Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы : 14
1.1. Ботаническая характеристика крапивы двудомной и жгучей 14
1.1.1. Крапива двудомная (Urtica dioicaL.) 14
1.1.2. Крапива жгучая (Urtica urens L.) 15
1.2. Химический состав растений рода крапива 16
1.2.1. Химической состав крапивы двудомной 16
1.2.2. Химический состав крапивы жгучей 19
1.3. Применение растений рода крапивы 19
1.3.1. Фармакологические свойства и применение крапивы двудомной 19
1.3.2. Фармакологические свойства и применение крапивы жгучей 29
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 32
2.1. Характеристика объектов исследования 32
2.2. Методы исследования 32
2.2.1. Определение подлинности сырья и числовых показателей ... 33
2.2.2. Фитохимические методы исследования 33
2.2.3. Исследование морфолого-анатомического строения травы крапивы жгучей и корневищ и корней крапивы двудомной... 36
2.2.4. Фармакологические методы исследования 37
ГЛАВА 3. Исследования показателей, нормирующих качество сырья растений рода крапива 39
3.1. Морфолого-диагностические признаки травы крапивы жгучей, подземных органов крапивы двудомной 39
3.1.1 Морфолого-диагностические признаки травы крапивы жгучей 39
3.1.1.1. Внешние признаки 39
3.1.1.2. Микроскопические признаки 40
3.1.2. Морфолого-диагностические признаки корневищ и корней крапивы двудомной 44
3.1.2.1. Внешние признаки 44
3.1.2.2. Микроскопические признаки 44
3.2. Разработка показателей качества сырья крапивы двудомной и крапивы жгучей 46
3.2.1. Определение влажности 46
3.2.2. Определение содержания золы общей и золы, нерастворимой в І0% растворе хлористоводородной кислоты 47
3.2.3. Определение содержания примесей и измельченности 49
3.2.4. Определение коэффициента водопоглощения 49
3.2.5. Определение содержания экстрактивных веществ 51
3.2.6. Определение сроков хранения сырья 52
ГЛАВА 4 Исследование качественного состава и количественного содержания основных групп биологически активных веществ сырья растений рода крапива 54
4.1. Извлечение и фракционирование природных соединений 54
4.2. Изучение углеводного состава 55
4.2.1. Качественное определение углеводов 55
4.2.2. Количественное определение углеводов (ВПСК, РГ) 58
4.2.3. Изучение химического состава ВПСК и РГ 60
4.3. Определение органических кислот 64
4.3.1. Качественное определение органических кислот 64
4.3.2. Количественное определение органических кислот 67
4.4. Анализ элементного состава 73
4.5. Определение фенольных соединений 74
4.5.1. Определение фенольных соединений методом 74 высокоэффективной жидкостной хроматографии
4.5.2. Качественное определение дубильных веществ 77
4.5.3. Качественное определение фенолкарбоновых кислот 79
4.5.4. Качественное определение кумаринов 81
4.5.5. Качественное определение флавоноидов 83
4.5.6. Количественное определение дубильных веществ 86
4.5.7. Количественное определение флавоноидов 90
4.6. Определение пигментов (каротиноидов и хлорофиллов) 100
4.6.1. Качественное определение пигментов 100
4.6.2. Количественное определение пигментов 102
4.7. Определение тритерпеноидов 107
4.7.1. Качественное определение тритерпеноидов 107
4.7.2. Количественное определение тритерпеноидов 108
4.8. Определение витамина Ki 112
4.8.1. Качественное определение витамина К і 112
4.8.2. Количественное определение витамина Kj 112
4.9. Определение алкалоидов 114
4.9.1. Качественное определение алкалоидов 114
ГЛАВА 5. Изучение фармакологической активности извлечений из сырья растений рода крапив а 118
5.1. Получение водных извлечений и густых экстрактов 118
5.2. Изучение химического состава водных извлечений и густых экстрактов 121
5.2.1. Изучение качественного состава 121
5.2.2. Изучение количественного содержания отдельных классов биологически активных веществ 122
5.2.2.1. Определение полисахаридов в водных извлечениях 123
5.2.2.2. Определение флавоноидов в густых экстрактах (экстрагент - 60% спирт этиловый) 123
5.2.2.3. Определение пигментов в густых экстрактах (экстрагент -ацетон) 124
5.3. Изучение острой и хронической токсичности 125
5.4. Изучение специфической фармакологической активности 126
5.4.1. Исследование антиноцицептивнои активности 127
5.4.2. Изучение противовоспалительной активности 130
5.4.3. Изучение антиоксидантной активности 134
5.4.4. Изучение антимикробной активности 137
5.4.5. Изучение влияния на свертывающую систему крови 139
5.4.6. Изучение иммуномодулирующей активности 140
Выводы 149
Список литературы
- Крапива двудомная (Urtica dioicaL.)
- Определение подлинности сырья и числовых показателей
- Морфолого-диагностические признаки корневищ и корней крапивы двудомной
- Качественное определение углеводов
Введение к работе
Многовековые традиции российской медицины сформировали высокое доверие к лекарственным растениям практически во всех социальных группах населения. Спрос отечественных покупателей на растительные препараты значительно выше, чем в большинстве развитых стран, где, тем не менее, на долю лекарственных средств растительного происхождения приходится в последние годы около 20-25% всех выписываемых рецептов [12]. Это связано с рядом преимуществ средств растительного происхождения перед синтетическими, а именно большей биосовместимостью фитопрепаратов, широтой терапевтического действия, низкой токсичностью, а также утратой многих баз по производству химических субстанций и реактивов, необходимых для их изготовления [133].
Растения рода крапива занимают особое место среди лекарственных растений, используемых в народной и официнальной медицине. Анализ данных литературы показал, что в народной медицине различные части крапивы двудомной использовали как кровоостанавливающее, противодиабетическое, а так же в качестве отхаркивающего и мочегонного средства [22, 48, 155], кроме того, при хроническом бронхите и других заболеваниях дыхательных органов, желтухе и заболеваниях печени; наружно для ванн при отеках, ранах, ушибах [109].
Работы последних лет расширили представление о спектре фармакологического действия представителей семейства крапивных. Установлено, что листья крапивы двудомной оказывают на организм помимо кровоостанавливающего, также гиполипидемическое, желчегонное,
противовоспалительное, утеротонизирующие, спазмолитическое и адаптогенное действие [119]. Применяют листья крапивы и как антимикробное [71, 72, 168, 171, 179], гипотензивное, противоопухолевое средство [117, 118, 184].
До настоящего времени официнальная медицина применяет только листья крапивы двудомной. Однако в некоторых странах для медицинских целей уже используют и корневища с корнями крапивы двудомной [186, 191, 193, 194, 208, 209].
Аналитический обзор данных литературы показал, что химический состав и биологическая активность корневищ и корней крапивы двудомной, а также травы крапивы двудомной и крапивы жгучей изучены не достаточно. В этой связи исследования химического состава и биологической активности сырья крапивы двудомной и крапивы жгучей является актуальным, позволяющим значительно расширить отечественную сырьевую базу лекарственного растительного сырья для получения на его основе новых препаратов.
Цель исследования: выявить новые перспективные виды сырья из растений рода крапива, изучить возможность комплексного использования сырья крапивы двудомной и крапивы жгучей в качестве потенциального источника для создания фитопрепаратов с различными видами активности.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
провести скрининговый фитохимический анализ травы, корневищ и корней крапивы двудомной, травы крапивы жгучей, а также комплексов БАВ полученных из изучаемых видов сырья;
установить оптимальные условия экстракции БАВ из различных видов сырья крапивы; определить количественное содержание основных групп БАВ;
установить корреляционную связь между фазами вегетации растения и накоплением БАВ в сырье;
изучить морфолого-анатомическое строение корневищ и корней крапивы двудомной, травы крапивы жгучей, выявить диагностические признаки для определения подлинности сырья;
определить критерии оценки качества сырья (травы, корневищ и корней) крапивы двудомной, крапивы жгучей, разработать проекты НД на сырье;
изучить острую токсичность; исследовать специфическую фармакологическую активность извлечений, полученных из травы, корневищ и корней крапивы двудомной, травы крапивы жгучей с помощью экстрагентов различной полярности.
Научная новизна работы
В ходе фитохимического исследования (качественными реакциями, селективной экстракцией, хроматографией на бумаге, в тонком слое сорбента, высокоэффективной жидкостной) установлен химический состав травы, корневищ и корней крапивы двудомной, травы крапивы жгучей. Выявлены соединения различной структуры: производные у- и а-пиронов, органические кислоты (щавелевая, аскорбиновая, молочная, яблочная, янтарная, галловая, эллаговая, хлорогенновая, кофейная), дубильные вещества (конденсированного и гидролизуемого типа), пигменты (а-, р- и у-каротиноиды, хлорофиллы), тритерпеновые соединения, витамин Кь алкалоиды.
Подобраны условия оптимизации процессов экстракции (природа экстрагента, степень измельчения сырья, число ступеней экстракции, временной режимы экстракции, соотношение сырья и экстрагента) основных групп БАВ. Модифицирована методика спектрофотометрического определения суммы флавоноидов в сырье крапивы, исключающая использование государственного стандартного образца рутина. Определено количественное содержание органических кислот, дубильных веществ, флавоноидов, каротиноидов, хлорофиллов, тритерпеновых соединений, витамина К\.
Выделены и изучены водорастворимые полисахаридные комплексы (ВПСК) и комплексы рамногалактуронов крапивы двудомной и крапивы жгучей, установлен их моносахаридный состав. Изучен аминокислотный, макро- и микроэлементный состав растений рода крапива.
В листьях крапивы двудомной методом ВЭЖХ определено 30, в траве крапивы двудомной - 42, в корневищах и корнях крапивы двудомной - 17, а в траве крапивы жгучей - 23 вещества. Обнаружены фенолкарбоновые кислоты -галловая, эллаговая, хлорогеновая, кофейная; кумарины - эскулетин, эскулин, скополетин, умбеллиферон, кумарин, герниарин; флавоноиды - рутин, кверцетин, гиперозид, цинарозид, изорамнетина-3,7-диглюкозид.
Выявлена корреляционная связь между фазами вегетации и накоплением органических кислот, дубильных веществ, флавоноидов, тритерпеноидов, пигментов в сырье крапивы. Установлены оптимальные сроки заготовки сырья.
Проведено морфолого-анатомическое изучение подземных органов крапивы двудомной и травы крапивы жгучей и выявлены диагностические признаки для определения подлинности сырья. Разработаны товароведческие показатели качества лекарственного растительного сырья изучаемых видов.
Исследование фармакологической активности водных извлечений, густых экстрактов, полученных из травы, корневищ и корней крапивы двудомной, травы крапивы жгучей с использованием 60% этилового спирта и ацетона показали, что они обладают противовоспалительной, антиаллергической, антиноцицептивной, гемостатической, антимикробной и иммунотропной активностями. Выявлено in vitro и in vivo антиоксидантные свойства этих растений.
Установленные виды фармакологической активности экспериментально обосновывают перспективность использования в медицинской практике не только листа, но и травы, корневищ и корней крапивы двудомной, а также травы крапивы жгучей в качестве сырьевых источников для получения новых препаратов на их основе.
Приоритет проведенных исследований подтвержден заявкой на получение Патента РФ на изобретение «Средство, обладающее противовоспалительным, анальгетическим и антиоксидантным действием» (приоритетная справка № 2005129223 от 19.09.05).
Практическая значимость работы
Предложены новые виды сырья и выявлена возможность комплексного использования растений рода крапива, так как трава, корневища и корни крапивы двудомной и трава крапивы жгучей содержат широкий спектр БАВ. Результаты морфолого-анатомических, фитохимических и товароведческих
исследований включены в проекты ФС на сырье «Трава крапивы двудомной», «Корневища и корни крапивы двудомной», «Трава крапивы жгучей». В ФС «Листья крапивы» включены дополнения в разделах качественные реакции, числовые показатели, впервые включен раздел - количественное определение.
Результаты фармакологического исследования обосновывают возможность создания новых препаратов разнообразного спектра действия на основе травы, корневищ и корней крапивы двудомной, травы крапивы жгучей потому, что трава крапивы двудомной и крапивы жгучей обладают однонаправленным, в разной степени выраженным антиноцицептивным, противовоспалительным, антиаллергическим, антиоксидантным, антимикробным, гемостатическим, иммуностимулирующим действием. Подземные органы крапивы двудомной являются перспективным сырьем для получения средств обладающих выраженной антиноцицептивной, антиоксидантной, гемостатической активностью, но, в отличие от надземных органов данного растения, не проявляют противовоспалительного, антиаллергического, антимикробного действия и являются мягкими иммунодепрессантами.
Результаты внедрения
На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:
- в МУЗ «Центр контроля качества и сертификации лекарственных средств» г. Курск апробированы методики количественного УФ- спектрофотометрического определения флавоноидов, каротиноидов и хлорофиллов в листьях крапивы двудомной (акты об апробации № 92, 107 от 24.01.2006).
- в ГУЗ «Вологодский областной центр контроля качества и сертификации лекарственных средств» г. Вологда апробированы методики количественного УФ-спектрофотометрического определения флавоноидов и хроматоспектрофотометрического определения витамина К! в траве крапивы двудомной (акты об апробации от 21.09.2005 и от 21.02.2006).
- информация о химическом составе травы крапивы жгучей, подземных органов крапивы двудомной; противовоспалительном действии водных извлечений листа, корневищ и корней крапивы двудомной, травы крапивы жгучей внедрена в учебные процессы кафедр фармакогнозии с курсом ботаники Рязанского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова (акты внедрения № 14/96-1, 15/94-1, 16/95, 17/96 от 14.04.2004) и Северо-Осетинском государственном университете им. К.Л. Хетагурова (акты №31/94, 32/94-2, 33/95-1, 34/95-1 от 03.06.2004).
- информация о антиоксидантной активности, элементном составе некоторых растений рода крапива внедрена в учебный процесс кафедры фармакогнозии Ярославской государственной медицинской академии (акты внедрения № 15/97, 16/98 от 02.03.2005).
На защиту выносятся - результаты фитохимического исследования травы, корневищ и корней крапивы двудомной, травы крапивы жгучей;
- результаты морфолого-анатомического изучения корневищ и корней крапивы двудомной, травы крапивы жгучей;
- экспериментальные данные по стандартизации сырья растений рода крапива и разработке проектов ФС «Трава крапивы двудомной», «Трава крапивы жгучей», «Корневища и корни крапивы двудомной»; проекта дополнения к ФС «Листья крапивы»;
- результаты фармакологических исследований водных извлечений и густых экстрактов из сырья крапивы двудомной и крапивы жгучей, полученных с использованием в качестве экстрагентов 60% этилового спирта и ацетона.
Апробация работы. Основные результаты исследований доложены на 66, 67, 69, 70-й научной конференциях Курского медицинского университета (2001-2005), Российской научно-практической конференции «Рациональное использование лекарств» (Пермь, 2004), XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва 2005), Международной научно-практической конференции «Экология в окружающей среде и здоровье населения Центрального Черноземья» (Курск 2005), научной конференции
Северо-Осетинского государственного университета им. К.П. Хетагурова (Владикавказ, 2004), совместном заседании кафедр органической химии, фармакогнозии с курсом ботаники, фармацевтической и токсикологической химии с курсом аналитической химии, фармацевтической технологии, неорганической химии, фармакологии, фармации ФПО, инфекционных болезней Курского Государственного медицинского университета (2006).
Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Курского Государственного медицинского университета по проблеме «Фармация». Номер государственной регистрации 0120.0412604.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 170 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов (глава 2), собственных исследований (глава 3-5), общих выводов, списка литературы и приложения. В тексте содержится 47 таблиц, 17 рисунков. Приложение содержит таблицы, рисунки, проекты ФС «Трава крапивы двудомной», «Трава крапивы жгучей», «Корневища и корни крапивы двудомной», проект дополнения к ФС на «Листья крапивы», акты внедрения результатов работы в практику. Список литературы состоит из 209 источников, из них 44 на иностранном языке.
Крапива двудомная (Urtica dioicaL.)
Широкое распространение крапивы двудомной, значительные запасы сырья, а также применение в народной медицине при различных патологиях способствовало изучению ее химического состава.
Химический состав листьев. Первые сведения о химической составе листьев крапивы двудомной появились еще в 1857г. Было установлено, что после сжигания зола листьев содержит на 1 г сухого сырья - 4,8%, минеральный состав представлен 1,66% калия, 0,38% натрия, 0,35%) магния, 0,69% фосфора. Позднее в немецком землевладельческом календаре приводятся данные о наличии в крапиве двудомной кальция, кремния, азота [135, 140]. В настоящее время в литературе имеются данные о том, что листья крапивы двудомной содержат от 15 до 19 % минеральных веществ [77], которые представлены как макро- (К, Са, Mg, Fe), так и микроэлементами (Mn, Си, Zn, Со, Mo, Cr, А1, Ва, Se, Ni, Sr, Pb) [74, 75, 132, 153]. При изучении золы листьев крапивы двудомной были найдены К20 - 15,2%, СаО - 36,5%, Na20 -2,0%, MgO - 8,4%, Fe203 -6,3%, Р205 - 10,3%, S03 - 10,6%, Cl2 - 3,3%, Si02 - 8,0%. [71].
В листьях крапивы двудомной обнаружены: витамин К\ — (0,5 мг%; 4,108%) [19, 43, 132, 159, 198]; пантотеновая кислота; витамины группы В - Вь В2 и витамин Е [46, 116]. Во многом свойства крапивы двудомной обусловлены наличием в ней каротина и каротиноидов. Б.Г. Савинова и СЕ. Кудрицкой [62, 63] установили, что содержание каротиноидов в листьях крапивы двудомной 17,0 мг% при влажности листьев 57,34%, а в пересчете на сухое вещество - 29,6 мг%. Было выявлено, что главным компонентом в каротиноидном комплексе листьев крапивы двудомной является Р-каротин (61,0%). В крапиве двудомной также найдены гидрокси-а-каротин (0,9%), лютеоксантин (10,3%), лютеин-эпоксид (13,1%), виолаксантин (14,7%), обнаружены ксантофилл и ксантофилл-эпоксид [62,63].
Листья крапивы двудомной являются источником получения хлорофилла (зелёный краситель) для фармацевтической, парфюмерной и пищевой промышленности - его содержание составляет до 5%; причем 75% приходится на а-хлорофилл, a 25% - на (3-хлорофилл [7, 13].
Листья крапивы двудомной содержат также дубильные вещества 2,45-3,1% [71, 116, 140]; алкалоиды (0,019-0,29%) и другие азотсодержащие соединения - ацетилхолин, гистамин, 5-гидрокситриптомин, холин, бетаин [116]; камеди; эфирные масла; гликозид уртицин [131]; стерины, сапонины, протопорфирин, копропорфирин, фитонциды; некоторые органические кислоты [116,167].
Исследования Олейникова Д.Н., 2004г. [105] показали, что в зависимости от используемой методики содержание суммы органических кислот, определяемое в пересчете на лимонную кислоту, может колебаться в диапазоне от 2% до 5%. Установлено, что содержание суммы органических кислот в пересчете на малат составляет 12,7±0,34% [99]. Содержание аскорбиновой кислоты по разным источникам колеблется от 269 до 600 мг% [52, 131].
Из листьев крапивы двудомной выделены и идентифицированы флавоноидные гликозиды: кверцетин-3,7-рутинозогалактозид, кверцетин-3,7-рутинозодигалактозид, кемпферол-3-глюкогалактозид и кверцетин-3-глюкогалактозид, гликозид рутин и свободные агликоны:. кверцетин, кемпферол, лютеолин, 3-О-метилкверцетин и 5-О-метиллютеолин [ПО]. Содержание суммы флавоноидов в листе крапивы двудомной составляет от 1 до 2% [85], на долю лютеолина по данным Петрова Е.В. приходится 0,65% [108].
Белки листьев крапивы содержат почти все незаменимые аминокислоты, некоторые из них присутствуют в больших количествах: лейцин 7,04%, фенилаланин - 6,68%, лизин - 5,10%, аргинин - 5,50% от количества сырого протеина, в меньших количествах находятся метионин - 0,56% и триптофан — 0,89%. Из заменимых аминокислот листья крапивы богаты аспарагиновой -10,31%) и глутаминовой - 9,22%) кислотами. Содержание общего азота - 4,14%, 47%) которого небелковой, а 53% - белковой природы [13]. Листья крапивы двудомной содержат 18% клетчатки; 10% углеводов (крахмал) и свободные сахара - глюкозу, сахарозу, фруктозу [13].
Химический состав травы. В литературе приводятся сведения о том, что трава крапивы двудомной содержит органические кислоты: муравьиную, масляную, щавелевую, фумаровую, молочную, аскорбиновую, янтарную, лимонную, хинную, галловую [116]. Суммарное содержание органических кислот в пересчете на малат составляет 18,2±0,39%, что объясняется высоким содержанием кислот в стеблях- 19,4±0,20% [99].
В траве присутствуют стероиды - ситостерин; витамины - Вь В2, Е, К, РР, каротин; дубильные вещества; флавоноиды - 1,96%; порфирины — протопорфирин, копропорфирин I; сапонины; аминокислоты; кумарины; азотсодержащие соединения; тритерпеновые вещества; лигнаны. Эфирное масло, выделенное из травы, в своем составе содержит метилгептенон, ацетофенон [42, 116]
Кавторадзе Н.Ш. с соавт. (2001) при изучении химического состава надземной части крапивы двудомной выделили кофейную кислоту, рутин, кверцетин, гиперин, изокверцетин [42].
Химический состав подземных органов. Из метанольного экстракта корней крапивы выделены 11 лигнановых гликозидов [187], (10E,12Z)-9 гидрокси-10,12-октадекадиеновая кислота [188], терпеновые диолы [190], п-и м гидроксибензальдегиды, о-гидроксиэтилфенол, о- и п-гидроксиметилфенолы, п гидроксицетофенон, З-метил-4-гидроксиацетофенон, 3,5-диметоксигидрохинон, 2-метокси-о-гидроксиэтилфенол (гомованилиновый спирт), 2-метокси-4 гидроксипропилфенол, 3-метокси-п-гидкоксибензальдегид, 2-метокси-4 (1,2дигидрооксипропил)фенол, (3-метокси-4-гидроксифенил)-(1-гидроксиэтил) кетон, 2-метокси-4-(3-гидроксипроп- 1-енил)фенол, 1-гидроксиметил-4 гидроксиацетофенон, индол-3-карбальдегид, 3-метокси- 1-гидроксиметил-4-гидроксиацетофенон и др. [189]. Выделены так же стерины, кумарины (скополетин), алкалоиды (никотин), витамин С, танины [116].
Химический состав семян. Семена содержат 30-33% желто-зеленого, богатого хлорофиллом масла с высоким содержанием токоферолов, витамин С, белки - 26,9%, углеводы - 25,1% [206].
Определение подлинности сырья и числовых показателей
Отбор и подготовку проб для анализа проводили в соответствии требованиями статьи «Правила приемки лекарственного растительного сырья и методы отбора проб для анализа» ГФ XI и ОФС 42-0013-03 [29, 104].
Подлинность сырья устанавливали приемами макро- и микродиагностического методов анализа, описанным в ГФ XI [29].
В соответствии с требованиями к качеству сырья для каждого объекта определяли числовые показатели: влажность, содержание золы общей и золы, нерастворимой в 10% растворе хлористоводородной кислоты, измельченность и содержание примесей, содержание экстрактивных веществ, коэффициента водопоглощения [29].
Для определения использовали методики соответствующих статей ГФ XI: «Определение влажности лекарственного растительного сырья» [29], «Определение золы» [29], «Определение подлинности, измельченности и содержания примесей в лекарственном растительном сырье» [29]. Определение содержания экстрактивных веществ, извлекаемых водой, спиртом различной концентрации и ацетоном, проводили в соответствии с требованиями статьи «Определение содержания экстрактивных веществ в лекарственном растительном сырье» [29]. Фитохимические методы исследования
Качественный состав БАВ, содержащихся в исследуемом сырье, устанавливали с помощью общепринятых специфических качественных реакций, методами бумажной, тонкослойной, высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Хроматографическое исследование проводили методами восходящей одномерной и двумерной хроматографии. При проведении тонкослойной хроматографии использовали пластинки "Silufol" (UV 254, 366 Чехословакия), для бумажной хроматографии бумагу "Ленинградская N 2" [47, 98, 154]. Пробы веществ (0,01-0,18мг) исходных извлечений в зависимости от чувствительности реактивов и концентрации соединений наносили с помощью микрокапилляров на расстоянии 1 см от края пластины. Растворители для хроматографических систем использовали квалификации х.ч. или ч.д.а.. Анализы проводили в стандартных условиях.
Наилучшее разделение БАВ достигалось в следующих системах растворителей: - ацетонитрил-вода-о-фосфорная кислота (400:600:5); - изопропанол-вода (4:1) (3:1); - этилацетат - бензол (1:2); - 30% уксусная кислота; - хлороформ - бензол (1:2); - хлороформ - этанол (9:1); - хлороформ - этилацетат - муравьиная кислота (5:4:1); - хлороформ - метанол - вода (61:32:7); - хлороформ - ацетон (4:1); - гексан - диэтиловый эфир (8:2); - бензол - этанол (8:2); - бензол-ацетон (8:1) (9:1); - бензол-петролейный эфир (1:1); - бензол-метанол (8:2); - бензол-метанол-ацетон (8:2:10); - н-бутанол-кислота уксусная ледяная-вода (4:1:2) (3:1:1) (4:1:1) (12:3:5); - н-бутанол-ацетон-вода (4:5:1); - 95% этиловый спирт - аммиака концентрированного (16:4,5). Хроматограммы рассматривали в дневном и УФ-свете при 360 нм с использованием ртутно-кварцевой лампы до и после проявления реактивами. Хроматограммы проявляли следующими детектирующими реактивами: - дифениламиновым реактивом; - антроновым реактивом; - резорциновым реактивом; - анилиндифениламино-фосфатным реактивом; - раствором нингидрина 0,25 % в ацетоне; -35 - 5 % спиртовым раствором алюминия хлорида; - 10% спиртовым раствором едкого натра; - диазореактивом; - 3 % раствором хлорида железа (III); - 1 % раствором ванилина; - раствором бромкрезолового зеленого; - концентрированными кислотами (азотной); - парами аммиака; - 0,5 % спиртовым раствором метиловогооранжевого; - 20% спиртовым раствором фосфорновольфрамовой кислоты. Определение фенольных соединений проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы «Waters», с последующей компьютерной обработкой результатов с помощью программы «Millenium 32» [35].
Количественное содержание природных БАВ оценивали с использованием современных методов химического анализа.
Качественное и количественное определение аминокислот проводили на аминокислотном анализаторе марки ААА-339 (ЧССР). Содержание аминокислот устанавливали по площади пиков удержания идентифицированных аминокислот и выражали в мг% (мкг/мг) [69, 169].
Элементный состав золы сырья крапивы определяли после предварительного сжигания и озоления по методике полуколичественного спектрального анализа минерального сырья на спектрометре ДФС-8-1, в лаборатории спектрального анализа НИИ ФГУП «Кавказгеолсъемка», г. Ессентуки.
Содержание водорастворимых полисахаридов и рамногалактуронов определяли гравиметрическим методом [23, 26, 58]. Определение содержания восстанавливающих моносахаров в ВПСК и комплексах РГ проводили после гидролиза с использованием реакции с натрия пикратом спектрофотометрическим методом [33, 139]. Моносахаридный состав ВПСК и комплексов РГ определяли после кислотного гидролиза денситометримеским методом [47].
Морфолого-диагностические признаки корневищ и корней крапивы двудомной
Внешние признаки цельного сырья. Сырье представлено цельными корневищами и корнями, корневища прямые слегка изогнутые, с многочисленными придаточными корнями, различной длины, толщина - 1,5-3 см. Поверхность корневища морщинистая, излом ровный или зернистый, у корневищ в центре обычно имеется полость вследствии разрушения сердцевины.
Корни тонкие, цилиндрические, сплющенные и изогнутые, иногда разветвленные, разной длины, толщина - до 8 мм. Поверхность гладкая, излом ровный или зернистый.
Цвет корневищ с поверхности серовато-бурый, на изломе желтовато-белый, цвет корней с поверхности желтовато-серый, на изломе желтовато-белый или белый. Запах слабый. Вкус горьковатый.
Внешние признаки измельченного сырья. Сырье представлено кусочками корневищ и корней различной формы, проходящие сквозь сито с отверстиями С" диаметром 7 мм. Цвет желтый, желтовато-белый. Вкус горьковатый Микроскопические признаки Строение корня. В очертании поперечный срез корня имеет форму овала (приложение 1.12-1.14), несколько сплющенного по бокам. Корень вторичного строения. Пробка состоит из нескольких слоев клеток (3-5) бурого цвета.
Клетки паренхимы наружной части коры - тангентально вытянутые, с тонкими оболочками, плотные, без межклетников. Внутренняя часть коры -однородная. Ее клетки большей частью округлые или слегка вытянуты в тангентальном направлении (приложение 1:14).
На границе с камбием, во внутренних слоях коры лежат проводящие элементы луба, отличающиеся от паренхимы меньшими размерами. Во всей толще паренхимы коры встречаются лубяные волокна одиночные и небольшими группами (по 2-5). Сернокислым анилином они окрашиваются слабо, следовательно, их степень одревеснения незначительная. Камбий хорошо виден только на участке между лубом и древесиной, а в радиальных лучах он как бы прерывается - незаметен.
Паренхима коры заполнена крахмальными зернами (реакция с раствором Люголя). Крахмальные зерна простые, округлые или овальные. Очень много крахмала в паренхиме вторичной коры и в радиальных лучах.
За узкой линией камбия следует древесина (приложение 1.12, 1.13). Она образует два крупных, треугольных участка, расположенных супротивно. Древесина состоит из множества утолщенных волокон и крупных спиральных сосудов, лежащих небольшими группами, реже одиночно. Между сосудами наряду с волокнами встречаются небольшие участки тонкостенной древесной паренхимы.
Между участками древесины расположены два очень широких радиальных луча, состоящих из основной паренхимы, клетки которых радиально вытянуты. В паренхиме радиальных лучей встречаются крупные воздухоносные полости (приложение 1.13).
В центре корня остатки первичной ксилемы в виде диархоного луча. От лучей первичной ксилемы тянутся крупные радиальные лучи, образованные основной паренхимой (приложение 1.13).
Строение корневища. Корневище имеет непучковое строение (приложение 1.15). Покровная ткань - эпидерма. Клетки опробковевшие, светло-бурого цвета. Первичная кора широкая и состоит из основной, запасающей паренхимы. Клетки крупные, округлые, рыхло расположенные и заполнены простыми крахмальными зернами. Эндодерма не выражена. Перециклические лубяные волокна слегка одревесневшие, расположены небольшими группами по 1-7 клеток, стенки сильно уплощены. Полость клеток небольшая, сдавленная. Вторичная кора занимает небольшой объем и расположена сплошным кольцом. Камбий четко не выражен. Сердцевина хорошо развита. Ее клетки крупные, округлые, рыхло расположены и заполнены простыми крахмальными зернами. Ксилема представлена короткими, редкими радиальными лучами сосудов, окруженных склеренхимой. Клетки склеренхимы одревесневшие. Встречаются небольшие участки древесинной, мелкоклеточной паренхимы. Сосуды спиральные.
Микроскопические признаки измельченного сырья («давленых» препаратов). Обрывки пробки, паренхимы с крахмальными зернами, сосудов ксилемы (приложение 1.16).
Микроскопические признаки порошка. Обрывки пробки, древесины, толстостенных узкополостных волокон (приложение 1.17). В связи с тем, что в нормативной документации (НД) на лист крапивы двудомной отсутствуют показатели качества, регламентирующие содержание БАВ, а на траву крапивы двудомной и жгучей, а также корневище и корни крапивы двудомной не существует НД, разработка показателей качества сырья крапивы является актуальной.
Определение влажности в траве, корневище и корнях крапивы двудомной и траве крапивы жгучей проводили по методике ГФ XI [29] как потерю в массе при высушивании до постоянной массы. Сырье хранили при комнатной температуре, в защищенном от прямого света месте, помещение отапливалось и вентилировалось, влажность в помещении не контролировалась и искусственно не поддерживалась.
Качественное определение углеводов
Для определения углеводов использовали предварительно очищенные, от полифенольных соединений фильтрацией! через колонку с алюминия оксидом, водные извлечения из листьев, травы, корневищ и корней крапивыД" двудомной, травы крапивы жгучей.
Свободные сахара определяли реакцией Бертрана (1),, реакцией с реактивом Несслера (2) [137, 156, 157]: 1 - при нагревании на водяной бане Г мл очищенных водных извлечений с Г мл жидкости Фелинга выпадали; оранжево-красный осадки меди (I) оксида. 2- к 1 мл очищенных водных извлечений прибавляли, по Г мл реактива Несслера и нагревали на кипящей водяной бане. В результате выпадали черные осадки ртути (I) оксида, что свидетельствовало о присутствии Сахаров в свободном виде.
Связанные сахара определяли [23, 26,136,156]: - к Г мл очищенных водных извлечений прибавляли по 1". мл кислоты серной 10 % и нагревали на кипящей водяной бане в течение 5 мин. После охлаждения к гидролизатам добавляли по 1 мл жидкости Фелинга. При этом происходило увеличение объемов осадков по сравнению с осадками полученными в реакции — 1, что свидетельствует о присутствии в водных извлечениях из сырья крапивы двудомной и крапивы жгучей Сахаров в связанном виде. - к 10 мл водных извлечений прибавляли по 30 мл 95% спирта этилового, перемешивали, появлялись хлопьевидные сгустки, выпадающие в осадок при стоянии, что указывает на присутствие в изучаемых видах сырья водорастворимых полисахаридов.
Для обнаружения крахмала к 1 мл очищенных водных извлечений прибавляли по 1 капле 0,1 М раствора йода. Наблюдали появление в каждой пробирке синего окрашивания, что свидетельствовало о присутствии крахмала в изучаемых объектах [136, 157].
При нанесении на поперечный срез корневищ и корней крапивыv двудомной 2-3 капель раствора йода также наблюдали синее окрашивание (крахмал).
Результаты полученные при проведении качественных реакций подтверждали хроматографически. Хроматографирование проводили г--, нисходящим способом, на хроматогрической бумаге "Ленинградская N 2". В качестве подвижной фазы использовали систему растворителей: изопропанол-вода (4:1) [137]. Время насыщения хроматографической камеры 30 минут. На линию старта с помощью микропипетки наносили 0,01 мл водных извлечений из листьев, травы, корневищ и корней крапивы двудомной, травы крапивы жгучей, параллельно с 0,1% растворами достоверных стандартных образцов Сахаров. После прохождения фронта растворителя, хроматограуму вынимали из камеры, высушивали на воздухе до удаления следов растворителей и обрабатывали дифениламиновым реактивом1, специфичным для альдоз. Проявленные хроматограммы подсушивали на воздухе и нагревали в сушильном шкафу при температуре 80С, в течении 5 минут. Сахара (альдозы) на хроматограммах проявились в виде пятен темно-фиолетового цвета с коричневой серединой (рис. 4.1.).
Схема хроматограммы состава свободных Сахаров (альдоз) Система: изопропанол-вода (4:1) Обозначения: 1 - извлечение листьев крапивы двудомной; 2 - извлечение корневищ и корней крапивы двудомной; 3 - извлечение травы крапивы двудомной; 4 - извлечение травы крапивы жгучей; Г - 0,1% водный раствор глюкозы; Р - 0,1% водный раствор рамнозы; Гал - 0,1% водный раствор галактозы. Во всех извлечениях обнаружены не менее 4 веществ отнесенных к свободным сахарам (альдозам). В водных извлечениях из подземных органов крапивы двудомной и травы крапивы жгучей с достоверными образцами установлено наличие глюкозы (Rf 0,67), галактозы (Rf 0,4), рамнозы (Rf 0,12), одно вещество с Rf 0,72 не идентифицировано. В листе и траве крапивы двудомной установлено как минимум еще одно неидентифицированное вещество, отнесенное к альдозам (Rf 0,46).
Присутствие в листьях, траве, корневище и корнях крапивы двудомной, траве крапивы жгучей кетоз устанавливали, используя метод хроматографии в тонком слое сорбента со специфическими реактивами. В качестве подвижной фазы использовали системы растворителей: изопропанол-вода (4:1), (3:1), кетосахара на хроматографических пластинках проявляли детектирующими реактивами: антроновым2 и резорциновым3.
При последовательной обработки хроматографических пластинок антроновым реактивом 1 и 2 (специфичным для кетоз) в водных извлечениях из исследуемых видов сырья крапивы не установлено присутствие кетосахаров в свободном виде, что было подтверждено и при обработке пластинок резорциновым реактивом (розовых пятен характерных для кетоз не появлялось).
