен показатель толщины стебля. Норму для этого показателя предлагаем установить не более 20 мм (табл. 30).
Содержание органической (части других растений) и минеральной примеси колебалось от 0 до 0,71 % и от 0 до 0,41 % соответственно. Предлагаем ограничить предел этих примесей не более 1,5 % и не более 1 % соответственно (табл. 30).
Данные ситового анализа показали, что наибольшая часть измельченного сырья проходит сквозь сито с диаметром отверстий 1-5 мм, что соответствует необходимой степени измельчения, обеспечивающей наиболее полное извлечение БАВ. Поэтому предлагаем ограничить следующие пределы: по показателю для измельченного сырья «содержание частиц, не проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 7 мм» не более 10 %, «содержание частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 0,25 мм» не более 10 % (табл. 30). Хранение. В сухом, защищенном от света месте. Для установления срока годности травы альфредии поникшей средние пробы от семи партий сырья упаковывали в бумажные пакеты и хранили в темных сухих помещениях при температуре от +24 С до -24 С. Через каждые 6 месяцев проводили количественное определение действующих веществ (флавоноидов) и товароведческих показателей. Исследуемые образцы сохранили доброкачественность за весь период хранения. На основании полученных данных (табл. 24) сделали заключение о возможности хранения сырья в течение двух с половиной лет (время наблюдения). 5.2. Стандартизация жидкого экстракта альфредии поникшей Жидкий экстракт альфредии поникшей получали методом противоточной экстракции (реперколяция в модификации по Н. А. Чулкову) в батарее из пяти перколяторов в соотношении растительное сырье — экстракт 1:1 [83] с использованием 70 % спирта этилового в качестве экстрагента. Выбор данного метода обусловлен его широким применением в фармацевтической промышленности, в отличие от метода с использованием нагревания. Жидкий экстракт альфредии поникший представляет собой жидкость темно-коричневого цвета с зеленоватым оттенком со специфическим запахом горько-кислого вкуса. При разработке методик качественного обнаружения и количественного определения действующих веществ в жидком экстракте альфредии поникшей учитывали принцип унификации методик в ряду: сырье-лекарственная форма, поэтому объем жидкого экстракта для анализа составляет 1 мл, что соответствует 1 г травы альфредии поникшей. Определение наличия флавоноидов (изокверцитрин) в жидком экстракте альфредии проводили методом хроматографии в тонком слое. Методика. На линию старта хроматографической пластинки «Сорбфил ПТСХ-П-А» размером 10x5 см в виде точки наносят 0,02 мл жидкого экстракта. Пластинку сушат при комнатной температуре в течение 5 мин, затем помещают в камеру со смесью растворителей этилацетат-муравьиная кислота-вода 8:1:1 и хроматографируют восходящим методом. Когда фронт растворителей пройдет до конца пластинки, пластинку вынимают из камеры, сушат при комнатной температуре в течение 5 мин и просматривают в УФ-свете при длине волны 360 нм. На хроматограмме должна обнаруживаться зона адсорбции темно-желтого цвета с Rf около 0,50 (изокверцитрин). Затем хроматограмму опрыскивают 5 % раствором алюминия хлорида в 70 % спирте этиловом и нагревают в сушильном шкафу 5-10 мин при температуре 100-105 С. При этом указанная зона должна приобретать ярко-желтый цвет в видимом и УФ-свете при длине волны 360 нм. На хроматограмме испытуемого раствора, кроме основной зоны адсорбции, допускается наличие дополнительных зон адсорбции, в том числе желтого цвета с Rf около 0,30 и 0,90 (рутин и кверцетин соответственно), зеленого цвета с Rf около 0,70 и 0,80 (хлорогеновая и кофейная кислоты соответственно). Количественное определение флавоноидов осуществляли методом дифференциальной спектрофотометрии, используя реакцию образования комплекса флавоноидов с раствором алюминия хлорида. Методика. 1 мл жидкого экстракта помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора до метки 70 % спиртом этиловым (раствор А). В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 6 мл раствора А, прибавляют 18 мл 10 % раствора алюминия хлорида в 70 % спирте этиловом, доводят объем раствора до метки и перемешивают (раствор Б). Измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 410±2 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя в качестве раствора сравнения следующий: в мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 6 мл раствора А и доводят до метки 70 % спиртом этиловым.
Определение товароведческих показателей травы альфредии поникшей
В ходе эксперимента установлено, что в разработанной методике величина относительного стандартного отклонения менее 1 %, что характеризует надежность анализа в выбранных условиях. Для определения точности методики проанализировали 9 образцов жидкого экстракга на 3 уровнях концентраций в пределах аналитической области. Для оценки полученных результатов использовали открываемость (R). В результате получены 9 значений открываемости, для которых вычисляли величину стандартного отклонения (SD) и относительного стандартного отклонения (RSD) (табл. 35). Полученные результаты показывают, что разработанная методика обеспечивает необходимую точность полученных результатов, что предполагает ее использование в качестве оптимальной для количественного определения флавоноидов в жидком экстракте альфредии поникшей. Содержание флавоноидов в образцах жидкого экстракта альфредии изменялось в пределах от 0,69 до 0,76 % (табл. 36), поэтому целесообразным явилось нормировать показатель не менее 0,5 % (табл. 37). Содержание спирта в жидком экстракте колебалось от 59,5 до 64,6 %, поэтому предлагаем установить норму по показателю не менее 57 %. Сухой остаток жидкого экстракта варьирует в пределах от 7,2 до 7,5 %. Исходя из полученных результатов, предлагаем ограничить содержание сухого остатка для экстракта не менее 6 %. Содержание тяжелых металлов в образцах экстракта составляло не более 0,01 %, поэтому предлагаем ограничить предел содержания тяжелых металлов не более 0,01 %. Хранение. В прохладном, защищенном от света месте. Для установления срока годности жидкого экстракта альфредии, пробы от трех серий хранили в стеклянных флаконах темного стекла, укупоренных полиэтиленовыми и, сверху, пластмассовыми пробками, при температуре от +5С до +25С. Через каждые 6 месяцев проводили количественное определение действующих веществ (флавоноидов) и других показателей качества. Исследуемые образцы сохранили доброкачественность за весь период хранения. На основашш получегшых данных (табл. 36) сделали заключение о возможности хранения экстракта жидкого в течение трех лет (время наблюдения). В процессе хранения жидкого экстракта возможно выпадения осадка. 1. В результате исследования анатомического строения травы альфредии поникшей установлено, что микроскопическими диагностическими признаками цельного и измельченного сырья является наличие различных типов волосков. На эпидермисе листа расположены тонкостенные и толстостенные волоски с продольной складчатостью и простые волоски с многоклеточным основанием. Простые многоклеточные и звездчато-лучистые волоски следует отнести к диагностическим признакам цветка. На эпидермисе стебля встречаются многоклеточные волоски с неравномерными утолщениями и двухрядные волоски. 2. Разработаны методики качественного обнаружения действующих веществ (флавоноидов) в траве и жидком экстракте альфредии поникшей методом хроматографии в тонком слое силикагеля. 3. Метод дифференциальной спектрофотометрии с использованием реакции комплексообразования с алюминия хлоридом положен в основу разработанной методики количественного определения флавоноидов, в пересчете на изокверцитрин, в траве и жидком экстракте растения. 3. Определены нормы показателей качества сырья и жидкого экстракта растения, полаженные в основу разработанных проектов ФС «Альфредии поникшей трава» и «Альфредии поникшей экстракт жидкий». 4. Исследования динамики накопления флавоноидов в траве альфредии поникшей по фазам развития показало, что наибольшее количество действующих веществ накапливается в период цветения, поэтому заготовку сырья следует осуществлять в указанную фазу развития. По результатам исследования органов растения установлено, что максимальное количество флавоноидов содержится в цветках альфредии поникшей. 1. Определены морфологические и микроскопические диагностические признаки травы альфредии поникшей. Диагностическое значение для цельного сырья имеет форма, окраска и опушение листьев и стеблей, а также строение корзинок. Микроскопические диагностические признаки заключаются в наличии различных типов волосков на эпидермисе листа, стебля и цветка. 2. Установлен химический состав надземной части альфредии поникшей, представленный простыми фенолами, флавоноидами, лигнанами, фенолкарбоновыми кислотами, гидроксикумаринами, дубильными веществами, стеринами, тритерпеновыми соединениями, полисахаридами, аминокислотами, каротиноидами, макро- и микроэлементами; выявлено, что надземные части дикорастущей и культивируемой альфредии поникшей имеют сопоставимый по содержанию химический состав. 3. Разработан рациональный способ получения экстракта альфредии поникшей на 70 % этаноле, рекомендуемого в качестве ноотропного средства, заключающийся в использовании соотношения сырье-экстрагент 1:20-1:25, температуры 80 С и степени измельчения сырья - 2 мм в течение 90 мин.
В экстракте альфредии поникшей на 70 % этаноле установлено наличие тритерпеновых спиртов (а- и р-амирин, моретенол, лупеол), лигнанов (арктиин), флавоноидов (кверцетин, изокверцитрин, рутин), органических кислот (ванилиновая, коричная, хлорогеновая), а также аминокислот, макро- и микроэлементов.
