Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Современное состояние исследований в области систематики, химии и фармакологии рода Artemisia L. и полиморфного комплекса видов A. maritima L. s. 1 13
1.1.1. Ботаническая характеристика рода Artemisia L. и полиморфною комплекса видов A. maritima L. s. 1 13
1.1.2. Химический состав видов полиморфного комплекса A. maritima L. s. I 21
1.12 1 Тврпеноиды 21
112 2 Фенольные соединения 25
1.1. 2 3 Полиацетиленовые соединения 26
1.1.3. Использование Artemisia santonica L. и близких видов в народной и
научной медицине 31
1.2. Современные методы выделения, идентификации и количественного определения сесквитерпеновых лакгонов в лекарственном растительном сырье 33
1.2.1. Методы выделения 33
1.2.2. Методы качественного и количественного анализа 34
12 2 1 ВЭЖХ с УФ обнаружением 34
/ 2 2 2 Комбинированные с ВЭЖХ методы ВЭЖХ - МС и ВЭЖХ - ЯМР 36
1 2 2 3 Суперкритическая жидкостная хроматография и мицеллярная
электрокинетическая хроматография 37
12 2 4 Газовая хроматография 38
12 2 5 Хроматография в тонком слое сорбента 39
Выводы по обзору литературы ; 41
Глава 2. Объекты и методы исследования 42
2.1. Объект исследования 42
2.2. Методы исследования 43
2.2.1. Биологические методы исследования 43
2.2.1.1. Методы ресурсоведческого исследования 43
2 2 1 2 Метод фенологических наблюдений 45
2.2.2. Методы обнаружения и идентификации биологически активных соединений 45
2 2 21 Приготовление водных извлечений для проведения качественных реакций. 45
2 2 2 2 Приготовление спиртоводных извлечений и фракционирование природных соединений органическими растворителями
2 2 2 3 Сесквитерпеновые лактоны
2.2.2.4 Ф.пшоноиды 47
2.2.2 5 Фенолкарбоновые кис юты 48
22 2 6 Кумарины 48
2.2 2.7 Тритерпеноиды 48
2.2.2.8 Органические кислоты 49
2.2.3. Хроматографические методы г 49
2.2 3 1 Методы бумажной и тонкослойной хроматографии 49
2 2 3 2 Метод препаративной хроматографии 50
2 2 3 3 Метод планарной хроматографии (современной ТСХ) 50
22 34 Метод ВЭЖХ 51
2 2 3 5 Метод хромато-масс-спектрометрии 52
2.2.4. Спектральные методы — .„.52
2 2 4 1 Метод УФ-спектрофотометрии 52
2 2 4 2 Метод ИК-спектроскопии 53
2 2 4 3 Атомно-абсорбционная спектрография 53
2.2.5. Методы количественного определения 53
2 2 5 1 Титриметрические методы 1 53
2.2.5.2 Весо-объемный метод 53
2 2 5 3 Гравиметрические методы 53
2.2.6. Фармакологические методы исследования 54
2 2 6 1 Изучение острой токсичности 54
2 2 6 2 Изучение влияния суммы сесквитерпеновых лаптопов на динамику
скорости мозгового кровотока 54
2.2.6.3 Изучение антимикробной активности 55
2 2 6 4 Изучение противотуберкулезной активности 55
2 2 6 5 Исследование антиоксидантной активности 56
2.2.7. Методы стандартизации сырья 58
2.2.7.1 Методы отбора проб для анализа : 58
2 2.7.2 Методы морфолого-анатомического исследования 58
2.2.7.3 Определение числовых показателей качества сырья 59
2 2 7.4 Определение микробиологической чистоты сырья 60
2 2 7 5 Определение содержания радионуклидов 60
2 2 7 6 Определение сроков хранения сырья 60
2.2.8. Статистическая обработка данных 60
ГЛАВА 3. Химическое изучение биологически активных соединений травы полыни сантониковой 62
3.1. Изучение эфирного масла полыни сантоннковой 62
3.1.1. Выделение и идентификация эфирного масла«.. 62
3.1.2. Определение количественного содержания эфирного масла 66
3.1.3. Изучение динамики накопления эфирного масла в траве полыни сантоннковой « 66
3.2. Изучение сссквнтсрпсновых лаптопов полыни сантоннковой 68
3.2.1. Выделение сесквитерпеновых лактонов из травы полыни сантоннковой
3.2.2. Идентификация н характеристика выделенных сесквитерпеновых
лактонов из травы полыни сантоннковой 76
3.2.3. Изучение динамики накопления суммы сесквитерпеновых лактонов, сантонина и тауремизина .80
3.3. Изучение фенольных соединений полыни сантоннковой 82
3.3.1. Идентификация фенольных соединений 82
3.3.2. Количественное определение флавонондов 90
3.3.3. Количественное экстракционно-спектрофотометрическое определение
суммарного содержания фенолкарбоновых кнелот в присутствии флавонондов —«.«— 94
3.4. Изучение трнтерпеновых соединений полыни сантоннковой 97
3.4.1. Идентификация трнтерпеновых соединений..« 97
3.4.2. Количественное определение тритерпенондов —97
3.5. Изучение полисахаридов полыни сантоннковой... 100
3.5.1. Количественное определение суммы полисахаридов полыни сантоннковой —.—— 102
3.6. Изучение дубильных веществ полыни сантоннковой 103
3.7. Изучение органических кислот полыни сантоннковой 104
3.7.1. Идентификация органических кислот .104
3.7.2. Количественное определение содержания органических кислот 104
3.8. Изучение элементного состава травы полыни сантоннковой 105
Выводы по главе 3 108
ГЛАВА 4. Фармакологические исследования травы полыни сантоннковой
4.1. Изучение острой токсичности суммы сесквитерпеновых лактонов 110
4.2. Изучение влияния суммы сесквитерпеновых Лактонов на динамику изменении объемной скорости мозгового кровотока 112
4.3. Изучение прогивомикробной активности эфирного масла 115
4.4. Изучение противотуберкулезной активности эфирною масла 116
4.5. Изучение антиоксидантной активности поли фенольного комплекса «...117
Выводы по главе 4 119
Глава 5. Определение запасов травы полыни с антон и ковой 120
5.1. Ресурсоведческие исследовании травм полыни сантоннковой 120
5.2. Фенологические наблюдения 127
5.3. Изучение динамики роста биомассы травы полыни сантониновой 128
Выводы по главе 5 130
ГЛАВА 6. Стандартизация травы полыни с антон иковой 131
6.1. Морфолого-анатомическое исследование травы полыни сантони новой — 131
6.1.1. Морфологическое описание сырья полыни сантониновой 131
6.1.2. Анатомические признаки травы полыни сантониновой 135
6.2. Определение товароведческих показателей —I...— 143
6.2.1. Определение влажности 144
6.2.2. Определение содержания общей золы и золы, нерастворимой в растворе кислоты хлористоводородной 10% — ——144
6.2.3. Определение содержания примесей и нзмсльченности 145
6.3. Методы качественного анализа основных групп биологически активных соединении в траве полыни сантониновой 146
6.4. Метод количественного определения основных сссквитерпсновмх лаптопов в траве полыни сантоннковой 147
6.5. Изучение влияния условий сушки на качество сырья, определение коэффициента усушки надземной части полыни сантоннковой 154
6.6. Установление сроков годности травы полыни сантониновой 155
6.7. Определение содержания радионуклидов траве полыни сантоннковой — 155
6.8. Определение микробиологической чистоты травы полыни сантоннковой - 157
Выводы по главе 6 158
Общие выводы 159
Список литературы 161
- Химический состав видов полиморфного комплекса A. maritima L. s.
- Методы обнаружения и идентификации биологически активных соединений
- Определение количественного содержания эфирного масла
- Изучение прогивомикробной активности эфирного масла
Введение к работе
Актуальность темы
В настоящее время лекарственное растительное сырье по-прежнему остается одним из важных источников для получения лекарственных средств, несмотря на то, что арсенал медицины неуклонно пополняется новыми эффективными синтетическими лекарственными препаратами.
В силу произошедших геополитических процессов, многие виды растительного сырья, используемые в отечественной медицине, оказались за пределами России. Яркий примером тому полынь цитварная – источник сантонина, обладающего мягким антигельминтным действием. Поэтому проблема поиска нового растительного сырья для создания отечественных антигельминтных препаратов является актуальной. Проблема сантонина не исчерпывается только его антигельминтным действием. В настоящее время он широко используется в научном мире в качестве стандартного вещества в химических, физико-химических исследованиях, а также исходного вещества для синтеза других биологически активных веществ. Сантонин в виде субстанции входит в отечественный реестр гомеопатических лекарственных средств.
Уровень изученности лекарственных растений Северо-Кавказского региона на сегодняшний день нельзя признать удовлетворительным. Одним из главных факторов, сдерживающих широкое использование растений нашей флоры, является их выраженный полиморфизм, проявляющийся как на морфологическом уровне, так и в значительной изменчивости содержания основных биологически активных соединений. Это в первую очередь касается представителей рода полынь. На территории Северного Кавказа произрастает более 20 видов полыней, из которых наиболее перспективным сантонинсодержащим видом является полынь сантониковая. В систематическом отношении она близка к полыни цитварной (Artemisia cina Berg. ex Poljak.) и полыни морской (A. maritima L.), широко использующихся в мире в качестве основных источников сантонина и сантонинсодержащих препаратов. В народной медицине полынь сантониковая широко применяется в качестве антигельминтного, антибактериального, фунгицидного и детоксикационного средства. Однако в химическом отношении она изучена недостаточно. Таким образом, обеспечение ценным сырьем отечественной медицины за счет полыни сантониковой, а также всестороннее изучение этого растения является весьма актуальной проблемой.
Цель и задачи исследования
Цель настоящей работы - фармакогностическое изучение травы полыни сантониковой с выделением основных групп действующих веществ, выявление их фармакологической активности, стандартизация, диагностика и установление районов заготовки сырья.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Провести качественное и количественное определение основных групп биологически активных соединений (БАС) травы полыни сантониковой (эфирного масла, сесквитерпеновых лактонов, полифенольных и тритерпеновых соединений, полисахаридов, органических кислот, макро- и микроэлементов).
2. Выделить сумму сесквитерпеновых лактонов, разделить её и идентифицировать индивидуальные компоненты.
3. Провести фармакологические исследования выделенных фракций БАС и индивидуальных компонентов.
4. Установить места произрастания полыни сантониковой в Предкавказье и определить ресурсные перспективы данного вида.
5. Изучить оптимальные условия выделения сесквитерпеновых лактонов из травы полыни сантониковой и разработать методику их количественного определения.
6. Установить основные морфолого-анатомические диагностические признаки и товароведческие показатели сырья.
7. Провести стандартизацию травы полыни сантониковой, разработать нормативную документацию на данное сырье и гранулы гомеопатические «Santoninum».
Научная новизна
В результате проведенных исследований установлен химический состав основных групп биологически активных соединений полыни сантониковой.
Изучен химический состав эфирного масла полыни сантониковой. Методом газожидкостной хроматографии с последующим анализом масс-спектров (ГЖХ-МС) идентифицированы 27 соединений, ранее не описанных для этого вида. Преобладающими компонентами являются: хризантенон, -бисаболол, вербенон и -туйон. Изучена динамика накопления эфирного масла полыни сантониковой по органам растения в основные фазы его развития.
Из суммы сесквитерпеновых лактонов выделены индивидуальные соединения: сантонин, артемин, тауремизин. Установлено их количественное содержание и изучена динамика накопления в основные фазы развития растения. Артемин и тауремизин из полыни сантониковой выделены впервые.
Изучен компонентный состав фенольных соединений травы полыни сантониковой. Впервые методом высокоэффективной жидкостной хроматографиии (ВЭЖХ) идентифицировано и установлено количественное содержание 9 соединений: гиперозида, гесперидина, виценина, лютеолина, кверцетина, апигенина, галловой, кофейной и салициловой кислот.
Определено содержание в траве водорастворимых полисахаридов, дубильных и тритерпеновых веществ. Впервые в сырье идентифицированы органические кислоты (аскорбиновая и янтарная). Изучен элементный состав травы полыни сантониковой.
Установлено повышение объёмной скорости мозгового кровотока под влиянием суммы сесквитерпеновых лактонов и ее понижение под действием тауремизина. Выявлена выраженная противомикробная активность эфирного масла полыни сантониковой.
Исследованы перспективы сырьевой базы полыни сантониковой на территории Предкавказья.
Практическая значимость
В результате изучения химического состава полыни сантониковой доказана перспективность этого вида в качестве сырьевого источника эфирного масла и сесквитерпеновых лактонов – сантонина и тауремизина.
Установленное влияние сесквитерпеновых лактонов на скорость мозгового кровотока позволяет рекомендовать их для дальнейших фармакологических исследований в качестве эффективных корректоров при нарушениях мозгового кровообращения. Широкий спектр антимикробной активности эфирного масла полыни сантониковой даёт основание для его дальнейшего исследования в качестве потенциального антимикробного средства.
В результате проведенных ресурсных исследований определена урожайность травы полыни сантониковой и выявлены заросли в отдельных районах её распространения на территории Предкавказья.
Установлены характерные диагностические признаки сырья (травы) полыни сантониковой.
Определены оптимальные условия выделения сесквитерпеновых лактонов из травы полыни сантониковой и разработана методика их количественного определения.
Проведена стандартизация травы полыни сантониковой с учетом современных требований, предъявляемых к качеству лекарственного растительного сырья.
Внедрение результатов исследования
ФСП «Полыни сантониковой трава» утверждена ФГУП «Пятигорская фармацевтическая фабрика» (акт о внедрении от 26.06.2006 г.). Проект «Инструкции по сбору и сушке полыни сантониковой» подготовлен к рассмотрению. ТУ «Трава полыни сантониковой» и гранулы гомеопатические «Santoninum» утверждены ООО «Адонис» - центр научно-практической гомеопатии и традиционной медицины (г. Пятигорск) (акты о внедрении от 20.03.2006 г.). Методика количественного определения сесквитерпеновых лактонов в траве полыни сантониковой методом планарной хроматографии внедрена в учебный процесс кафедры фармакогнозии ГОУ ВПО Курского государственного медицинского университета Росздрава (акт о внедрении от 17.03.2006 г.). По результатам исследования биологической активности суммы сесквитерпеновых лактонов и противомикробной активности эфирного масла полыни сантониковой получены акты внедрения ГОУ ВПО Пятигорской государственной фармацевтической академии Росздрава (акты о внедрении от 12.04.2006 г. и 14.04.2006 г.) и ГОУ ВПО Курского государственного медицинского университета Росздрава (акт о внедрении от 17.03.2006 г.).
Положения, выдвигаемые на защиту
-
Результаты фитохимического изучения биологически активных соединений полыни сантониковой.
-
Оптимальные условия выделения и количественного определения сесквитерпеновых лактонов в траве полыни сантониковой.
-
Результаты изучения фармакологической активности сесквитерпеновых лактонов и эфирного масла полыни сантониковой.
-
Результаты ресурсоведческих исследований травы полыни сантониковой на территории Предкавказья.
-
Характерные диагностические признаки травы полыни сантониковой.
-
Стандартизация травы полыни сантониковой.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО Пятигорской государственной фармацевтической академии Росздрава (номер государственной регистрации 01200112164).
Апробация работы и публикации
Основные положения диссертационной работы доложены на 60-й и 61-й межрегиональной конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2005 - 2006 гг.). По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.
Объем и структура диссертации
Работа изложена на 177 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, общих выводов, списка цитируемой литературы, включающего 180 источников, из которых 57 иностранных авторов и приложения. Диссертация иллюстрирована 45 рисунками и 61 таблицей.
Химический состав видов полиморфного комплекса A. maritima L. s.
Artemisia L. - широко распространённый род, представители которого наиболее часто обнаруживаются в северном полушарии: умеренной зоне Европы, Азии, Северной Америки и Северной Африки [1; 2; 3; 4; 5; 6]. Согласно данным различных авторов он насчитывает от 200 до 400 видов, многие из которых фактически являются синонимами, т. е. разными названиями одного и того же растительного объекта, обитающего и описанного в разное время в различных географических регионах.
Artemisia L. достаточно хорошо определяемый с морфологической точки зрения род, включающий, в основном, травянистые и полукустарниковые виды. Существует несколько таксономических систем рода, согласно которым его подразделяют на секции или подрода. Классическая система Де Кандолля (De Candoll) [1], использовавшаяся в течение многих десятилетий, подразделяла этот род на секции Abrotanum, Absinthium, Seriphidium и Dracunculus. Во Флоре Европы род Artemisia подразделён на две секции Dracunculus и Artemisia [4], при этом последняя включает существовавшие ранее независимо секции Abrotanum, Absinthium и Seriphidium. В противоречии с этим обработка П. Полякова [3], который объединил Abrotanum и Absinthium в подрод Artemisia. Согласно другой системе [7], основывающейся на работах Ридбер- гера (Rydberg), секции Де Кандолля (De Candoll) трансформированы в подрода с добавление ещё одного - Tridentatae, в который выделена американская часть видов Seriphidium.
Все эти системы основаны исключительно на морфологических признаках, которые не лишены редукции и внутривидового полиморфизма. Только одна или две морфологических особенности использованы систематиками, чтобы подразделить род на эти подроды (секции), которые являются, вероятно, неестественными группировками. Это подтверждается многими примерами очень близких видов, отличающихся только по .одной особенности, отделяющей два подрода. Как видно, этих признаков не достаточно как на подродовом, так и на видовом уровнях классификации, что чрезвычайно осложняет систематику рода.
Согласно И Крашенинникову [8], имелось шесть основных центров видообразования Artemisia в Евразии. Это (1) Китайско-Японский (2) Ангарский (3) Берингийский (4) Центрально-Азиатский (5) Средне-Азиатский и (6) Европейско-Средиземноморский.
Artemisia - чрезвычайно полиморфный род. Большая часть этого полиморфизма - влияние основных полиплоидных комплексов в пределах рода. Каждый комплекс состоит, главным образом, из двух или более диплоидных видов (как основы) и сложной структуры полиплоидов различных уровней, генетически связанных друг с другом. Чрезвычайный полиморфизм полиплоидов - результат обширной перекомбинации диплоидных родительских особенностей, которые во многих случаях являются очень изменчивыми. Границы между уровнями плоидности часто более или менее диффузны вследствие такой перекомбинации и сегрегации у одного или обоих родителей, а также из-за интрогрессии в частях ареала, где встречаются два цитотипа.
Подобные полиморфные комплексы видов характерны для всех подродов рода Artemisia. В подроде Seriphidium одним из таких систематически сложных образований является полиморфный комплекс видов Artemisia maritima L s. 1.
В пределах подрода Seriphidium самая высокая концентрация видов - 16- 20 [8], найдена в пределах участка, соответствующего "Средне-Азиатскому" центру, то есть участку, расположенному к востоку от Каспийского моря. Очень вероятно, что это основной центр дифференцирования и видообразования в Seriphidium. в том числе и большинства видов комплекса Artemisia maritima L s. I. Однако не может быть исключена возможность, что некоторые из таксонов в комплексе Artemisia maritima, возможно, дифференцировались в пределах Европейско-Средиземноморской области, возможно в течение или даже перед наступлением позднего ледникового периода [9].
Подрод Seriphidium отличается от других подродов наличием гомогамных корзинок, то есть отсутствием зигоморфных пестичных цветков. Концепция видов в подроде время от времени значительно менялась. Хотя Линней (Linnaeus) (1753) описал 3, Стихман (Stechmann) (1775) 7 и Вильденов (Will- denow) (1803) 12 евразийских видов в подроде Seriphidium. многие авторы позднее хотели включить большинство евразийских видов как субъединицы (главным образом разновидности) в пределах одного совокупного вида, Artemisia maritima L Таким образом, Бессер (Besser) (1834) признал 20, а Леде- бур (Ledebour) (1845) 9 разновидностей (включая многие подразновидности) в пределах A maritima Только позже имеющиеся таксоны внутри A maritima sensu lato снова были признаны отдельными видами, прежде всего российскими авторами. Например, П. Поляков (1961) описал 7 видов в европейской части СССР, в то время как Т. Леонова (1970) при изучении Seriphidium этого же региона приводит следующие 13 видов. A maritima L., A lerchiana Web. ex Stechm., A. nutans Willd., A dzevanovskyi Leonova. A fragrans Willd., A san- tonica L. (santonicum). A nitrosa Web. ex Stechm., A taurica Willd., A compacta Fisch, ex DC., A pauciflora Web. in Stechm., A gracilescens Krasch & Iljin. A terrae-albae (Krasch). Krasch., A. lessingiana Besser. [10].
Некоторые из этих видов (A fragrans. A nitrosa. A compacta. А pauciflora. A gracilescens. A terrae-albae и A lessingiana) обнаружены только на юго-востоке европейской части России, распространившиеся в Европу из Турции, Сибири или Казахстана. Многие виды в списке (прежде всего первые восемь) обнаруживают явную близость друг к другу и таким образом образуют так называемый «комплекс» видов. В этот комплекс Artemisia maritima L. s. 1. должны быть также добавлены центрально европейский вид A vallesiaca АП. и северо-средиземноморский - A caerulescens L. (включая A gallica Willd.) [9]. Первое цитологическое исследование таксонов комплекса Ar- temisia maritima было проведено В ей нфд эль-Либо (Weinfdel-Liebau) (1928), который установил основное число хромосом х=9. Позже числа хромосом для видов в пределах комплекса были описаны многими авторами (Kawatani 1950, 1952, Kawatani и Ohno 1960, 1964, Suzuka 1949, 1950, 1952). Все подтвердили основное число 9 [9].
Исследования выполненные К. Персон (Person) (1974) [9] на видах комплекса А. maritima (табл. 1), как и данные других авторов [11; 12], полученные при изучении других полиморфных комплексов видов внутри трибы Ап- themideae, показали, что их уровень плоидности и диаметр пыльцевых зёрен взаимозависимые характеристики.
Методы обнаружения и идентификации биологически активных соединений
В основе метода лежит использование нитратредуктазной реакции для раннего выявления МВТ. Для этого при приготовлении плотной питательной среды вместе с лекарственными препаратами до свертывания вводится нитрат натрия из расчета 1 г на 1 л. Метод используется для штаммов М. tuberculosis, обладающих нитратредуктазной активностью Выявление нитратредуктазной реакции проводили стандартным реактивом Грисса (7,5% водный раствор). Активность нитратредуктазы определяли по количеству восстановленного из нитрата натрия, дающего цветную реакцию с реактивом Грисса, что является критерием роста МВТ. Исследование проводили в течение 12 суток.
Для определения использовали среду Левенштейна - Йенсена, в которую перед свертыванием вносили противотуберкулезные препараты и эфирное масло полыни сангониковой в нижеописанных пороговых концентрациях, ингибирующих рост штаммов МВТ.
Для стандартных противотуберкулезных препаратов ранее были установлены пороговые концентрации: стрептомицин - 10 мг/мл, изониазид - 1 мг/мл, канамицин - 45 мг/мл, рифампицин - 40 мг/мл, этамбутол - 7,5 мг/мл, протионамид - 30 мг/мл, масло полыни - 20 мг/мл. Интенсивность окрашивания (роста колонии МВТ) количественно оценивали следующим образом: - отсутствие роста, ”+” — скудный рост, ”++” умеренный рост, ”+++” - массивный рост. Рост культуры на среде с лекарственными и испытуемым препаратами означал устойчивость к данному препарату. Уменьшение (отсутствие роста)- чувствительность сохранена, т.е. препарат эффективен.
Исследование антиоксидантной активности проводили с разными фракциями полыни сантониковой.
Для получения первой фракции сырье, собранное в фазу бутонизации исчерпывающе экстрагировали методом ремацерации спиртом этиловым 96%. Вторую фракцию получали тем же способом из сырья, собранного в фазу цветения. Для получения третьей фракции, сырье (фаза цветения) исчерпывающе экстрагировали водой, затем растворитель удаляли, сырье высушивали и экстрагировали спиртом этиловым 96%. Аналогично третьей фракции из сырья, собранного в фазу бутонизации, была получена фракция - четыре. Путем исчерпывающей экстракции сырья, собранного в фазу бутонизации, в аппарате Сокслета, при использовании в качестве эсктрагента гексана была получена пятая фракция. После предварительного выделения эфирного масла из надземной части полыни сантониковой, заготовленной в стадии бутонизации, шрот, оставшийся после отгонки, экстрагировали этиловым спиртом 96%. Полученное извлечение являлось шестой фракцией. Для получения седьмой фракции сырье, собранное в стадии бутонизации, исчерпывающе экстрагировали в аппарате Сокслета сначала гексаном, а затем хлороформом Обезжиренное таким образом сырье экстрагировали этиловым спиртом 96% до полного извлечения полифенольного комплекса. Полученные извлечения сгущали в вакууме и досушивали в сушильном шкафу при температуре 60-65 С. Из полученных фракций готовили водные растворы 1%, которые использовали для определения антиоксидантной активности [122].
Оценку антиоксидантной активности полифенольных комплексов проводили в соответствии с договором о научно-техническом сотрудничестве № 6/02-04 «Исследование антиоксидантной активности лекарственных экстрактов и биологически активных веществ» совместно с ООО Научно- производственным внедренческим предприятием «ИВА» (НПВП «ИВА») г. Екатеринбург.
Эти же образцы одновременно исследовались на кафедре биохимии ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава. Уровень Ге -индуцированной хемилюминесценции определяли на приборе биохемилюминометр БХЛ-06 по общепринятому методу.
Метод исследования антиоксидантной активности, использованный нами на кафедре биохимии ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава основан на определении сверхслабого свечения продуктов перекисного окисления липосом (ПОЛ). Липосомы готовили из желтка куриного яйца путём смешивания его с равным объёмом фосфатного буфера и последующим перемешиванием магнитной мешалкой в течение 10 минут до образования однородного гомогената. Липосомы хранили на льду и использовали в течение одного дня. Исследуемые вещества прибавляли к 4 мл суспензии липосом (разведение 1:1 фосфатным буфером) в концентрации 10 М. После инкубации препаратов с ли- посомами при 37 С и перемешивании с помощью .мешалки в кювету добавляли 1 мл раствора пероксида водорода 6% и в течение 10 минут проводили регистрацию кинетики хемилюминесценции. Параллельно проводили контрольный опыт для каждой фракции по указанной методике без исследуемого вещества.
Определение характерных морфолого-анатомических признаков сырья проводили на кафедрах фармакогнозии и ботаники ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава. Объектами исследования являлись листья, стебли, наружные листочки обертки корзинки, трубчатые цветки полыни сантониковой.
Изучение внешних признаков травы полыни сантониковой проводили визуально, а также при помощи лупы ( 10) согласно методикам ГФ XI издания [111]. Фотографии образцов сырья выполнены с помощью фотоаппарата «Зенит - 300» на фотопленке «Кодак - 200» и фотокамеры «Sony Cyber-shot DSC- F717».
Для приготовления микропрепаратов из листьев, листочков обертки и цветков, сырье кипятили в 3% растворе натрия гидроксида в течение 3-6 минут с последующим промыванием проточной водой. Затем объекты замачивали на 14 дней в Судане III [111, 126, 127]. Эпидерму отделяли с помощью препаровальной иглы.
Для приготовления микропрепарата стебля полыни сантониковой, стебли замачивали на 7 дней в спирте этиловом 70%. Срезы готовили с помощью лезвия в ручную. Ксилему проводящих пучков обнаруживали путем окрашивания флороглюцином и кислотой хлористоводородной концентрированной с последующим промыванием водой [128]. Приготовленные микропрепараты листа, обертки, цветка и стебля помещали в воду и желатин-глицериновую смесь. Изучение диагностических структур травы полыни сантониковой проводили с помощью окуляр-микрометра (число измерений 20-30), полученные данные переводили в микрометры при помощи объект-микрометра [129].
Изучение полученных микропрепаратов проводили на микроскопе «Био- лам - С» (увеличение 20, 40, 90) и интерференционно-поляризационном микроскопе «Biolar» (увеличение х70, 100, х200). Микрофотосъемку проводили на интерференционно-поляризационном микроскопе «Biolar» с фотонасадкой МФН - И, на фотопленку «Кодак - 200».
Определение количественного содержания эфирного масла
На основании выполненных исследований, количественное определение суммы флавоноидов в траве полыни сантониковой проводили по следующей методике: около 1,0 г измельченного сырья (точная навеска), проходящего сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм, помещали в колбу со шлифом вместимостью 200 мл, прибавляли 40 мл спирта этилового 70%. Колбу присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Полученное извлечение фильтровали в мерную колбу вместимостью 100 мл. Затем в колбу для экстрагирования прибавляли еще 40 мл спирта этилового 70%. Экстракцию проводили еще дважды в тех же условиях, фильтруя извлечения в ту же мерную колбу. После охлаждения объем извлечения доводили до метки раствором спирта этилового 70% и перемешивали (раствор А).
В мерную колбу вместимостью 25 мл помещали 1 мл раствора А, 4 мл раствора алюминия хлорида 2% в спирте этиловом 96%, 4 капли раствора кислоты хлористоводородной 10% и доводили объем раствора спиртом этиловым 96% до метки. Через 40 мин измеряли оптическую плотность раствора (см. п.
В качестве раствора сравнения использовали раствор, состоящий из 1 мл раствора А и 4 капель раствора кислоты хлористоводородной 10%, доведен- ный спиртом этиловым 96% до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл. Параллельно измеряли оптическую плотность раствора, содержащего комплекс рабочего стандартного образца (РСО) рутина с алюминия хлоридом 2%, приготовленного аналогично испытуемому раствору.
УФ - спектры комплексных соединений флавоноидов травы полыни сантониновой и РСО рутина с А1СЬ
В УФ-спектре извлечения из травы полыни сантониновой максимум поглощения наблюдается при длине волны 408 нм (рис. 19), а у РСО рутина при длине волны 412 нм. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин в абсолютно сухом сырье в % (х) вычисляли по формуле: D. ха„ xlOOxlOO DCT ха, х(100-W) где Dx - оптическая плотность испытуемого раствора; DCT - оптическая плотность РСО рутина; ах - масса сырья, г; асг - масса РСО рутина, г; W — потеря в массе при высушивании сырья, %. Приготовление раствора PCO рутина: около 0,05 г (точная навеска) РСО рутина, предварительно высушенного при температуре 130-135 С в течение 3 часов растворяли в 85 мл спирта этилового 96% в мерной колбе, вместимостью 100 мл при нагревании на водяной бане. После охлаждения объем раствора доводили до метки спиртом этиловым 96% и перемешивали. Срок годности раствора 1 месяц при хранении в темном прохладном месте в хррошо укупоренной таре.
Разработанная методика апробирована на образцах полыни сантониковой, собранных в каждом районе заготовки сырья, в шести независимых повторностях. Относительная ошибка определения - не более ±2,38% (табл. 26).
Количественное экстракционно-саектрофотометрическое определение суммарного содержания фенолкарбоновмх кислот в присутствии флавоноидов
Учитывая, что фенолкарбоновые кислоты могут вступать в реакцию с хлоридом алюминия, а также наличие у них поглощенйя в области 330 нм, характерного также для флавоноидов, определение суммарного содержания фенол- карбоновых кислот проводили экстракционно-спектрофотометрическим методом. Растворение экстрактивных веществ травы полыни сантониковой в буферном растворе с pH 2,0 ± 0,1 с последующей экстракцией этилацетатом позволяет добиться наиболее полного разделения этих групп веществ, с достоверным определением их количественного содержания [99]. Методика: траву полыни сантониковой измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито, с диаметром отверстий 2 мм. Около 1,0 г (точная навеска) растительного сырья помещали в колбу вместимостью 500 мл, приливали 100 мл спирта этилового 40% и экстрагировали методом мацерации в течение 15 суток. Полученное извлечение фильтровали, затем 25 мл фильтрата количественно переносили в круглодонную колбу и упаривали до получения сухого остатка. Остаток в колбе после охлаждения количественно переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл, смывая со стенок буферным раствором (pH 2,0 ± 0,1), доводили буферным раствором до метки и перемешивали. 3 мл полученного раствора экстрагировали 10 мл этилацетата.
Затем 3 мл полученного этилацетатного извлечения упаривали, остаток растворяли в спирте этиловом 96% и количественно переносили в колбу вместимостью 25 мл, доводили объем раствора до метки тем же растворителем (раствор А). 5 мл раствора А переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводили объем раствора до метки спиртом этиловым 96%, перемешивали (раствор А) и измеряли оптическую плотность полученного раствора А при длине волны 330 нм (см. п. 2.2.4.1.). В качестве раствора сравнения использовали спирт этиловый 96%.
Параллельно измеряли оптическую плотность раствора стандартного раствора кофейной кислоты. потеря в массе при высушивании сырья, %. Приготовление буферного раствора: 2,48 г кислоты борной растворяли в 500 мл воды очищенной при нагревании в мерной колбе вместимостью 1 л, охлаждали и прибавляли 2,6 мл кислоты ортофосфорной концентрированной и 2,3 мл кислоты уксусной ледяной, доводили водой очищенной до метки, перемешивали.
Приготовление стандартного раствора кофейной кислоты. 0,05 г (точная навеска) кофейной кислоты высушивали при температуре 100-105 С до постоянной массы, помещали в колбу со шлифом вместимостью 100 мл и прибавляли 40 мл спирта этилового 96%, нагревали на водяной бане в колбе с обратным холодильником до полного ее растворения. После охлаждения раствор количественно переносили в мерную колбу вместимостью 50 мл. Объем раствора доводили до метки спиртом этиловым 96% и перемешивали (раствор Б). 1 мл раствора Б помещали в колбу вместимостью 50 мл, доводили до метки спиртом этиловым 96% и перемешивали.
Изучение прогивомикробной активности эфирного масла
Выявленный спектр фармакологической активности биологически активных соединений полыни сантониковой обуславливает возможность ее применения в медицинской практике. Однако, важнейшим условием использования любого лекарственного растительного сырья, является наличие сырьевой базы.
Широкое распространение полыни сантониковой на территории Северного Кавказа, не образующей сплошных крупных зарослей, обуславливает необходимость выявления наиболее продуктивных ценопопуляций полыни сантониковой в некоторых районах Предкавказья и определение их урожайности.
Исследование запасов сырья полыни сантониковой проводили на территории: северно-западных районов Краснодарского края (Кущевский, Крылов ский), южных районов Ростовской области (Сальский, Зерноградский юго- западных районов Республики Калмыкия (Городовиковский), северных и юго- западных районов Ставропольского края (Апанасенковский, Левокумский, Нефтекумский, Минераловодский), северных районов Республики Дагестан (Ногайский, Тарумовский).
Определение урожайности травы полыни сантониковой проводили на протяжении 2002 - 2005 гг., согласно методическим указаниям по изучению запасов дикорастущих лекарственных растений [64]. Выбор районов для проведения исследования осуществляли, учитывая данные литературы о растительных сообществах и местах обитания полыни сантониковой [170-173].
Полынь сантониковая распространена на Северном Кавказе в границах Предкавказья, на территории объединяющей: Кубанскую низменность, Ставропольское поднятие, Кумско-Терскую и Маныческую низменности. Основная часть зарослей располагается на светло-каштановых слабогумусных почвах, развивающихся под полынным и полынно-солянковым растительным покровом на территории представленной наносами рек Кубань, Кума, Терек [171].
Так как полынь сантониковая является многолетним травянистым растением, у которого в качестве сырья предполагается использовать надземную часть, урожайность сырья определяли методом учетных площадок (см. п. 2.2.1.1.).
Учетные площадки были заложены в западной, центральной и восточной частях ареала полыни сантониковой, на территории: северо-западных районов Краснодарского края (Кущевский, Крыловский), южных районов Ростовской области (Сальский, Зерноградский), юго-западных районов Республики Калмыкия (Городовиковский), северных и западных районов Ставропольского края (Апанасенковский, Левокумский. Нефтекумский, Минераловодский), северных районов Республики Дагестан (Ногайский, Тарумовский) (рис. 26).
В результате обследования указанных районов были выявлены наиболее продуктивные ценопопуляции полыни сантониковой: Ставропольский край - окрестности г. Мин-Воды (рис. 25), Краснодарский край - окрестность ст. Крыловская, Республика Дагестан - Тарумовский район.
Ценопопуляция 1. Ставропольский край окрестности г. Мин-Воды. Полынь сантониковая произрастает на высоте около 500 м над уровнем моря в по- лынно-ковыльно-типчаковой степи слева от трассы Ростов - Баку (633 км) по направлению в Мин-Воды. Почва - слабовыщелоченный чернозем. Доминант- полынь сантониковая, содоминанты - полынь австрийская (Artemisia austriaca Jacq.), крестовник Якова (Senecio jacobaea L.), ковыль Лессинга (Stipa lessingiana Tein. et Rupr.), кермек Мейера (Limonium meyeri (Boiss). O. Kuntze.), льнянка обыкновенная (Linaria vulgaris Mill.), девясил британский (Inula britannica L.). Ярусность вследствие разреженности растительного покрова, не выражена.
Генеративные особи полыни сантониковой 55,5±4,9 см высотой, диаметр надземной части «куста» 27,1±2,4 см, число вегетативных и генеративных побегов у одной особи 3,3±0,3 и 14,4±1,4 шт. соответственно (табл. 46).
Урожайность воздушно-сухого сырья 166,3±1,13 г/м2 (табл.47). Площадь ценопопуляции - 0,6 га, эксплуатационный запас воздушно-сухого сырья на этой площади составил 984 кг (табл. 48).
Изучение возрастного состава ценопопуляции показало, что на долю всходов приходится 11,3%, виргинильных особей - 24,7%, генеративных - 56,2% и сенильных - 7,8%.
Ценопопуляция 2. Краснодарский край окрестность ст. Крыловская, пойма р. Челбас. Полынь сантониковая произрастает на высоте около 50 м над уровнем моря в ковыльно-типчаковой степи на темно-каштановой почве в 4 км по трассе в напралении к станице Ленинградской. Характерна крайняя обеднен- ность территории влагой. Доминант - полынь сантониковая, содоминанты - ковыль Лессинга (Stipa lessingiana Tein. et Rupr.), верблюжья колючка обыкновенная (Alhagi pseudalhagi (Bied.) Desv.), кермек Мейера (Limonium meyeri (Boiss). O. Kuntze.). Ярусность, вследствие разреженности растительного покрова, не выражена.
Генеративные особи полыни сантониковой 57,4±5,2 см высотой, диаметр «куста» 29,7±2,7 см, число вегетативных побегов у 1 особи 2,0±0,2 генератив- ных- 17,1 ±1,5 шт. (табл. 46). Урожайность воздушно-сухого сырья 170,4±1,32 г/м:. Эксплуатационный запас сырья на площади ценопопуляции в 1,8 га равен 3020 кг (табл. 48). Возрастной состав ценопопуляции: всходы - 10,4%, виргинильные особи - 26,4%, генеративные - 54,7% и сенильные - 8,5%.
Ценопопуляция 3. Республика Дагестан Тарумовский район, пойма р. Терек. Полынь сантониковая произрастает на высоте около 15 м над уровнем моря, в 5 км по трассе на г. Кочубей в полупустынном злаково-полынном и солян- ковом сообществе. Почва - солонцово-солончаковая. Характерна крайняя обеднённость территории влагой. Доминант - полынь сантониковая, содоми- нанты - ковыль Лессинга (Stipa lessingiana Tein, et Rupr.), верблюжья колючка обыкновенная (Alhagi pseudalhagi (Bied.) Desv.). Ярусность вследствие разреженности растительного покрова не выражена.
![Фармакогностическое изучение полыни австрийской как источника фармакологически активных сесквитерпеновых лактонов [Электронный ресурс]](/i/i/4372/184855.png "Фармакогностическое изучение полыни австрийской как источника фармакологически активных сесквитерпеновых лактонов [Электронный ресурс] Коновалов Юрий Борисович")
