Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Современное состояние и перспективы использования растений рода Juglans L. в медицинской практике
1.1. Ботаническая характеристика и химический состав ореха грецкого Juglans regia L. сем. Ореховые Juglandaceae (Rich.ex.Kunth) 9
1.2. Фармакологическая активность и применение в медицине Juglans regia L 21
1.3. Гомеопатические лекарственные средства, зарегистрированные в зарубежных странах на основе настойки гомеопатической матричной из ореха грецкого листьев и методы оценки качества 26
Экспериментальная часть
Пояснение к эксперименту 33
Глава II. Фармакогностический анализ лекарственного растительного сырья листьев ореха грецкого свежих и высушенных
2.1 .Изучение морфологических признаков свежего и высушенного сырья 43
2.2. Исследование анатомического строения сырья 44
2.3. Установление номенклатуры числовых показателей и их норм 51
2.4. Определение микробиологической чистоты 58
ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ П 60
Глава III. Фитохимическое изучение лекарственного растительного сырья «ореха грецкого листья свежие» и «ореха грецкого листья высушенные».
3.1.Изучение качественного состава биологически активных веществ в сырье ореха грецкого 61
3.2. Выделение и анализ состава нафтохинонов 72
3.3. Разработка методик количественного определения биологически активных веществ в сырье 81
3.4. Разработка показателей качества сырья и установление сроков годности 94
3.5. Определение динамики накопления биологически активных веществ, сроков заготовки и оптимальных условий хранения 99
Выводы к главе ш 104
Глава IV. Настойки гомеопатические матричные и определение методов их стандартизации
4.1.Определение технологических характеристик сырья 105
4.2. Выбор технологии получения настоек гомеопатических матричных 107
4.3. Изучение качественного состава настоек гомеопатических матричных и количественного содержания в них основных групп биологически активных веществ 104
4.4. Разработка показателей качества настоек матричных гомеопатических и установление сроков годности 117
Выводы к главе 4 125
Глава V. Предварительная оценка фармакологической активности НГМ Югланс
5.1. Фармакологические исследования в опытах in vitro 126
5.1.1. Фармакологические исследования методом биотестирования 126
5.1.2. Результаты фармакологических исследований с использованием биотест систем , 128
5.2. Фармакологические исследования в опытах in vivo 135
5.2.1. Методы фармакологических исследований на животных 135
5.2.2. Результаты исследований фармакологической активности на животных 138
Выводы к главе v 144
Общие выводы 145
Литература
- Фармакологическая активность и применение в медицине Juglans regia L
- Установление номенклатуры числовых показателей и их норм
- Разработка методик количественного определения биологически активных веществ в сырье
- Изучение качественного состава настоек гомеопатических матричных и количественного содержания в них основных групп биологически активных веществ
Введение к работе
В последнее десятилетие во всем мире наблюдается постоянный
рост спроса населения на эффективные и безопасные лекарственные средства природного происхождения в связи с увеличением числа хронических заболеваний, при которых необходима длительная терапия. В настоящее время как в мировой так и в отечественной фармацевтической практике достаточно широко используются фитопрепараты, в том числе гомеопатические, ассортимент которых постоянно пополняется за счет регистрации препаратов отечественного и зарубежного производства, составляя около 40% от общего числа применяемых лекарственных средств. Следует отметить, что генофонд лекарственных растений, активно используемых в народной медицине насчитывает около 1200 видов, однако в РФ перечень разрешенных к применению растительных объектов включает около 260 видов, что свидетельствует о целесообразности проведения комплексных исследований по выявлению и изучению перспективных растительных объектов, произрастающих на территории России. Поэтому существует необходимость разработки стандартов качества (ФС, ФСП, НД), в которых должны быть сформулированы требования, предъявляемые к качеству сырья, препаратов во всех лекарственных формах и стандартов. К числу таких объектов следует отнести орех грецкий Juglans regia L. сем. Ореховых Juglandaceae A.Rich ex Kiinth.
Изучение номенклатуры лекарственных и лечебно-профилактических средств, представленных на отечественном фармацевтическом рынке и рекомендованных к применению в качестве антимикробных, противовоспалительных средств при заболеваниях пищеварительной, мочеполовой, лимфатической, а также кровеносной систем, свидетельствует о том, что они представлены преимущественно препаратами синтетического происхождения, а именно антибиотиками и сульфаниламидами. Вместе с тем листья, а также олиственные молодые
5 побеги с цветками ореха грецкого широко рюпользуются в народной и официналъной медицине зарубежных стран, как в аллопатической так и в гомеопатической практике в качестве противовоспалительного, ранозаживляющего, антимикробного средства. В литературных источниках есть упоминание и об использовании незрелых плодов грецкого ореха, в ряде случаев, отмечено наличие у них цитостатическои активности. Чаще всего используются спиртовые настойки и экстракты (сухие, жидкие), реже - водные вытяжки. При этом применение может быть как наружным (мази, компрессы, повязки и т.д.), так и внутренним (капли, микстуры и т.д.). Так листья ореха грецкого в форме порошка для присыпок, отвара для компрессов, примочек, полосканий или ванн применяются при таких заболеваниях как ревматизм, подагра, заболевания десен, кожные дерматиты или гнойные раны, лимфадениты и маститы. При заболеваниях желудочно-кишечного тракта, фурункулезе, туберкулезе, геморройе, глистной инвазии, заболеваниях женской половой системы, а также при детских рахитах используются различные вытяжки из листьев (настой, настойка, экстракт, сок). В гомеопатической практике целого ряда зарубежных стран (Германии, Франции, Великобритании, Индии и др.) применяется настойка гомеопатическая матричная ореха грецкого, получаемая из олиственных побегов в период цветения и ее разведения в качестве средства антропософского терапевтического направления лечения. Эта настойка используется для получения гранул, капель, мазей, суппозиториев и др. лекарственных форм. Выпуск препаратов на основе листьев ореха грецкого осуществляется на территории Украины (препарат Карион, настойка, суспензия и мазь Юглон). В России листья ореха грецкого находят применение только в народной медицине, НМГ из свежих и высушенных ореха грецкого листьев также находит применение, но нормативная документация на настойку и ЛРС отсутствует.
В связи с этим представляется целесообразным изучение возможности получения настойки гомеопатической матричной на основе отечественного сырья листьев ореха грецкого (свежих и высушенных) и разработка нормативной документации на лекарственное растительное сырье и настойку.
Целью исследования является фармакогностическое изучение ореха грецкого листьев, получение настойки гомеопатической матричной Югланс на его основе и их стандартизация.
Для достижения указанной цели необходимо решить следующие основные задачи:
1. Провести фармакогностическое исследование свежих и высушенных
ореха грецкого листьев, исследовать основные группы биологически
активных веществ (БАВ) и разработать методики их качественного и
количественного определения.
2. Изучить динамику накопления БАВ с целью установления
оптимальных сроков заготовки сырья, составить проекты фармакопейных
статей (ФС) на свежее и высушенное сырье ореха грецкого, а также
проект инструкции по заготовке сырья.
3. Получить НГМ Югланс и изучить их компонентный состав БАВ.
Разработать методики стандартизации НГМ Югланс и составить проекты ФС на НГМ из свежего и высушенного сырья ореха грецкого
Провести предварительное фармакологическое исследование НГМ Югланс.
Научная новизна исследования заключается в том, что на основании макро- и микроскопического анализа листьев ореха грецкого впервые установлены диагностические признаки сырья. Проведено сравнительное фармакогностическое изучение ореха грецкого листьев свежих и высушенных и установлено, что количественное содержание флавоноидов, дубильных веществ и производных нафтохинона в свежем сырье несколько выше, чем в высушенном.
Подобраны условия качественного и количественного анализа БАВ в лекарственном растительном сырье (ЛРС) с применением современных методов физико-химического анализа: УФ-спектроскопии и различных видов хроматографии (ТСХ, ВЭЖХ). С использованием разработанных методик определен качественный состав и количественное содержание в ЛРС флавоноидов, дубильных веществ, нафтохинонов (юглона). Установлены различия в количественном содержании отдельных БАВ в зависимости от фазы вегетации ореха грещсого. Предложена схема получения стандартного образца юглона.
Разработаны методики стандартизации ореха грецкого листьев Определены оптимальные сроки заготовки ЛРС, предназначенного для гомеопатической практики, а также проведены исследования по изучению перспективности использования НГМ, полученной из свежего и высушенного ЛРС. Получены НГМ Югланс из двух видов ЛРС, разработаны основные показатели их качества. При этом установлено, что качественный состав настоек идентичен, фармакологическая активность сопоставима. Практическая значимость. На основании проведенных исследований разработаны:
Инструкция по заготовке листьев ореха грецкого высушенных и
свежих;
проект ФС «Ореха грецкого листья свежие»;
проект ФС «Ореха грецкого листья»;
проект ФС «Juglans regia (Juglans). Настойка матричная гомеопатическая»;
проект ФС «Juglans regia (Juglans) D1. Настойка матричная гомеопатическая».
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ
8 ВИЛАР РАСХН по «Программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса РФ 2006-2010 гг.».
Апробация работы. Результаты экспериментальных исследований доложены на научно-практических конференциях: XVI Московской международной гомеопатической конференции (Москва, 2006), Региональной научно-практической конференции, посвященной 40-летию фармацевтического факультета КГМА (Курск, 2006), Конгрессе, посвященному 30-летию со дня открытия ЦНИИР «Традиционная медицина 2007г» (Москва, 2007), VIII Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики, лечение больных в многопрофильном лечебном учреждении» (СПб,2007), III Всероссийском гомеопатическом съезде (Москва, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Положения, выносимые на защиту.
1.Результаты фармакогностического изучения ореха грецкого листьев свежезаготовленных и высушенных.
2.Результаты фитохимического анализа и разработки методик стандартизации сырья ореха грецкого, а также изучения динамики накопления БАВ.
4. Результаты по разработке показателей качества НГМ Югланс.
5.Результаты определения основных видов фармакологической активности НГМ Югланс, включая острую токсичность.
Фармакологическая активность и применение в медицине Juglans regia L
Авиценна рекомендовал толченый грецкий орех с медом для лечения больных туберкулезом легких и другими истощающими организм заболеваниями. Также он считался средством, предупреждающим отравление самыми сильными ядами («если владыка опасается отравителей, пусть он изволит съесть утром на тощий желудок два грецких ореха с двумя винными ягодами, вместе с ореховыми молодыми листьями и горькой солью», — гласит старинный медицинский трактат [122,131]. Молодые листья ореха применялись в XVI—XVII веках войсковыми лекарями как отличное ранозаживляющее средство.
В своих трудах И.В.Мичурин назвал орех хлебом будущего, благодаря энергетической ценности ядра ореха грецкого. С древнейших времен и до настоящего времени грецкий орех славиться своими пищевыми и лечебными свойствами. Открытие инсектинидньїх свойств грецкого ореха — заслуга предков. О том, что запах листьев этого растения не переносят слепни, москиты, оводы, мухи, комары и моль, знали очень давно [67,122,154]. Там, где рос грецкий орех, шерстяные вещи, меха и ковры перекладывали пахучими листьями, а горловины винных кувшинов, на долгие годы зарываемых в землю для хранения, затыкали тоже ореховыми листьями и сверху обмазывали глиной. Для защиты животных от кровососущих насекомых кошары, конюшни, места водопоев издавна было принято обсаживать грецкими орехами. Для человека запах листьев грецкого ореха в малых дозах довольно приятен, а в больших вызывает головную боль и расстройство сна. По этой причине в Крыму, Молдавии, на Кавказе, где грецкие орехи во дворах совсем не редкость, местные жители пи днем, ни ночью не ложатся спать под этими деревьями [122,131,136,143,144,154].
Для лечения также традиционно применяются преимущественно листья и зеленый околоплодник (кожура) незрелых орехов, также используются зрелые ядра. Листья растения обладают тонизирующим, общеукрепляющим действием, улучшают обмен веществ при различных кожных заболеваниях, рассасывают воспалительные инфильтраты, обладают бактерицидным действием, заживляют гнойные раны, прекращают воспалительные процессы в органах и тканях, а также обладают вяжущим, легким слабительным и противоглистным эффектом. Сумма флавоноидов выделенная из листьев ореха грецкого в эксперименте показала жаропонижающее и бактерицидное действие [2,14,53,67,97,118,122,123,131,154]. В табл. 2 приведены данные литературных источников о способах применения ореха грецкого листьев.
Данные литературы [2,14,53,67,97,118,122,123,131,154] свидетельствуют о том, что листья ореха грецкого находят широкое применение в народной и традиционной медицине разных стран как наружное средство и средство для приема внутрь. Так листья ореха грецкого применяются в форме порошка для присыпок, отвара для компрессов, примочек, полосканий или ванн при таких заболеваниях как ревматизм, подагра, заболевания десен, кожные дерматиты или гнойные раны, лимфадениты и маститы. При заболеваниях желудочно-кишечного тракта, фурункулезе, туберкулезе, геморрое, глистной инвазии, заболеваниях женской половой системы, а также при детских рахитах используются различные вытяжки из листьев (настой, настойка, экстракт, сок). Однако, в официнальной практике встречается незначительное количество препаратов зарубежных производителей на основе ореха грецкого листьев. Например, настойка матричная гомеопатическая, мазь, раствор и суспензия "Юглон", "Карион" [111,112].
Для производства гомеопатических лекарственных средств используется сырье растительного, химического, минерального и животного происхождения, причем гомеопатические лекарственные средства растительного . происхождения являются преобладающими.[1].
Для получения экологически чистого сырья и совершенствования методов контроля необходимо ужесточить контроль за заготовкой сырья или создавать сеть "гомеопатических садов" при медицинских и ботанических учреждениях, как это делается в Европе[3].
В 1935 Комитетом по стандартизации СССР и Всесоюзным экспортным объединением "Лектехсырье" был введен ОСТ 7816/ НКВТ 379 на " Листья ореха грецкого" [107]. Необходимо отметить, что в ОСТ 7816/ НКВТ 379 отражены следующие показатели качества листьев ореха грецкого: описание, внешний вид, размер, цвет, запах, вкус, влажность, допустимые примеси и их содержание, упаковка и маркировка, правила контрольного осмотра. В соответствии с ОСТом применение определено как " в качестве лекарственно-технического сырья". Отсутствуют микроскопические характеристики, качественный и количественный анализ БАВ. Других НД на этот вид сырья в последующие годы не разработано и не утверждено.
В Государственную Фармакопею России этот вид сырья никогда не входил. Однако, статьи на НГМ из ореха грецкого листьев включены в состав гомеопатических Фармакопеи таких стран как, Германия, Франция, Великобритании, а также Индии [47,48,49,50,114,162,171,182,189]. В Гомеопатической Фармакопеи Индии [189] структура статьи Juglans regia выглядит следующим образом: ботаническое название и семейства , ореха грецкого, другие используемые названия, описание, используемые \части, микроскопия листьев и плодов, распространение, история и авторы, препараты из ореха грецкого. В разделе " Препараты" указываются НГМ и рецептура ее приготовления, а также разведения матричной настойки. Требования к качеству НГМ и разведений в Гомеопатической Фармакопеи Индии не приведены.
Установление номенклатуры числовых показателей и их норм
Реактив Драгеидорфа: Раствор 1). 0,85 г азотнокислого основного висмута растворяют в смеси из 40 мл воды и 10 мл уксусной кислоты.
Раствор 2). 8,0 г йодистого калия растворяют в 20 мл воды. Смешивают равные объемы растворов 1 и 2 . К 10 мл полученной смеси прибавляют 100 мл воды и 20 мл уксусной кислоты.
Раствора ванилина 0,35% в серной кислоте: 0,16 г ванилина растворяют в смеси 16 мл воды и 30 мл кислоты серной концентрированной. Раствор используют свежеприготовленным.
Раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты: 10 г фосфорно-вольфрамовой кислоты растворяют в 100 мл 95% этилового спирта. Перед употреблением к полученному раствору добавляют 4 мл концентрированной хлористоводородной кислоты.
При расчетах количественного содержания основных групп БАВ учитывали влажность сырья. Для идентификации и количественного определения использовали следующие стандартные образцы:
РСО рутина: Около 0,05 г (точная навеска) СО рутина (Sigma № R5143 ) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 85 мл 95% спирта этилового и растворяют при нагревании на водяной бане, затем охлаждают и доводят объем раствора до метки и тщательно перемешивают. РСО гиперозида: Около 0,05 г (точная навеска) СО гиперозида (Sigma № Н5160 ) помещают в колбу и прибавляют 5мл метанола. РСО кверцетина: Около ОД г (точная навеска) СО кверцетина (Sigma № Q0125 ) помещают в колбу и прибавляют 10мл метанола. РСО юглона: Около 0,25 г (точная навеска) СО юглона (Aldrich № Н 47003 ) помещают в колбу вместимостью 25 мл и доводят объем до метки метанолом. Мерной пипеткой отбирают 1 мл раствора в мерную колбу на 50мл и доводят объем до метки метанолом. РСО галловой кислоты: Около 0,25 г (точная навеска) СО галловой кислоты (Sigma № G 7384) помещают в колбу вместимостью 25 мл и доводят объем до метки метанолом. Мерной пипеткой отбирают 1 мл раствора в мерную колбу на 50мл и доводят объем до метки метанолом. Остальные реактивы готовят в соответствии с ГФ XI [59].Обнаружение основных групп биологически активных веществ проводили по приведенным ниже методикам. Фармакогностические исследования лекарственного растительного сырья проводили согласно требования ГФ XI [48]: - Микроскопический анализ цельного и измельченного сырья проводили с использованием микроскопа фирмы «Цейс» и фотокамеры «Nicon D70» для микрофотографий согласно статье "Техника микроскопического анализа" ГФ XI в.1 с. 277-275. Микропрепараты растительного материала окрашивали следующими красителями: гематоксиллин по Эрлиху в сочетании с антоциановым синим, а также сафранин по Картесу в сочетании с антоциановым синим [48], а также ГОСТ 24027.2-80 [46]. - Определение влажности сырья листьев ореха грецкого проводили на анализаторе влажности фирмы Sartorius МА-45 по следующей методике: выбирают режим "постоянная сушка", навеску измельченного сырья помещают на чашку анализатора, при неизменности показателя влажности на мониторе в течение 5 мин, снимают значение. - Содержание сока определяли по методике, изложенной в ОФС 42-0027-05 "Настойки гомеопатические матричные" [48]. - Наличие тяжелых металлов определяли по методике ОФС 42-0011-03 на сцинтилляционном у- спектрометре МКГБ-01 [48]. Внешние признаки определяли по методике ГФ XI, вып. 1, стр.252. -Измельченность растительного сырья определяли согласно методике ГФ XI, вып. 1, стр. 275 с использованием сит с номинальным размером отверстий 7,0 мм и 0,5 мм. - Содержание минеральной и органической примеси определяли согласно методике ГФ XI, вып. 1, стр.276 - Количественное определение золы общей и золы нерастворимой в 10% растворе хлористоводородной кислоты проводили по методике ГФ XI, вып. 1, стр.252 с использованием электропечи лабораторной SNOL 8,2/1100. - Испытания на микробиологическую чистоту проводились в соответствии с методикой ОФС 42-0016-04 по категории чистоты сырья ЗЬ. - Определение содержания сока и влажности свежих листьев выполнено согласно ОФС 42-0027-05 " Настойки гомеопатические матричные " и содержание влаги в листьях ореха грецкого проводили согласно методике ГФ XI [48] на опытных партиях листьев. В ходе исследований был изучен комплекс нафтохинонов путем снятия Ни С спектров на спектрометре АС-200 фирмы «Bruker» (частота Н - 200 МГц, 13С - 50 МГц).
Настойки гомеопатические матричные, полученные из свежих и высушенных листьев ореха грецкого их разведения (D4, D3, D2, D1) подвергались исследованиям по определению биологической активности методами in vivo и in vitro на запатентованных молекулярных тест-системах (каталаза, глутатионпероксидаза и глутатион-редуктаза) [15,20,21,22,23,24,25,55,90] в НИЦ ВИЛАР.
Разработка методик количественного определения биологически активных веществ в сырье
С помощью различных физических и физико-химических методик было установлено, что основными группами БАВ в листьях ореха грецкого свежих и листьях ореха грецкого высушенных являются: дубильные вещества, флавоноиды и нафтохиноны. Нами были проведены исследования по разработки методик количественного определения этих групп веществ, методом ВЭЖХ: на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы «GILSON», по описанной ранее методике в разделе "Экспериментальная часть":
- количественное определение флавоноидов и дубильных веществ проводили методом ВЭЖХ на хроматографе фирмы SHlMADZU,c колонкой ZORBAX 80А Extend-C 18, 5 им производства фирмы Agilent (США), с расчетом линейного градиента.
- количественное определение веществ из группы нафтохинонов проводили методом ВЭЖХ на хроматографе фирмы SHIMADZU,c колонкой ZORBAX 80А Extend-C 18, 5 рм производства фирмы Agilent (США), с расчетом линейного градиента.
Количественное определение флавоноидов в исследуемых объектах. Идентификация и количественное определение веществ методом ВЭЖХ проводилась по соответствию времен удерживания пиков на хроматограммах РСО и испытуемого раствора. Приготовление стандартных образцов и методика анализа описаны в экспериментальной части диссертационной работы (стр. 33). ВЭЖХ-хроматоргаммы смеси стандартных образцов, в том числе флавоноидов: кверцетина, дигидрокверцетина, лютеолина, кемпферол и гиперозида приведены ниже. ВЭЖХ-хроматограмма смеси стандартов гиперозида, кверцетина, лютеолина, кемпеферола, хлорогеновой кислоты, кофейной кислоты, дигидрокверцетина и юглона.
Содержание каждого из веществ в % вычисляют по следующим формулам, приведенным в экспериментальной части диссертации. С использованием данной методики (ВЭЖХ) было проанализировано 5 серий каждого вида сырья. Данные представлены в таблице Ш.3.19.
Таблица Ш.3.19. Результаты количественного определения содержания флавоноидов в ореха грецкого листьях методом ВЭЖХ в пересчете на гиперозид. № серии Ореха грецкого листья свежие Ореха грецкого листья высушенные
Для проверки отсутствия систематической ошибки измерения проведены опыты с добавками гиперозида к навеске сырья (точная). Результаты опытов с добавками гиперозида в навеску сырья. Количествосуммы флавоноидов в10гЛРС,г Добавлено гиперозида, г Должно быть, г Найдено, г Относительная ошибка
Результаты опытов с добавками, проведенных на свежем и высушенном сырье показали, что относительная ошибка определения не превышает допустимых значений и имеет отклонения в сторону как положительных так и отрицательных значений, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки.
Содержание флавоноидов в свежезаготовленных листьях ореха грецкого составило от 1,20% до 1,31%, в высушенных листьях - от 0,92% до 0,96%. Предложены нормы по этому показателю не менее 1% и не менее 0,9% соответственно. Количественное определение дубильных веществ.
Количественный анализ дубильных веществ проводился методом ВЭЗКХ. Приготовление стандартных образцов и методика анализа описаны в экспериментальной части диссертационной работы. Содержание галловой кислоты, в 100 мл, в миллиграммах(Х) вычисляют по следующим формулам: где S„cn - площадь пика галловой кислоты на хроматограмме испытуемого раствора SHOT. - площадь пика галловой кислоты на хроматограмме РСО 4 аст - навеска РСО галловой кислоты, г. Р - содержание основного вещества в РСО галловой кислоты, % .mV(x1,000)
Результаты количественного определения содержания дубильных веществ в ореха грецкого листьях методом ВЭЖХ в пересчете на галловую кислоту.
Результаты опытов с добавками, проведенных на высушенном сырье показали, что относительная ошибка определения не превышает допустимых значений и имеет отклонения в сторону как положительных так и отрицательных значений, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки.
Содержание дубильных веществ в свежезаготовленных листьях ореха грецкого составило от 14,21% до 15,00%, в высушенных листьях -от 12,98% до 13,10%. Предложены нормы по этому показателю не менее 14% и не менее 12% соответственно. Количественное определение фенолкарбонових кислот
Изучение качественного состава настоек гомеопатических матричных и количественного содержания в них основных групп биологически активных веществ
Первичный скрининг по определению биологической активности анализируемых объектов настойки матричной гомеопатической "Югланс", полученной как из свежезаготовленного так и из высушенного сырья, а также основных групп биологически активных комплексов проводили с помощью биотестера систем в опытах in vitro в НИЦ БМТ ВИЛАР.
Нами изучалась возможность применения био-тест in vitro систем для оценки биологической активности НГМ и их потенциированых разведений.
Использование в био-тест системах in vitro в качестве тест-объектов ключевых или лимитирующих ферментов, которые быстро реагируют на изменения внутренней среды организма, ускоряя или замедляя скорость биохимических реакций, показало высокую специфичность и экономичность таких тест-систем, что соответствует современному подходу к проведению биологических экспериментов [90, 202].
Методы in vitro позволяют контролировать наличие биологической активности в многокомпонентных гомеопатических препаратах, что является важным, т.к. не всегда известно сочетанное действие компонентов, входящих в состав НГМ. Использование таких методов дает возможность выявлять первичные мишени действия гомеопатических средств (клеточные рецепторы, специфические ферментные системы, структурные белки, нуклеиновые кислоты и т.д.), т.е. в ходе фазы I метаболических превращений изучать их механизм действия. Они могут оказаться весьма перспективными при установлении срока годности гомеопатического лекарственного средства.
Учитывая огромную роль в метаболизме различных ксенобиотиков, в том числе и лекарственных средств, свободнорадикального окисления представлялось целесообразным использовать для оценки НГМ, полученных из листьев грецкого ореха, в качестве тест-объектов ферменты антиоксидантной защиты.
Окисление глутатиона в ГП-реакции, сопряженное с его восстановлением ГР, является определяющим фактором в поддержании эндогенного глутатиона в клетке. ГР участвует в инициации апоптоза: угнетение ГР - один из ранних сигналов к началу апоптоза. Теоретически накопление в клетке активных форм кислорода может запускать один из типов апоптоза [51]. Однако, проведенные исследования показали, что НГМ из свежего и высушенного ореха грецкого, так же как и вещество-сравнение - юглон, практически не оказывают воздействия на ГР. Возможно, это можно расценивать как факт более щадящего действия данных матричных настоек и их разведений, позволяющих применять их более длительное время, чем известные противомикробные или противовирусные аллопатические средства (антибиотики, сульфаниламидные препараты и пр.). Для изучения биологической активности НГМ использовали биотест-системы in vitro, основанные на использовании в качестве тест объектов ключевые или лимитирующие ферменты. В данной работе были использованы ферменты антиоксидантной защиты: глутатионпероксидаза, каталаза и глутатионредуктаза.
Фермент глутатионредуктаза (ГР; глутатион дисульфид: НАДФН оксидоредуктаза, КФ), представляющий собой флавопротеид, катализирует восстановление дисульфида глутатиона (окисленного глутатиона - T-SS-Г) в глутатион (восстановленный глутатион - Г-SH) [90, 202]. Г-SS-r + НАДФН + Н+ -» 2 Г-SH + НАДФ+
Донором протонов служит НАДФН, к которому ГР проявляет высокую специфичность и высокое сродство. Продукт глутатионредуктазной реакции, Г-SH, эндогенный антиоксидант участвует в большом числе биологических процессов: клеточном делении, биосинтезе белка и ДІЖ, старении, защите клеток от радиационного поражения, метаболизме лекарственных веществ, избирательном транспорте аминокислот, синтезе лейкотриенов и др. Глутатионредуктазная реакция является лимитирующим звеном восстановительного глутатионового цикла.
