Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 15
1.1. Ботаническая характеристика тысячелистника обыкновенного 15
1.2. Применение тысячелистника обыкновенного в медицине 16
1.3. Химический состав тысячелистника обыкновенного 19
1.4. Лечебные свойства биологически активных веществ тысячелистника обыкновенного 25
ГЛАВА II Материалы и методы исследований 41
2.1. Фитохимические методы исследования 41
2.2. Биологические методы исследования 45
2.2.1. Оценка противовоспалительной активности 46
2.2.1.1 .Модель острого асептического воспаления 46
2.2.1.2. Модель анафилактоидной реакции 46
2.2.2. Оценка анальгетической активности 47
2.2.2.1. Модель «уксусных корчей» 47
2.2.2.2. Модель формалиновой болевой реакции 47
2.2.3. Оценка антимикробной активности 48
2.2.4. Оценка протективной активности препаратов при стафилококковой инфекции 48
2.2.5. Иммуномодулирующее действие препаратов при стафилококковой инфекции 49
2.2.6. Индукция и оценка выраженности иммунного ответа 49
2.2.6. Оценка активности некоторых факторов неспецифической резистентности 50
2.2.7. Статистическая обработка 51
ГЛАВА III. Получение фармакологических средств из травы тысячелистника обыкновенного и изучение их химического состава 52
3.1. Получение суммарного препарата биологически активных веществ (средства «Ахилон») 52
3.2. Изучение химического состава фармакологического средства «Ахилон» 56
3.2.1. Выделение и идентификация сесквитерпеновых лак- тонов «Ахилона» 56
3.2.1.1. Разделение суммы сесквитерпеновых лактонов 59
3.2.1.2. Идентификация сесквитерпеновых лактонов 59
3.2.1.3. Разработка методики количественного определения хамазулена в эфирном масле тысячелистника обыкновенного 61
3.2.1.3.1. Выделение хамазулена 62
3.2.1.3.2. Получение пикрата хамазулена 63
3.2.1.4. Определение удельного показателя поглощения хамазулена 63
3.2.1.5. Методика определения хамазулена в эфирном масле 65
3.2.1.6. Количественное определение хамазулена в «Ахилоне» 66
3.2.2. Выделение и идентификация каротиноидов из фармакологического средства «Ахилон» 68
3.2.2.1. Получение суммы каротиноидов 68
3.2.2.2. Исследование методом хроматорафии в тонком слое сорбента 69
3.2.2.3. Выделение каротиноидов 70
3.2.2.4. Идентификация каротиноидов 70
3.2.2.5. Количественное определение каротиноидов и хлорофиллов в «Ахилоне» 71
3.2.3. Выделение и идентификация кумаринов из фармакологического средства «Ахилон» 73
3.2.3.1. Методы качественного определения кумаринов в «Ахилоне» 73
3.2.3.2. Получение суммы кумаринов 75
3.2.3.3 Разделение суммы кумаринов 75
3.2.3.4. Идентификация кумаринов 76
3.2.3.5. Количественное определение кумаринов в «Ахилоне» 79
3.2.4. Выделение и идентификация флавоноидов из фармакологического средства «Ахилон» 81
3.2.4.1. Идентификация флавоноидов 81
3.2.4.2. Количественное определение суммы флавоноидов 84
3.2.5. Определение дубильных веществ в «Ахилоне»... 86
3.2.5.1 .Качественное обнаружение дубильных веществ в «Ахилоне» 86
3.2.5.2.Количественное определение дубильных веществ в фармакологическом средстве «Ахилон» 90
3.2.6. Определение срока хранения «Ахилона» 91
3.3. Получение комплекса водорастворимых полисахаридов (фармакологического средства «Ахипол») 92
3.4. Изучение химического состава «Ахипола» 93
3.4.1. Качественный анализ «Ахипола» 93
3.4.2. Количественный анализ «Ахипола» 99
ГЛАВА IV Биологическая активность фармакологических средств тысячелистника обыкновенного 104
4.1. Изучение острой токсичности фармакологических средств «Ахилон» и «Ахипол» 104
4.2. Исследование анальгетической активности «Ахилона» 105
4.3. Определение противовоспалительной активности «Ахилона» 107
4.4. Определение антимикробной активности «Ахилона» 114
4.5. Изучение иммуномодулирующей активности фармакологических средств, полученных из тысячелистника обыкновенного 115
4.5.1. Влияние «Ахилона», «Ахипола» и петролейного экстракта тысячелистника обыкновенного на развитие ГИО у животных, получавших антибиотик 117
4.5.2. Влияние «Ахилона» и «Ахипола» на развитие ГИО при экспериментальной стафилококковой инфекции 120
4.5.3. Влияние «Ахилона» и «Ахипола» на факторы неспецифической защиты организма 124
4.5.4. Изучение протективных свойств «Ахилона» и «Ахипола» 127
Выводы 132
Список литературы 134
- Лечебные свойства биологически активных веществ тысячелистника обыкновенного
- Выделение и идентификация сесквитерпеновых лак- тонов «Ахилона»
- Получение комплекса водорастворимых полисахаридов (фармакологического средства «Ахипол»)
- Влияние «Ахилона» и «Ахипола» на развитие ГИО при экспериментальной стафилококковой инфекции
Введение к работе
Актуальность темы. В современном арсенале лекарственных средств препараты растительного происхождения (фитопрепараты) составляют 30-40%, а в некоторых группах лекарственные средства, полученные из растений, достигают 70%. Применение лекарственных растительных средств в современной медицине не только остается стабильным, но имеет тенденцию к увеличению (96,138,139,197).
Все возрастающее изучение возможностей фитотерапии объясняется многими причинами. Известно, что лечебный эффект растений обусловлен содержанием в них широкого спектра химически простых и достаточно сложных соединений. В растениях обнаружены алкалоиды, аминокислоты, антибиотики, витамины, гликозиды, фенолы, органические кислоты, липиды, углеводы, микроэлементы и др. Препараты растительного происхождения обладают меньшей токсичностью, более высокой биодоступностью, лучше переносятся организмом, они, давая меньше побочных эффектов, чем синтетические аналоги, реже вызывают аллергические реакции (96, 172). Кроме того, преимуществом лекарственных растительных препаратов является то, что при лечении хронических заболеваний они при длительном применении не вызывают каких-либо побочных действий. Однако, в отличие от большинства химиотерапевтических средств, механизм лечебного действия многих растений, применяемых в медицине до настоящего времени полностью не выяснен (96).
В практической медицине растения семейства Аз1егасеае широко используются при различных формах патологий. Так, арника горная в медицине применяется в качестве средства, улучшающего работу сердца: при стенокардии, миокардитах, гипертонической болезни, кардиосклерозе, реже седативное; наружно - при гематомах, противовоспалительное, при заболеваниях полости рта и десен (101,185); полынь - как горечь, возбуждающая аппетит, усиливающая деятельность пищеварительных органов; василек синий - используется как диуретическое при отеках почечного и сердечного происхождения, при радикулитах, полиартритах, болезни печени, как сокогонное (16); бессмертник - как желчегонное средство при заболеваниях печени и желчного пузыря (96,119); девясил высокий применяют в качестве отхаркивающего и дезинфицирующего средства при заболеваниях дыхательных путей, гриппе (102); ромашка аптечная оказывает седативное влияние на нервную систему, обладает противовоспалительным, антисептическим, кровоостанавливающим, болеутоляющим, ветрогонным, желчегонным и противоаллергическим свойствами и используется в качестве потогонного, спазмолитического, антисептического и вяжущего (32, 107); мать-и-мачеха применяется как отхаркивающее средство, а также входит в состав грудных и потогонных чаев (28,119).
Перспективным источником для получения фитопрепаратов может служить тысячелистник обыкновенный, также относящийся к семейству Asteraceae и содержащий широкую гамму биологически активных веществ (82, 232, 237). Запасы тысячелистника обыкновенного в настоящее время превышают потребность отечественной медицинской промышленности, и значительная часть его как сырье экспортируется за рубеж ( 18, 157).
В эмпирической медицине тысячелистник обыкновенный применяется для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта, гепатита, астенических состояний, неврозов и истерий, респираторных инфекций, гриппа, вирусных инфекций, бронхиальной астмы и других (79, 132, 185). В настоящее время практическое здравоохранение остро нуждается в адаптогенных и иммунокорректорных лекарственных средствах, обладающих способностью смягчать отрицательные воздействия на организм человека неблагоприятных экологических, производственных и других факторов (50, 80, 100, 139, 149). Отельные химические компоненты, содержащиеся в тысячелистнике обыкновенном, индивидуально оказывают широкий спектр фармакологического действия (50, 107, 223). Однако, в отечественной официнальной медицине трава, цветки, и жидкий экстракт тысячелистника обыкновенного используются в основном только как гемостатические средства.
С учетом имеющихся литературных данных о химическом составе и биологической активности тысячелистника обыкновенного, такое узкое применение его следует считать явно не рациональным.
Исходя из выше сказанного, выявление возможных путей рационального использования сырья тысячелистника обыкновенного, за счет создания на его основе новых препаратов с различными видами активности является актуальной задачей.
Цель и задачи исследования Цель работы заключалась в изучении возможности расширения области применения травы тысячелистника обыкновенного, за счет выявления новых видов биологической активности (анальгетической, антимикробной, антиноцицептивной, противовоспалительной, протективной и иммуномодулирующей) и создание с учетом этого новых фитопрепаратов.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: провести аналитический обзор данных литературы по современному состоянию фитохимических и фармакологических исследований тысячелистника обыкновенного и групп биологически активных веществ, содержащихся в этом растении; разработать оптимальные условия экстракции биологически активных веществ и способ получения фармакологических средств из травы и шрота тысячелистника обыкновенного; изучить качественный и количественный состав биологически активных веществ фармакологических средств; провести в эксперименте исследование по выявлению в полученных фармакологических средствах анальгетической, антимикробной, антиноцицептивной, противовоспалительной, иммуностимулирующей и протективной активностей; разработать проект ФС на предлагаемое фармакологическое средство.
Научная новизна Разработаны оптимальные условия получения фармакологических средств из травы и из шрота тысячелистника обыкновенного под условным названием «Ахилон» и «Ахипол».
Проведено качественное и количественное изучение биологически активных веществ «Ахилона» и «Ахипола» (сесквитерпеновые лактоны (матрикарин, аустрицин, ханфиллин), растительные пигменты: каротиноиды и хлорофиллы, а также производные бензо-а-пирона (умбеллиферон, скополетин, кумарин, цихорин), производные фенил- бензо-у-пирона (гиперозид, кверцетин, рутин, апигенин, лютеолин), дубильные вещества гидролизуемой и конденсированной групп, углеводы).
Установлена и обоснована возможность УФ-спектрофотомет- рического определения количественного содержания хамазулена в эфирном масле «Ахилона» по удельному показателю поглощения при длине волны 358 нм.
Установлена антимикробная активность «Ахилона» в отношении Proteus vulgaris АТСС 4636, Candida albicans NCTC 2625, Escherichia coli АТСС 25922, Staphylococcus aureus 209-p, Bacillus subtilis ATCC 6633, Pseudomonas aeruginosa ATCC 1313; противовоспалительная активность на моделях острого асептического воспаления, анафилактоидной реакции и на модели медикаментозного гепатита, вызываемого введением антибиотика; анальгетическая активность на модели «уксусных корч»; антиноцицептивная активность на модели формалиновой болевой реакции; влияние препаратов «Ахилон» и «Ахипол» на развитие гуморального иммунного ответа к тимус-зависимому антигену (ЭБ) у здоровых животных, при применении антибиотика, а также при развитии стафилококковой инфекции; влияние этих фармакологических средств на неспецифическую резистентность организма у здоровых животных и при приеме антибиотика, протективное действие «Ахилона» и «Ахипола» при заражении мышей живой культурой золотистого стафилококка.
Получен патент на изобретение № 2177328 на «Средство, обладающее противовоспалительной, анальгетической и антиноцицептивной активностью» от 27.12.2001 г.
Практическая значимость Предложены новые фитопрепараты тысячелистника обыкновенного для использования в медицинской практике как в виде отдельных средств, так и в виде субстанций для создания препаратов с заданной фармакологической активностью.
Показана возможность более широкого применения травы тысячелистника обыкновенного в научной медицине, а именно в качестве антимикробного, противовоспалительного, анальгетического, а также иммуномодулирующего и протективного средства при стафилококковой инфекции.
Экспериментально обосновывается возможность применения препаратов тысячелистника обыкновенного совместно с назначением антибиотиков при состояниях, сопровождающихся угнетением показателей иммунологической реактивности и факторов неспецифической резистентности организма различного генеза.
Методика количественного УФ-спектрофотометрического определения хамазулена в эфирном масле включена в проект ФС на «Ахилон» и в проект дополнения к фармакопейной статье «Трава тысячелистника обыкновенного».
Использование методики количественного определения хамазулена в траве тысячелистника обыкновенного позволит повысить качество заготавливаемого сырья.
Внедрение в практику
Получен патент на изобретение № 2177328 на «Средство, обладающее противовоспалительной, анальгетической и антиноцицептивной активностью» от 27.12.2001 г.
Разработанная спектрофотометрическая методика количественного определения хамазулена в эфирном масле, полученном из фармакологического средства «Ахилон» апробирована в:
КАЛ ОГУП «Фармация» г. Курска (акт об апробации от 10.05.2001 г.);
ГУЗ ЦСККЛС Рязанской области (акт об апробации от06.05.2001).
Результаты исследований внедрены в учебный процесс кафедры фармакогнозии Ярославской медицинской академии (акт от 05.05.2001 г.), а также внедрено в научно-исследовательский процесс испытательного фармацевтического центра «Фармакон» при Курском государственном медицинском университете (акт внедрения № 56 от 12.04.2001.) и рекомендованы для включения в ГФ.
Разработанная методика получения фармакологического средства тысячелистника обыкновенного, обладающего анальгетической, противовоспалительной и антиноцицептивной активностью внедрена в учебный процесс: кафедры фармакогнозии Ярославской медицинской академии (акт от 12.06.2001 г.); кафедры медико-биологических дисциплин Тульского университета (акт от 29.10.2001 г.); кафедры фармакогнозии и ботаники РГМУ им. акад. И.П. Пэапова (акт о внедрении от 14.09.2001.).
Разработан и подготовлен к рассмотрению: проект ФС на «Ахилон»; проект дополнения к фармакопейной статье «Трава тысячелистника обыкновенного».
Положения, выдвигаемые на защиту способы получения липофильного из травы и гидрофильного комплексов биологически активных веществ из шрота тысячелистника обыкновенного под условным названием «Ахилон» и «Ахипол»; экспериментальные данные по изучению качественного и количественного состава биологически активных веществ «Ахилона» и «Ахипола». результаты фармакологического скрининга изучаемых препаратов тысячелистника обыкновенного (антиаллергическая, антимикробная, антиноцицептивная, иммуностимулирующая, протективная и противовоспалительная активность).
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на итоговых научных конференциях молодых ученых и студентов «Актуальные проблемы медицины и фармации» (Курск 1999,2001); на V национальном съезде «Достижения современной фармации и перспективы их развития в новом тысячелетии» (Харьков 1999); на 12-й международной межвузовской научно-практичесой конференции «Новые фармакологические средства в ветеринарии» (Санкт-Петербург,2000); на VIII российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва 2001); на 4-ом конгрессе российской ассоциации аллергологов и иммунологов «Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии (Москва, 2001).
Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно- исследовательских работ Курского Государственного медицинского университета (номер государственной регистрации 219.013.41).
Публикации По материалам диссертации опубликовано 10 работ.
Объем и структура диссертации Диссертационная работа изложена на 167 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (3 главы), общих выводов, списка литературы и приложения. В тексте содержится 44 таблицы и 3 рисунка. Список цитируемой литературы содержит 306 источников, из них 68 на иностранных языках и оформлен согласно ГОСТ 7.1-84, ГОСТ 7.12-77 (СТ СЭВ 2012-79), ГОСТ 7.11-78 (СТ СЭВ 2021-79).
Лечебные свойства биологически активных веществ тысячелистника обыкновенного
Род Тысячелистник (Achillea L.) семейства Asteraceae насчитывает около 200 видов, произрастающих повсеместно в Европе, а также Азии, Северной и Южной Америке (6, 190). На территории России распространено около 18 видов растений рода тысячелистник (5).Наиболее распространенным представителем рода является Тысячелистник обыкновенный - Achillea millefolium L. В СНГ Тысячелистник обыкновенный широко распространен в Европейской части, на Кавказе, в Западной и Восточной Сибири, реже на Дальнем Востоке и в Центральной Азии. Растет на суходольных лугах, лесных опушках, полянах, свежих залежах, обочинах дорог, в парках, молодых посадках, в населенных пунктах (5). Тысячелистник обыкновенный - многолетнее травянистое растение с ползучим разветвленным корневищем, с очередными дважды перисто рассеченными листьями, имеющими двух-трехнадрезные сегменты и почти линейные конечные лопасти. Прикорневые листья черешковые, стеблевые - сидячие. Соцветия - мелкие многочисленные корзинки, собранные в щитки. Краевые ложноязычковые цветки белые, реже розовые, внутренние - трубчатые, желтые, обертки корзинок удлиненно-яйцевидные (210).
В настоящее время научная медицина использует два вида сырья тысячелистника: траву и соцветия (18,37). Траву собирают в фазу цветения, срезая верхушки стеблей до 15 см. При заготовке соцветий срезают отдельные цветочные корзинки и цветы со стеблями не длиннее 2 см. Заготавливать сырье рекомендуется на одном и том же участке несколько лет подряд с перерывом в 1-2 года (18). Сушат сырье под навесом или в сушилках при температуре не выше 50С. Главные районы промысловых заготовок сырья тысячелистника обыкновенного - Башкирия, Поволжье, Украина, Белоруссия, Ростовская и Воронежская области. Запасы сырья значительные. Ежегодно можно заготавливать около 2 тыс.тонн сырья (5). Довольно часто тысячелистник образует заросли на площади в несколько гектаров. Сырьевая база тысячелистника обыкновенного настолько обширна, что позволяет производить его экспорт в страны ближнего и дальнего зарубежья (18, 145, 146, 157).
Тысячелистник обыкновенный издавна применяется в народной и официнальной медицине разных стран. Лекарственные свойства тысячелистника обыкновенного («деревей», «солдатская трава», «белая кашка», «кровавник», «гулявица», «порезная трава») известны еще в Античном мире. С лечебной целью его применяли и применяют во многих странах мира на протяжении тысячелетий от Диоскорида и до наших дней (2). Как ценное лекарственное средство тысячелистник обыкновенный нашел широкое применение на Руси с 14 века для наружного лечения ран, язв и как кровоостанавливающее средство при маточных, геморроидальных, носовых, легочных и других кровотечениях (31,205). Имеются сведения о его применении в урологии, нефрологии, при остром и хроническом цистите, пиелонефрите, уретрите и других заболеваниях, сопровождающихся гематурией. (116, 132). Тысячелистник обыкновенный применяется для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта, при заболеваниях печени (131) и входит в состав сборов для лечения астенических состояний, неврозов и истерий (2). В смеси с другими травами тысячелистник используется для лечения острых респираторных инфекций ( 17), гриппа, вирусных инфекций, бронхиальной астмы (109). При желчно- и почечнокаменной болезни в Сибири используют чай из соцветий тысячелистника обыкновенного (70). В Болгарии и Югославии применяют листья и соцветия в виде настоя, чая и сока как средство, улучшающее пищеварение и обмен веществ, а также при болезнях органов дыхания, сердца, печени, почек, ревматизме, малярии, сахарном диабете, злокачественных опухолях, гельминтозах (90, 199, 227); в Средней Азии - как диуретическое, гемостатическое, противоастматическое и антигельминтное (158, 167); в Иране - при метеоризме и в качестве общеукрепляющего, в Афганистане - при ревматизме (39). В индийской медицине траву тысячелистника обыкновенного используют при респираторных инфекциях, в качестве общеукрепляющего (250), а в тибетской медицине - при сибирской язве и опухолях (11). Народным средством лечения кровоточащих и долгозаживающих ран является свежий сок тысячелистника, а его отвар применяется как лактогонное средство у кормящих матерей и болеутоляющее при зубной боли (2, 44). До настоящего времени тысячелистник обыкновенный в народной медицине излюбленное средство для лечения заболеваний желудочно- кишечного тракта, инфицированных ран, болезней печени, почек, легких, заболеваний центральной нервной системы и гипертонической болезни (2, 109). Трава тысячелистника применяется и в гомеопатии, в качестве диуретического средства при гипертонической болезни, при ревматизме и гипергидрозе (40, 267). Трава и соцветия могут использоваться для лечения сексуальных расстройств у мужчин и для профилактики кадмиевой интоксикации, для лечения кандидозов, острого и хронического панкреатита у детей (229, 233). Данные народной медицины подтверждаются научными исследованиями. В эксперименте доказано гемостатическое, антибактериальное, противовоспалительное, противоожоговое, гипотензивное и другие виды фармакологической активности (68, 69, 153, 174, 191). Водный экстракт в эксперименте тормозит рост опухолей саркомы-45, саркомы М-1 (22), настой проявляет протистоцидную активность (58), ацетоновый экстракт проявляет антибактериальную и антифунгиальную активности (152). Кроме использования в медицине тысячелистник обыкновенный используется в производстве горьких настоек, ликера, сыра и пива (29, 61). Настой, экстракт, эфирное масло нашли применение как биостимуляторы и ароматизаторы в косметике и парфюмерии (71). Сырье тысячелистника обыкновенного (трава и цветки) представлено в 7, 8, 9-м и 11-м изданиях отечественных фармакопей, а также в фармакопеях США, Мексики, ряда стран Западной Европы, в составе британской травяной фармакопеи (226, 232, 249, 255), соцветия тысячелистника обыкновенного являются официнальными в Финляндии и Швеции (79).
Выделение и идентификация сесквитерпеновых лак- тонов «Ахилона»
На моделях острого воспаления, вызванного введением крысам и полного адъюванта Фрейнда, [3-каротин при местном воздействии на кожу оказывает выраженное противовоспалительное действие (154, 203).
Витамину А принадлежит значительная роль в поддержании реактивности организма на высоком уровне. В настоящее время доказана связь между обеспеченностью организма витамином А и характером инфекционного процесса. Установлено, что обеднение корма животных витамином А ухудшает течение экспериментальных инфекций вызванных туберкулезной палочкой, пневмококком и др.
Экспериментально установлено, что недостаток витамина у животных приводит к лейкопении, нейтрофилии, снижению активности комплемента, атрофии тимуса, селезенки, к резкому уменьшению числа тимоцитов в тимусе, антителобразующих клеток в селезенке и лимфоузлах, подавлению барьерной функции лимфоузлов, к замедлению отторжения трансплантатов кожи, к значительному снижению титров антител при иммунизации животных различными антигенами (133).
Введение в организм витамина А повышает устойчивость животных к инфекциям, увеличивает активность фагоцитоза, оказывает стимулирующий эффект на первичный и вторичный иммунный ответ, замедляет разрушение комплемента, предотвращает уменьшение массы тимуса при различных воздействиях на организм (133).
Предполагается, что торможение антителогенеза при дефиците витамина А, обусловлено вначале активацией коры надпочечников, а в последующем нарушением синтеза нуклеиновых кислот и белков (выявлено снижение интенсивности включения меченого тимидина в ДНК лимфоцитов тимуса, селезенки, а также меченых аминокислот в белки) в организме животных даже в присутствии митогенов (133).
Иммуностимулирующий эффект витамина А наиболее четко выражен в случае многократного его введения до иммунизации животного и непосредственно после нее. Также выявлено, что витамин А стимулирует пролиферацию тимоцитов человека in vitro (294). Кроме того, опубликованы данные исследования о том, что введение в организм животных избыточного количества витамина А вызывало инволюцию тимуса и подавление механизмов иммуногенеза, снижение уровня лизоцима в сыворотке крови и фагоцитарной активности лейкоцитов (133). Имеются единичные работы о влиянии витамина А на формирование иммунитета к вирусам (133).
До последнего времени считалось, что основные биологические эффекты, вызванные Р-каротином, обусловлены его биотрансформацией in vitro в витамин А. Однако, постепенно накапливаются данные, свидетельствующие о том, что многие нативные каротиноиды, не превращающиеся в витамин А, также как последний обладают иммуномодулирующими и антиканцерогенными свойствами. Сравнительный анализ экспериментальных исследований и клинических наблюдений показал, что (3-каротин более эффективен и менее токсичен, чем витамин А (172, 173). Малоизученными веществами тысячелистника обыкновенного являются полисахариды.
В настоящее время известно около 20 высших растений, содержащих иммуностимулирующие полисахариды (258). Однако, установлено, что в сравнении с полисахаридами низших растений - грибов, лишайников, водорослей - сложные комплексы полисахаридов высших растений проявляют более высокую иммунную активность (305).
Изучено иммуностимулирующее действие полисахаридных комплексов из растений семейств Asteracae, Polygonaceae, Tiliaceae. Установлено, что введение этих гетерополисахаридов in vivo индуцирует образование и накопление в крови гуморальных иммуностимулирующих факторов, пассивный перенос которых с сывороткой интактным реципиентам индуцирует у них стимуляцию гуморального иммунного ответа к ЭБ. Клетки селезенки крыс, получавших эти комплексы, в отличие от спленоцитов интактных крыс в течение 4 часов инкубации при температуре 37С выделяют в надосадочную жидкость гуморальные факторы, существенно стимулирующие формирование гуморального иммунного ответа (234).
Изучено влияние гетерополисахаридов на выделение иммуностимулирующих факторов в условиях токсического поражения печени. Введение полисахаридов совместно с инъекциями гепатотропного яда индуцирует более усиленную продукцию в инкубационную среду спленоцитами иммуностимулирующих субстанций (234).
Растительные гетерополисахариды влияют на развитие гуморального иммунного ответа, индуцируемого Т-зависимыми и Т- независимыми антигенами, гиперчувствительности замедленного типа, формирование клеток иммунной памяти, развитие антигенспецифической и антигеннеспецифической иммуносупрессии в норме и в состояниях некоторых форм экспериментальной патологии и при состояниях напряжения (50). Также они усиливают или нормализуют развитие гуморальной и клеточной форм иммунного ответа при интенсивных физических нагрузках (53, 99), холодовом стрессе (7, 215), алиментарном и возрастном нарушении липидного обмена, токсическом поражении печени (148, 150).
Кроме того, полисахаридные комплексы из женьшеня стимулируют развитие клеточной и гуморальной форм иммунного ответа (144, 262), усиливают поглотительную и переваривающую функцию мононуклеаров крови, макрофагов печени, селезенки и лимфотических узлов (182, 291, 301), повышают спонтанную и митогениндуцированную пролиферацию лимфоцитов (301, 304). Т.П.Смолиной было изучено интерферониндуцирующее действие полисахаридов корня женьшеня. Установлено, что полисахаридный комплекс обладает свойствами индуцировать синтез интерферона в культуре лейкоцитов человека (183).
Установлено, что полисахаридный комплекс из лабазника шестилепестного коррегирует иммунную реактивность в условиях острой и хронической гепатопатии, вызванной кратковременным или длительным введением четыреххлористого углерода. Кроме того, полисахариды лабазника оказывают выраженные гепатопротекторные и антиоксидантные эффекты в условиях острого и хронического токсического поражения печени, индуцируют появление у фракции клеток селезенки, обогащенных макрофагами, свойств выделять в культуральную жидкость соединений с молекулярной массой более 150 кД и 10-15 кД, стимулирующих процессы физиологической и репара- тивной регенерации и появление у фракции спленоцитов, обогащенных лимфоцитами, свойств выделять в культуральную жидкость иммуносупрессирующие цитокины с молярной массой 50-60 кД (117). В литературе давно описана противовопухолевая активность полисахаридов высших растений (100).
В литературе давно описана противоопухолевая активность полисахаридов высших растений (100). Большой интерес растительные полисахариды представляют для онкологии в связи со способностью некоторых из них стимулировать в терапевтических дозах образование цитолитических Т-лимфоцитов (21). При введении мышам линии BALB полисахаридов тагетана и полюстрана, полученных из растений семейств Rosaceae и Asteraceae, резко возрастает цитолитическая активность лимфоцитов. Имеет место четко выраженная зависимость эффекта от дозы - максимальная активность наблюдается при введении 25 мг/кг, при двухкратном увеличении или уменьшении дозы полисахарида активность несколько снижалась (171). Установлена положительная корреляция между противоопухолевой и иммуностимулирующей активностью растительных полисахаридов, опосредованная стимуляцией противоопухолевой активности Т-клеток (24), лимфокинов, ингибирование активности интерферона и увеличение синтеза фактора некроза опухолей (171).
Получение комплекса водорастворимых полисахаридов (фармакологического средства «Ахипол»)
В ИК-спектре вещества 2 имеются полосы поглощения, характерные для у- лактонного кольца (1780 см 1), кетогруппы (1690 см"1), двойных связей (1640 и 1620 см 1), вторичной ОН-группы (3547 см 1) В ИК-спектре вещества 3 имеются полосы поглощения у-лактон- ного кольца в конъюгации с двойной связью (1750 см 1), сопряжение двойных связей (1663 см 1 и 1638 см"1), ОН-группы (3487 см"1). По результатам проведенных исследований установили, что вещество 1 - матрикарин, вещество 2 - аустрицин, вещество 3 ханфиллин.
Разработка методики количественного определения хамазулена в эфирном масле тысячелистника обыкновенного В литературе описан фотоколориметрический метод определения хамазулена в эфирном масле ромашки аптечной и тысячелистника обыкновенного (76, 200). В условиях перегонки с водяным паром из сесквитерпеновых лактонов в результате дегидратации, дегидрирования и декарбоксилирования образуется хамазулен (1,4-диметил-7-этилазулен), обуславливающий синее окрашивание эфирного масла. По количественному содержанию хамазулена судят о содержании проазуленовых соединений в сырье тысячелистника обыкновенного.
Количественное содержание хамазулена в эфирном масле определяют по калибровочному графику, для построения которого используют раствор 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия в фосфатном буфере (69). К недостаткам существующего метода анализа следует отнести трудоемкость, длительность в исполнении и низкую чувствительность. Метод позволяет достаточно точно определять количество хамазулена с высоким его содержанием в эфирном масле. При низком содержание хамазулена в эфирном масле - дает мало достоверные результаты.
Кроме того, имеются сведения о возможности определения хамазулена в эфирном масле тысячелистника обыкновенного и азиатского методом ГЖХ и спектрофотометрически при длине волны 285 нм и 604 нм (64, 137). В связи с этим нами проведено исследование по разработке методики количественного определения хамазулена в «Ахилоне» и эфирном масле тысячелистника обыкновенного спектрофотометрическим методом по удельному показателю поглощения Е%СМ .
Эфирное масло тысячелистника обыкновенного представляет собой смесь углеводородов, терпенов и терпеноидов, азуленов, кетонов и других соединений. Некоторые из этих веществ имеют максимумы поглощения в УФ области при 225-260, 280-300 нм, что затрудняет использование этих областей при количественном определении хамазулена. В УФ-спектре хамазулена имеются максимумы поглощения при 235-250, 280-290 и 350360 нм. В условиях нашего опыта только максимум при 358 нм может быть использован для определения хамазулена в препарате «Ахилон» и эфирном масле тысячелистника обыкновенного. Эфирное масло, освобожденное от хамазулена, не имеет полосы поглощения при 350-360 нм, что является доказательством того, что другие компоненты эфирного масла не поглощают свет при этой длине волны.
Навеску эфирного масла (5,0 г) растворяли в 10 мл 60%-ной серной кислоты. Полученный раствор помещали в делительную воронку и экстрагировали сопутствующие вещества небольшими порциями петролейного эфира (4 раза по 3 мл). К кислотному остатку прибавляли 150 мл ледяной очищенной воды. Из этого раствора хамазулен четырежды экстрагировали петролейным эфиром порциями по 50 мл. Полученное извлечение высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали, петролейный эфир отгоняли на водяной бане. Остаток растворяли в 10 мл гексана и наносили на колонку, заполненую окисью алюминия (II степени активности по Брокману). Промывали колонку н-гексаном, собирали фракцию, окрашенную в интенсивно синий цвет. После удаления элюента получили жидкое вещество темно-синего цвета. Индивидуальность его была подтверждена методами тонкослойной хроматографии и получением пикрата. Вещество хроматографировали с достоверным образцом на пластинках "Силуфол" в системах растворителей: бензол-этанол-уксусная кислота 45:3,5:4, бензол-этанол 9:1, петролейный эфир (Яг 0,78; 0,73; 0,70). Выделенное вещество на пластинках было окрашено в голубой цвет, а после обработки парами йода - в желто-коричневый
В ультрафиолетовой области спектра гексановый раствор хамазулена имеет максимумы поглощения при 235-250, 280-290, 350-360 нм.
Для получения пикрата хамазулена готовили растворы: а) 100 мг пикриновой кислоты растворили в 2 мл 96% этанола; б) 100 мг хамазулена растворили в 0,5 мл 96% этанола. Растворы нагревали и смешивали. При охлаждении раствора образуется кристаллическая масса. После двухкратной перекристаллизации из абсолютного спирта полученный пикрат имел температуру плавления 115С, соотетствующую таковой пикрата хамазулена.
Определение удельного показателя поглощения (Е 0"] ) хамазулена Для определения удельного показателя поглощения 10 мг хамазулена (точная навеска) помещали в мерную колбу на 10 мл, растворяли в 5 мл гексана и доводили тем же растворителем до метки (раствор А). Из него методом разведения готовили серии растворов с известной концентрацией хамазулена.
Влияние «Ахилона» и «Ахипола» на развитие ГИО при экспериментальной стафилококковой инфекции
В последние годы внимание исследователей привлекают гомогенные и гетерогенные полисахариды. Ряд исследований показывает, что полисахаридные комплексы, выделенные из некоторых растений семейств Аз1егасеае, РаЬасеае, Яозасеае, Ро опасеае, ТШасеае обладают противоопухолевым и иммуномодулирующим действием у здоровых животных, а также при некоторых формах патологии, таких как острое и хроническое токсическое поражение печени, хронических обструктивных болезней легких и др. (13, 15, 223, 224, 300, 305). Среди биологически активных веществ тысячелистника обыкновенного наименее изученным является полисахаридный комплекс.
С целью комплексного и рационального применения лекарственного сырья из шрота травы тысячелистника обыкновенного нами получено фармакологическое средство, условно названное «Ахипол». Для его получения использовали воздушно-сухой шрот травы тысячелистника обыкновенного после экстракции липофильных соединений ацетоном. Получение «Ахипол» проводили по следующей методике: 500,Ог шрота заливали 5л горячей очищенной воды и нагревали на водяной бане в течение 2 часов при периодическом перемешивании. После первого слива вытяжки сырье повторно экстрагировали в тех же условиях. Водные извлечения объединяли и концентрировали в вакууме до 1/3 первоначального объема. Для освобождения от фенольных соединений водное извлечение профильтровали через слой полиамидного сорбента. Из сгущенной вытяжки водорастворимые полисахариды осаждали тремя объемами 96%-ного этанола. Осадок отделяли, растворяли в воде, переосаждали этиловым спиртом, промывали последовательно этанолом различной концентрации, ацетоном, и высушивали в вакуум-сушильном аппарате. Выход составлял 4,8% от веса сухого сырья.
Фармакологическое средство «Ахипол» (полисахаридный комплекс из шрота травы тысячелистника обыкновенного) - аморфный порошок светло-серого цвета, без запаха. Растворим в воде, в водных растворах щелочей и кислот, не растворим в неполярных органических растворителях, осаждается этиловым спиртом. рН 2% водного раствора равно 6,0, зольность 4,0%.
Фармакологическое средство «Ахипол» дает положительные реакции Молиша (187), Фелинга (187, 215). С а-нафтолом после прибавления серной кислоты на поверхности раздела фаз образуется красно-фиолетовое окрашивание; при нагревании раствора с Фелинговой жидкостью выпадает красный осадок закиси меди.
Для идентификации и количественного определения моносахаридов, входящих в состав фармакологического средства «Ахипол» применяли кислотный гидролиз, в процессе которого расщепляются гликозидные связи. Полный гидролиз высших полиоз чаще всего проводится серной кислотой, поскольку она вызывает наименьшие разрушения продукта гидролиза и легко удаляется из гидролизата карбонатом бария.
В полисахаридах могут быть связи различного характера с различной прочностью к гидролизу, однако, большинство высших полиоз полностью гидролизуется при нафевании с 2 н серной кислотой при 100С в течение 2-10 часов. Существуют многочисленные исключения из этих правил. Гидролиз полисахаридов необходимо проводить в наиболее мягких условиях, которые устанавливаются экспериментально. Гликозидные связи, образуемые различными моносахаридами, отличаются по устойчивости. При гидролизе возможна «кислотная реверсия», то есть ресинтез олигосахаров. Поэтому в каждом конкретном случае необходимо проводить работу по изучению условий гидролиза полисахаридного комплекса. Процесс гидролиза полисахаридного комплекса можно контролировать по изменению оптического вращения растворов или по изменению набора Сахаров, обнаруживаемых путем хроматографии на бумаге проб нейтрализованного гидролизата.
Для определения условий гидролиза применяли серную кислоту различной концентрации и определяли время полного гидролиза с помощью хроматографии на бумаге нейтрализованных проб через 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8 часов и по количеству восстанавливащих Сахаров.
Для этого по 0,01 г (точные навески) фармакологического средства «Ахипол» помещали в ампулы и растворяли в 2,5 мл серной кислоты различной концентрации (1-10%). Ампулы запаивали и нагревали при температуре 100С в течение 2-8 часов. После указанного промежутка времени отбирали пробы гидролизата полисахаридного комплекса. После охлаждения содержимое ампул количественно переносили в стаканчик, разбавляли водой до 15 мл. Раствор нейтрализовали сухим бария карбонатом до нейтральной реакции. Осадок сульфата бария отфильтровали, промывали водой. Фильтрат упаривали под вакуумом на водяной бане до 5 мл. Продукты гидролиза (нейтральные сахара) осаждали 15 мл 96% этилового спирта. Сформировавшийся осадок отфильтровывали, фильтрат упаривали до 2 мл (раствор А). Осадок бариевых солей уроновых кислот диспергировали в 5 мл очищенной воды и фильтровали через слой катионита КУ-2 (ЬГ). Элюат, содержащий кислые сахара концентрировали в вакууме при 40-50С до 2 мл (раствор Б).
Раствор А хроматографировали на бумаге в системах растворителей этилацетат-пиридин-вода (12:5:4), пропанол-этилацетат-вода (7:1:2), н- бутанол-пиридин-вода (6:4:3), а раствор Б в системе этилацетат-уксусная кислота-муравьиная кислота-вода (18:3:1:4) с достоверными образцами Сахаров. В качестве проявителя использовали раствор анилингидрофта- лата. Обработанные хроматограммы нагревали в сушильном шкафу в течение 15-20 минут при температуре 100С.
При хроматографировании раствора Б в системе этилацетат-уксусная кислота-муравьиная кислота-вода (8:3:1:4) было идентифицировано одно веществ с =0,31 - глюкуроновая кислота.
Количество восстанавливающих Сахаров определяли спектрофотометрическим методом после реакции моносахаридов с пикриновой кислотой (49), для чего: точную навеску полисахаридного комплекса (около 0,05 г) помещали в коническую колбу, добавляли 10 мл 10% серной кислоты, подсоединяли к обратному холодильнику и нагревали на водяной бане (4-8 часов). Раствор охлаждали и последовательно нейтрализовали 30% раствором гидроксида натрия, 10% раствором серной кислоты и 10% гидроксидом натрия по индикатору конго красный до рН 6,0-7,0. Раствор фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу объемом 25 мл и доводили до метки водой (раствор А).
В плоскодонную колбу вместимостью 50 мл помещали 1 мл 1% раствора пикриновой кислоты, 3 мл 20% карбоната натрия и 1 мл раствора А. Колбу с содержимым помещали в кипящую водяную баню на 10 минут и охлаждали. Содержимое количественно переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили объем до метки водой (раствор Б). Оптическую плотность полученного раствора измеряли при длине волны 460 нм, в кювете с толщиной слоя 10 мм.
Похожие диссертации на Изучение химического состава и биологической активности густого экстракта и шрота травы тысячелистника обыкновенного
![Формакогностическое изучение травы тысячелистника широколопастного [Электронный ресурс]](/i/i/4713/201091.png "Формакогностическое изучение травы тысячелистника широколопастного [Электронный ресурс] Глушко Маргарита Петровна")
