Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Ботаническая характеристика некоторых видов растений рода полынь и применение их в научной и народной медицине
1.1 Ботаническая характеристика растений рода полынь 10
1.1.1 Ботаническое и морфолого-анатомическое описание полыни горькой 10
1.1.2 Ботаническое и морфолого-анатомическое описание полыни обыкновенной 11
1.1.3 Ботаническое и морфолого-анатомическое описание полыни эстрагон 12
1.2 Химический состав растений рода полынь 14
1.2.1 Химический состав травы полыни горькой 14
1.2.2 Химический состав травы полыни обыкновенной 15
1.2.3 Химический состав травы полыни эстрагон 16
1.3. Фармакологические свойства некоторых видов растений рода полынь 17
1.4. Основные направления применения растений рода полынь в народной и научной медицине 19
1.4.1. Применение полыни горькой в официнальной и народной медицине 20
1.4.2. Применение полыни обыкновенной в народной медицине 22
1.4.3. Применение полыни эстрагон в народной медицине 23
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования
2.1. Объекты исследования и экспериментальная модель 25
2.2. Методы исследования
2.2.1. Химические методы 25
2.2.2. Физико-химические методы з
2.3. Фармакологические методы 27
2.3.1. Определение острой токсичности 27
2.3.2. Определение анальгетической активности 27
2.3.3. Определение противовоспалительной активности 28
2.3.4. Определение иммунометаболической эффективности 28
2.3.5. Статистическая обработка 30
ГЛАВА 3. Исследование качественного состава и количественного содержания основных групп биологически активных веществ некоторых видов сырья рода полынь
3.1. Анализ качественного состава биологически активных веществ..31
3.1.1. Извлечение и фракционирование природных соединений 31
3.1.2. Качественное определение полиенов 32
3.1.3. Качественное обнаружение флавоноидов 35
3.1.4. Качественное обнаружение кумаринов 38
3.1.5. Качественное обнаружение сесквитерпеновых лактонов 41
3.1.6. Качественное определение углеводов (водорастворимых полисахаридов, пектиновых веществ) 42
3.1.7. Качественное обнаружение аминокислот 43
3.1.8. Качественное определение органических кислот
3.1.8.1. Обнаружение аскорбиновой кислоты 44
3.1.8.2. Хроматографический анализ органических кислот 45
3.1.8.3. Хроматографический анализ фенолкарбоновых кислот 47
3.1.9. Качественное определение дубильных веществ 49
3.1.9.1. Обнаружение эфирного масла 50
3.1.10. Качественное определение веществ, обладающих антиоксидантной активностью 51
3.2. Анализ количественного содержания биологически активных веществ
3.2.1. Количественное определение каротиноидов и хлорофилл ов 52
3.2.2. Количественное определение флавоноидов 54
3.2.3. Анализ полифенольного состава с использованием ВЭЖХ 56
3.2.4. Количественное определение углеводов (водорастворимых полисахаридов, пектиновых веществ) 59
3.2.5. Количественное определение аминокислот 63
3.2.6. Количественное определение свободных органических кислот
3.2.6.1. Количественное определение аскорбиновой кислоты 66
3.2.6.2. Количественное определение суммы органических кислот .67
3.2.7. Количественное определение дубильных веществ 68
3.2.8. Анализ элементного состава 69
ГЛАВА 4. Получение, изучение химического состава и фармакологической активности комплексов биологически активных веществ из шрота полыни горькой
4.1. Получение липофильной фракции (густого экстракта) и ВПСК...73
4.2. Изучение качественного состава липофильной фракции и ВПСК 75
4.3. Изучение биологической активности комплексов выделенных из шрота 79
4.3.1. Определение острой токсичности комплексов выделенных из шрота 79
4.3.2. Исследование анальгетической активности комплексов выделенных из шрота 81
4.3.3. Изучение противовоспалительной активности комплексов выделенных из шрота 84
4.3.4. Изучение антиоксидантной активности 85
4.3.5. Определение иммуномодулирующей и протективной активностей 88
Выводы 94
Список литературы
- Химический состав растений рода полынь
- Определение острой токсичности
- Качественное определение углеводов (водорастворимых полисахаридов, пектиновых веществ)
- Изучение качественного состава липофильной фракции и ВПСК
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящий период развития российской медицины немало внимания уделяется проблеме применения лекарственных растительных средств, о чем свидетельствует наблюдающаяся в последнее время тенденция к расширению ассортимента отечественных фитопрепаратов. Известно, что лекарственное растительное сырье при достаточной фармакологической эффективности обладает меньшей токсичностью и аллергенностью. В связи с этим поиск новых источников сырья, совершенствование технологии производства, а также комплексное использование уже разрешенных к применению лекарственных растений является актуальной задачей отечественной фармации.
Растения рода Полынь занимают немаловажное место среди лекарственных растений, применяемых в официнальной и народной медицине. Аналитический обзор данных литературы показал, что в научной медицине РФ используется трава полыни горькой для приготовления настойки, применяемой в качестве желчегонного, способствующего усиленной выработке желудочного сока и усиливающего аппетит средства. В этой связи особое внимание привлекает возможность ресурсосберегающего использования отходов промышленной переработки (шрота) уже разрешенного к применению лекарственного растительного сырья, что требует совершенствования технологических схем производства как существующих, так и вновь разрабатываемых лекарственных препаратов.
Поэтому сравнительное исследование химического состава и фармакологической активности травы и шрота полыни горькой после получения настойки является актуальной задачей.
Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в изучении возможности безотходного комплексного использования сырья полыни горькой в качестве потенциального источника для создания фитопрепаратов с различными видами активности.
Для достижения цели решались следующие задачи:
- провести сравнительный фитохимический анализ травы и шрота полыни горькой после получения настойки;
- определить количественное содержание основных групп биологически активных веществ в изучаемом сырье;
- исследовать некоторые виды фармакологической активности комплексов биологически активных веществ (БАВ), получаемых из шрота полыни горькой с помощью экстрагентов различной полярности.
Научная новизна. Проведен сравнительный фитохимический скрининг травы полыни горькой и шрота полыни горькой после получения настойки. Установлено, что фракции, полученные с использованием экстрагентов различной полярности, содержат разнообразный набор биологически активных веществ, отличающихся качественным составом и количественным содержанием.
Выделены и изучены с помощью хромато-масс-спектрометрического метода анализа липофильный и водорастворимый полисахаридный комплекс (ВПСК) шрота и травы полыни горькой.
В составе липофильной фракции травы и шрота полыни горькой установлено наличие 62 и 53 соединений соответственно: жирных кислот, стеринов, спиртов, тяжелых терпеноидов.
Определены качественный состав и особенности структуры ВПСК шрота полыни горькой; ВПСК шрота содержит моносахариды циклической (пиранозной, фуранозной) и линейной структуры, органические кислоты, уроновые кислоты.
Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) установлено, что трава и шрот полыни горькой отличается качественным составом и количественным содержанием полифенольных соединений. В шроте содержится 13 из 20 содержащихся в траве полыни горькой производных
2-фенилбензо--пирона, бензо--пирона, дубильных веществ и фенолкарбоновых кислот, количественное содержание которых в шроте
в 3,1 раза меньше, чем в траве.
В траве и шроте полыни горькой методом ВЭЖХ установлено наличие не менее 15 аминокислот, 9 из которых являются незаменимыми. Определен широкий набор и значительные количества микроэлементов.
На основании проведенных исследований впервые для полыни горькой предложен новый вид сырья – шрот полыни горькой.
Для выделения комплексов БАВ из шрота полыни горькой подобраны условия оптимизации процессов экстракции (природа экстрагента, степень измельчения сырья, число ступеней экстракции, временной режим экстракции, соотношение сырья и экстрагента).
Экспериментально установлено, что липофильный (комплекс А) и гидрофильный (комплекс В) комплексы, выделенные из шрота полыни горькой, при отсутствии токсичности проявляют анальгетическую, противовоспали-
тельную, антиоксидантную, иммуномодулирующую и протективную активности.
Проведенные исследования показали перспективность применения ресурсосберегающих технологий в фармацевтической промышленности с целью создания новых лекарственных средств на основе сырья полыни горькой.
Практическая значимость работы. Научные исследования по расширению видов сырья полыни горькой проведены в рамках совместного научного сотрудничества по заказу ЗАО «Ярославская фармацевтическая фабрика».
В целях рационального и ресурсосберегающего использования сырья полыни горькой предложен новый вид сырья – шрот полыни горькой.
Выявлена перспективность использования комплексов БАВ из шрота полыни горькой для получения фитопрепаратов, обладающих различной фармакологической активностью.
Полученные результаты апробированы в ФГБУ ИМЦ ЭУАОСМП Росздравнадзора (курский филиал) и представлены на ЗАО «Ярославская фармацевтическая фабрика»; внедрены в учебный и научный процесс кафедр: фармако-гнозии с курсом ботаники Рязанского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова, фармацевтической химии и фармакогнозии ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», фармакогнозии и фармацевтической технологии Ярославской государственной медицинской академии.
Основные положения, выносимые на защиту. На защиту выносятся следующие положения, характеризующиеся научной новизной:
- результаты сравнительного химического анализа травы полыни горькой и шрота полыни горькой после получения настойки;
- результаты количественного определения БАВ в траве и шроте полыни горькой;
- результаты изучения некоторых видов фармакологической активности комплексов БАВ.
Апробация работы. Основные материалы диссертации представлены на научной международной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Бангкок, Паттайа (Таиланд), 2010 г.); 4-й Всероссийской с международным участием научно-методической конференции «Фармобразование-2010» (Воронеж 2010 г.); II съезде натуротерапевтов России «Современная натуротерапия с позиции доказательной медицины» (Москва, 2011 г.); 77 Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и современность», проводимой в рамках «Недели медицинской науки» КГМУ (2012 г.); II Международной научно-практической конференции «Кластерные подходы фармацевтического союза: образование, наука и бизнес» (Белгород, 2012 г.), на конференции кафедры фармацевтической, токсикологической аналитической химии ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Минздрава России.
Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 11 научных работах, в том числе 6 в рецензируемых журналах.
Личный вклад автора. Автор принимал участие в определении цели исследования и путей ее реализации, планировании и выполнении эксперимента. Автором проводились фитохимические и фармакологические виды исследования, анализ, статистическая обработка, научное обоснование и обобщение полученных результатов.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Выполненная работа соответствует паспорту специальности 14.04.02 – «фармацевтическая химия, фармакогнозия» (фармацевтические науки): пункт 5 – «Изучение вопросов рационального использования ресурсов лекарственного растительного сырья с учетом влияния различных факторов на накопление биологически активных веществ в сырье» и пункт 6 – «Изучение химического состава лекарственного растительного сырья, установление строения, идентификация природных соединений, разработка методов выделения, стандартизации и контроля качества лекарственного растительного сырья и лекарственных форм на их основе».
Связь задач исследований с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Объем и структура диссертации.
Диссертационная работа изложена на 126 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), собственных исследований (главы 3-4), общих выводов, списка литературы. В тексте содержится 29 таблиц, 4 рисунка. Список литературы состоит из 216 русскоязычных источников и 42 источников иностранной литературы.
Химический состав растений рода полынь
Полынь обыкновенная (Artemisia vulgaris L.) - многолетнее травянистое растение до 2 метров высоты, с цилиндрическим многоглавым корневищем и несколькими прямостоячими стеблями, образующими куст. Расположение листьев очередное. Листья эллиптические, перисторассеченные на крупнозубчатые или лопастные доли. Листья в соцветиях трех- или пятирассеченные; верхние: цельные, ланцетные. Жилкование сетчатое. Опушение сверху голые или негусто волосистые; с нижней стороны беловойлочные. Листья сверху зеленого, снизу серовато-белого цвета. Стебель ребристый, коротковетвистый, с густым опушением серовато-зеленого цвета. Цветки: продолговатые корзинки образующие метельчатое соцветие, листочки обертки по краю пленчатые, наружные яйцевидные, заостренные; внутренние длиннее, эллиптические, тупые. Строение цветка: краевые пестичные с узкотрубчатым венчиком; средние - обоеполые с 5 лопастями. Тычинок 5 с пыльниками. Пестик с нижней одногнездной завязью и 2 отогнутыми наружу рыльцами. Цвет красноватый. Цветет в июле - августе, плоды созревают в августе - сентябре [52,59,194]. Размножается семенами и вегетативно. В листьях - клетки эпидермиса с извилистыми стенками, эпидермис листа устьица аномоцитного типа с нижней стороны. Эфиромасличные железки в верхнем эпидермисе редко расположенные по листовой пластинке, в нижнем эпидермисе овальные. Характерны многочисленные Т-образные головчатые, простые и войлочные волоски [168,194,197].
Считается, что полынь обыкновенная происходит с востока Европы и запада Азии. В настоящее время распространена в умеренной климатической зоне по всему миру. Масло получают во Франции, в Марокко, Германии, Венгрии, Индии, Китае и Японии. Распространена в европейской части России, Западной и Восточной Сибири, Средней Азии и Казахстане. Растет на пустырях, в садах, огородах и посевах как сорняк, по лесным опушкам, вдоль дорог, по сырым кустарниковым местам, берегам рек. Народные названия полыни: чернобыль, бурьян, чернобыльник [52,54,194].
Полынь эстрагон или тархун (Artemisia dracunculusL.) - многолетнее травянистое растение хорошо кустится, легко переносит весенние и осенние заморозки. Все растение голое, зеленое, иногда в молодом состоянии опушенное. Высота стеблей достигает 120-130 см, немногочисленные, прямостоячие, ребристые, в средней и верхней части ветвистые. Листья 2-5 см длиной, 1-10 см шириной, линейно-ланцетовидные, узкие, заостренные, длинные, зеленые, сочные, мясистые, ароматные, с приятным пряным, вкусом [148,149,153,157,198]. Цветки беловатые собраны в многочисленных мелких шаровидных, корзинках, составляющее узкометельчатое соцветие. Обертка корзинки гладкая, наружные листочки ее продолговатые, внутренние - округло-овальные с широким пленчатым краем. Лист имеет изолатеральный тип строения. Мезофилл состоящий из столбчатой паренхимы, располагается симметрично с обеих сторон листа в два ряда. Губчатая паренхима расположена мелкими участками вблизи центральной жилки. В листе эпидермис покрывается толстым слоем кутикулы. Вокруг сосудисто-волокнистых пучков имеются эфиромасличные вместилища. Эпидермис листа с извилистыми стенками, устьица аномоцитного типа располагаются с обеих сторон. Лист опушен крупными звездчатыми волосками [181]. Стебель характеризуется наличием сосудистых пучков. Пучки коллатерального типа, с развитой склеренхимой, расположены покругу. Сердцевина имеет тонкостенные паренхимные клетки. В корковой части расположена уголковая колленхима, достаточно выраженный слой эндодермы и эфиромасличные вместилища. Эпидермис стебля выстлан удлиненными, практически прямоугольными клетками, покрытые кутикулой. Иногда встречаются округлые устьичные клетки и зведчатые волоски. Соцветия - шаровидные корзинки [148,153,181]. Листочки обвертки имеют черепитчатое расположение, твердую центральную часть и тонкую, перепончатую периферическую часть. Клетки эпидермиса имеют прямостенное строение. В центральной части листочка обвертки расположены эфиромасличные вместилища [119,182,183]. Цветоложе мясистое, выпуклое, содержит крупные, развитые железистые волоски. По краю цветоложа расположены пестичные цветки, в центре - обоеполые цветки с пятилепестным сросшимся венчиком, на лепестках встречается большое количество эфиромасличных железок. Цветки присоединены к цветоложу валиками-корзинками, которые состоят из рядов прямоугольных клеток. Рыльце пестика серединного цветка двулопастное, с выраженными выростами имеющее сосочковидное строение. В середине каждой лопасти расположены эфиромасличные вместилища [119,182,183]. Цветет растение во второй половине лета, плод - семянка. Цветки у него невзрачные, в холодном климате редко раскрываются полностью, семена нежизнеспособные.
Полынь эстрагон распространена в Европе и Средней Азии. В России трава тархуна произрастает в Сибири, Европейской части, преимущественно в южных районах, на Дальнем Востоке [153]. Полынь эстрагон растет на лесных опушках, лесах, зарослях степных кустарников, луговых степях, берегах рек, отмелях, речных террасах, луговых залежах, каменистых склонах, разводится на огородах [148]. Растение культивируется как пряно-ароматическое растение во многих странах Западной Европы, Азии, Северной Америки, Закавказье [149,153].
Определение острой токсичности
Для определения углеводов использовали предварительно очищенные от полифенольных соединений водные извлечения из травы и шрота полыни горькой, травы полыни обыкновенной и полыни эстрагон. Для чего водные извлечения пропускали через колонку с 6 г алюминия оксида [224].
Свободные сахара определяли:
1. Реакцией Бертрана: при нагревании на водяной бане 1 мл очищенного водного извлечения и 1 мл жидкости Фелинга выпадает оранжево-красный осадок меди (I) оксида.
2. Реакцией с реактивом Несслера: к 1 мл очищенного водного извлечения прибавляли 1 мл реактива Несслера и нагревали на кипящей водяной бане. При наличии в извлечении свободных Сахаров должен выпасть черный осадок ртути (I) оксида.
Обе реакции с очищенными водными извлечениями из травы и шрота полыни горькой, травы полыни обыкновенной и полыни эстрагон дают положительный результат.
Связанные сахара определяли реакцией с реактивом Фелинга и с 20% спиртовым раствором а-нафтола.
А) К 1 мл очищенных водных извлечений прибавляли по 1 мл 10% кислоты серной и нагревали на кипящей водяной бане в течение 5 мин. После охлаждения к гидролизату добавляли 1 мл жидкости Фелинга. При исследовании очищенных водных извлечений из исследуемого сырья происходило увеличение осадков, что свидетельствует о присутствии Сахаров в связанном виде.
Б) К 1 мл водных извлечений прибавляли 20% спиртовый раствор а-нафтола, а затем по каплям кислоту серную. Положительная реакция с а-нафтолом (красное кольцо на поверхности раздела фаз) подтверждает наличие в исследуемом сырье Сахаров в виде гликозидов.
В) К 10 мл водных извлечений исследуемых видов сырья прибавляли 30 мл 96% спирта этилового, перемешивали, появлялись хлопьевидные сгустки, выпадающие в осадок при стоянии. Эта реакция указывает на присутствие в изучаемых видах сырья водорастворимых полисахаридов. Для обнаружения крахмала 5,0 г измельченного сырья помещали в коническую колбу и нагревали на кипящей водяной бане с 50 мл воды очищенной. Полученное извлечение отфильтровывали и пропускали через колонку с 10 г алюминия оксида. При добавлении к 1 мл очищенного водного извлечения 1 капли 0,1 М раствора йода наблюдалось появление синего окрашивания, что говорит о присутствии крахмала в исследуемых объектах [39,41,159,256].
Для определения аминокислот использовали водные извлечения из травы и шрота полыни горькой, травы полыни обыкновенной и полыни эстрагон, очищенные от полифенольных соединений.
1. Качественной реакцией на аминокислоты является реакция с 0,25% этанольным раствором нингидрина. При нагревании на водяной бане равных объемов водного извлечения и 0,25% этанольного раствора нингидрина и последующим охлаждением, в присутствии аминокислот появляется и усиливается красно-фиолетовое окрашивание. К 1 мл очищенных водных извлечений из исследуемых видов сырья прибавляли по 1 мл 0,25% этанольного раствора нингидрина и нагревали на кипящей водяной бане в течение 5 минут. В результате реакции появлялось красно-фиолетовое окрашивание, постепенно усиливающееся. Реакция была положительной во всех извлечениях [222].
Хроматографический анализ осуществляли методом тонкослойной хроматографии на пластинках «Silufol» в системах растворителей: н-бутанол - уксусная кислота - вода (12:3:5) и н-бутанол - пиридин - вода (1:1:1) с достоверными образцами аминокислот. Хроматограммы высушивали на воздухе, обрабатывали 0,25% этанольным раствором нингидрина и инкубировали в сушильном шкафу при температуре 100-105С в течение 5 минут. Аминокислоты появлялись в виде красно-фиолетовых пятен. По результатам хроматографического анализа установлено, что шрот и трава полыни горькой, трава полыни обыкновенной и полыни эстрагон содержат не менее 15 аминокислот.
3.1.8. Качественное определение органических кислот 3.1.8.1. Обнаружение кислоты аскорбиновой
Качественное определение кислоты аскорбиновой в траве и шроте полыни горькой, траве полыни обыкновенной и полыни эстрагон проводили с помощью качественных реакций. Для этого готовили водные извлечения по следующей методике: к навеске (около 5 г) измельченного изучаемого сырья добавляли 50 мл воды очищенной. Полученную смесь настаивали 10 минут, затем фильтровали.
1. Реакция с калия перманганатом: К 1 мл реактива перманганата калия добавляли извлечение сырья содержащее кислоту аскорбиновую. Наблюдали обесцвечивание раствора (восстановление марганца доМп ). Результат реакции: реакция положительна [47,48,49].
2. Реакция с раствором иода: К 1 мл раствора иода добавляли извлечение сырья содержащее кислоту аскорбиновую. Наблюдали обесцвечивание раствора. Результат реакции: реакция положительна [47,48,49]. 3.1.8.2. Хроматографический анализ органических кислот
В водных извлечениях из шрота и травы полыни горькой, травы полыни обыкновенной и полыни эстрагон, полученных методом настаивания, определяли наличие свободных органических кислот методом восходящей тонкослойной хроматографии.
На линию старта хроматографической пластинки «Sorbfil», размером 15x15, наносили по 10 мкл исследуемого извлечения и 0,05% растворов аскорбиновой, щавелевой, муравьиной, лимонной и яблочной кислот.
Пластинки высушивали на воздухе в течение 10 минут, помещали в камеру для хроматографирования со смесью растворителей 95% этиловый спирт - аммиак концентрированный (16:4,5), предварительно насыщенную в течение 3 часов, и хроматографировали восходящим способом. При достижении фронта растворителей 14 см, пластинки вынимали из камеры, высушивали на воздухе до полного удаления растворителя. Высушенные хроматографические пластинки обрабатывали раствором бромкрезолового зеленого. На хроматограммах наблюдали появление желтых пятен на синем фоне, характерных для органических кислот (рис. 3.2).
На хроматограмме водные извлечения из травы полыни горькой, полыни обыкновенной и полыни эстрагон давали 6 пятен с Rf 0,17;Rf 0,25;Rf 0,3;Rf0,38;Rf 0,56;Rf 0,87; 5 из которых сопоставимы с Rf достоверных образцов щавелевой (Rf 0,17), аскорбиновой (Rf 0,25), яблочной (Rf 0,38), янтарной (Rf 0,87) кислот. Вещество с Rf 0,56 не идентифицировано
Качественное определение углеводов (водорастворимых полисахаридов, пектиновых веществ)
При разработке способа получения суммы биологически активных веществ применяли метод дробной мацерации. Получение липофильной фракции. Проведены исследования по выбору оптимальных условий экстракции биологически активных веществ из шрота и травы полыни горькой [18]. Оптимальные условия экстракции подбирали, изучив влияние соотношения сырья и экстрагента, кратности экстракции, вида экстрагента и длительности экстракции на полноту извлечения экстрактивных веществ, каротиноидов и хлорофиллов.
Для этого 10,0 г шрота полыни горькой (степень измельчения частиц 1 мм) заливали 10-ти, 12-ти, 15-ти или 20-кратным количеством экстрагента и оставляли для настаивания 24 часа, 48 часов при комнатной температуре. Для определения зависимости выхода липофильной фракции от используемого экстрагента использовали диэтиловый эфир, ацетон, 90% этиловый спирт, смесь ацетон - гексан (1:1). По истечении времени настаивания извлечение сливали, фильтровали и определяли в нем количество экстрактивных веществ, каротиноидов и хлорофиллов. Результаты представлены в табл.17 и 18. Таблица 17 Влияние вида экстрагента и длительности экстракции на степень извлечения биологически активных веществ
Экстрагент Содержаниеэкстрактивныхвеществ, % Содержаниекаротиноидов,мг/ЮОг Содержаниехлорофиллов,мг/ЮОг часа 48часов 24 часа 48 часов 24 часа 48 часов - средние результаты из 5 определений Установили, что в качестве экстрагента целесообразно использовать смесь ацетон-гексан (1:1) и настаивать в течение 24 часов, при этом достигается наиболее полное извлечение экстрактивных веществ и пигментов.
Количество сливов должно быть не более 3-х, так как в 4-м сливе экстрактивные вещества практически отсутствуют.
Результаты проведенных исследований показали, что оптимальной является следующая методика получения липофильной фракции: 10 г сырья поместили в плоскодонную колбу с притертой пробкой, залили смесью ацетон-гексан (1:1) в соотношении 1:15 и оставили при периодическом перемешивании на 24 часа. По истечении этого времени вытяжку слили, а сырье вновь залили экстрагентом до сохранения соотношения 1:15 и оставили на 24 часа. Через 24 часа вытяжку слили. Аналогично проводили 3-й слив. Вытяжки упарили под вакуумом при температуре водяной бани 40С до состояния густого экстракта.
Полученная субстанция условно названа «Комплекс А». Данное средство представляет собой густую малоподвижную массу зелено-бурого цвета.
Получение комплекса водорастворимых полисахаридов. Полисахаридный комплекс из шрота и травы полыни горькой получали по методике, описанной в главе 3. ВПСК (комплекс В) представляет собой аморфный порошок светло-серого цвета, без запаха. Растворим в воде, в водных растворах щелочей и кислот, не растворим в неполярных органических растворителях, осаждается этиловым спиртом .
Определение химического состава липофильной фракции проводили с помощью хромато-масс-спектрометрического метода анализа. Для этого извлечения упаривали под вакуумом досуха. Сухие экстракты (3-5 мг - точные навески) обрабатывали 0,4 мл 1 М раствора соляной кислоты в метаноле при 80С в течение 180 мин (кислый метанолиз). Образовавшиеся при метанолизе метиловые эфиры жирных кислот и другие липидные компонен 76 ты экстрагировали гексаном. Гексан упаривали, а сухой остаток силилировали в 20 мкл БСТФА (бис-(триметилсилил)трифторацетамид) в течение 15 минут при 80С и разбавляли гексаном до 100 мкл. Для анализа 1 мкл смеси вводили в инжектор системы хромато-масс-спектрометра, работающего в автоматическом режиме.
Водорастворимые полисахариды шрота и травы полыни горькой (3-5 мг - точные навески) обрабатывали 0,4 мл З М раствора кислоты хлороводородной в метаноле при 100С в течение 180 минут (кислый метанолиз). Отбирали по 80 мкл полученных растворов, в каждый добавляли по 160 мкл метанола и упаривали досуха при 50С. Сухие остатки силилировали в 20 мкл БСТФА в течение 15 минут при 80С и разбавляли гексаном до 100 мкл. Для анализа по 2 мкл смесей вводили в инжектор системы газового хроматографа - масс-спектрометра в автоматическом режиме.
Хромато-масс-спектрометрический анализ проводили на хромато-масс-спектрометре АТ-5850/5973 AgillentTechnologies (США). Масс-спектрометр квадрупольный с диапазоном масс 2-950 а.е.м. имеет разрешающую способность 0,5 а.е.м. во всем рабочем диапазоне. Ионизация электронами 70 эВ. Чувствительность прибора составляет 0,01 нг по метилстеарату. Для хроматографического разделения пробы использовали капиллярную колонку из плавленого кварца длиной 25 м и внутренним диаметром 0,25 мм. Неподвижная фаза HP-5ms Хьюлетт-Паккард с толщиной слоя 0,2 мкм. Хро-матографирование проводили в режиме программирования температуры от 135 до 320С со скоростью 7 град/мин. Температура инжектора и интерфейса 280С. Обработку данных проводили с помощью штатных программ прибора. Вещества в хроматографических пиках идентифицировали с помощью библиотечных программ с базой данных масс-спектров NIST.
Изучение качественного состава липофильной фракции и ВПСК
Полученные результаты свидетельствуют о достаточно высокой протективной активности выделенных комплексов.
Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что липофильный и гидрофильный комплексы, изучаемые из шрота полыни горькой проявляют выраженные антиоксидантную и иммуностимулирующую активности, наряду с этим показано, что выделенные комплексы проявляют и другие виды фармакологической активности: анальгетическую, противовоспалительную.
Активное влияние липофильного комплекса (комплекса А) на иммунометаболические процессы у инфицированных стафилококком животных, получавших или не получавших антибиотик можно объяснить его оригинальным составом: каротиноиды, хлорофиллы, сумма насыщенных и ненасыщенных жирных кислот. Известно, что предшественниками витаминов А являются каротины. Каротины - это природные пигменты, синтезирующиеся микроорганизмами и растительными клетками. Широко распространен и хорошо изучен Р-каротин - метаболический предшественник витамина А. Антиоксидантные свойства каротиноидов свидетельствуют об их участии во многих внутриклеточных процессах. В основе этого лежит их высокая неспецифическая активность и тропность к свободным радикалам [248].
Биохимические эффекты, вызываемые каротиноидами, в значительной степени обусловлены их способностью встраиваться в мембранные структуры клеток. Включение Р-каротина в двойной фосфолипидный слой мембраны увеличивает его текучесть вследствие снижения упорядоченности расположения алкильных цепей. Ориентация молекул каротиноида в мембране является существенным фактором ее антиоксидантной активности вследствие изменения характера контакта с алкильными цепями фосфолипидов, увеличение текучести мембраны влияет на конформацию, а следовательно, и на активность мембранных белков [26,30,66,246].
Витамин А стимулирует развитие гуморального и клеточного иммунного ответа. Адъювантные свойства витамина А проявляются у разных видов животных (мышей, крыс, кроликов) при различных способах введения (внутрижелудочном, внутримышечном, внутривенном) в отношении растворимых (столбнячный и стафилококковый анатоксины, сывороточный и яичный альбумины) и корпускулярных (эритроциты, бактерии, вирусы) антигенов. Витамин А является эссенциальным фактором активации лимфоцитов. Он усиливает пролиферативный ответ лимфоцитов на КоА и митоген локоноса. Действие витамина А опосредуется Т-хелперами и В-клетками.
В организме животных и человека каротиноиды не синтезируются. Они должны регулярно поступать в организм с пищей или в виде лекарственных препаратов, так как выполняют жизненно важные функции. Длительное время считали, что основная функция каротиноидов в животном организме обусловлено их способностью превращаться в витамин А, участвующего в процессах фоторецепции, регуляции пролиферации и дифференцировки клеток. В настоящее время установлено, что каротиноиды обладают независимыми от витамина А биологически значимыми свойствами. В организме животных и человека они действуют как фотопротекторы и антиоксиданты, на молекулярном и клеточном уровнях предотвращают генетические трансформации, индуцированные окислителями, гепатотоксическими веществами, ионизирующим и ультрафиолетовым излучением, поддерживают резистентность организма к действию мутагенных и канцерогенных агентов, способствуют экономному расходованию антиоксидантных витаминов и ферментов, проявляют антистрессорные свойства.
Особое внимание в последнее время уделяют иммуномодулирующим и противоопухолевым свойствам ретиноевой кислоты, являющейся физиологическим лигандом ретиноидных рецепторов, относящихся к суперсемейству ядерных рецепторов. Ретиноевая кислота рассматривается как системная регуляторная молекула, участвующая в обеспечении гомеостаза Т-клеточного звена иммунной системы [242].
Иммуномодулирующий и антиоксидантный эффекты водорастворимого комплекса (комплекса В) можно объяснить содержанием большого количества полисахаридов [241]. Экспериментальные и клинические исследования показали, что полисахариды из грибов, водорослей, лишайников и высших растений обладают иммуностимулирующей, противоопухолевой, радиопротекторной, гепатопротекторной, антиоксидантной и антисклеротической активностью [66,235,242]. Одним из механизмов иммуностимулирующего и противоопухолевого действия растительных полисахаридов является их прямое или опосредованное влияние на макрофаги или систему комплемента.
Полисахариды 23 из 25 исследованных видов высших растений активировали функции макрофагов in vivo и in vitro. Это выражалось в виде повышения фагоцитарной и секреторной активности, продукции активных форм кислорода и оксидов азота секрецией цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, ФНО-а) и интерферонов (ИФН-у, ИФН-р-2), повышением цитотоксической активности противоопухолевых клеток и микроорганизмов. Выделены растительные полисахариды, увеличивающие образование гранулоцитарно-макрофагальных колониеобразующих клеток и гемопоэтических предшественников моноцитарного ряда в селезенке и костном мозге. Некоторые растительные полисахариды индуцируют экспрессию макрофагального колониеобразующего фактора и фактора, активирующего дифференциацию промоноцитарных клеток [176].
Только из растений двух семейств выделены полисахариды, ингибирующие фагоцитарную и секреторную активность макрофагов.
Приведенные данные свидетельствуют о том, что стимуляция функциональной активности макрофагов - это характерное свойство большинства растительных полисахаридов. Для большинства растительных полисахаридов характерна множественность механизмов влияния иммунологической функции. Они активируют Т- и В-лимфоциты, естественные киллерные клетки, макрофаги, стимулируют секрецию щитовидной железы и антител посредством связывания с CR3 рецептором лимфоцитов, оказывают влияние на внутриклеточную концентрацию Са , цАМФ, цГМФ, NO простагландины Е2 [131].
![Фармакогностическое изучение полыни австрийской как источника фармакологически активных сесквитерпеновых лактонов [Электронный ресурс]](/i/i/4372/184855.png "Фармакогностическое изучение полыни австрийской как источника фармакологически активных сесквитерпеновых лактонов [Электронный ресурс] Коновалов Юрий Борисович")
