Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современное состояние исследований солодки 10
1.1 .Историческая справка 10
1.2. Ботанико-фармакогностическая характеристика солодки 12
1.3.Характеристика сырьевой базы 17
1 АРазмножение и агротехника 17
1.5.Заготовка сырья 19
1.6.Химический состав 20
1.7.Фармакологические свойства 30
1.8.Медицинское применение солодки 35
1.8.1. Лекарственные средства на основе корней солодки 35
1.8.2. Суммарные препараты корней солодки
1.8.3. Препараты изготовленные на основе экстрактов
1.8.4. Препараты на основе глицирризиновой кислоты
1.8.5. Препараты на основе флавоноидов
Глава 2. Характеристика объектов и методов исследования 42
2.1 Объекты исследования 42
2.2 Методы исследования 46
2.2.1 .Качественные реакции 46
2.2.2. ТСХ-анализ 48
2.2.3. Спектрофотометрия 49
Глава 3. Морфолого-анатомические и химические исследования солодки корней 50
3.1. Методы морфолого-анатомического исследования 50
3.2. Методы исследования веществ солодки корней 56
3.2.1. Качественные реакции на сапонины и флавоноиды 56
3.2.2. Метод колоночной хроматографии 62
Глава 4. Стандартизация лекарственного растительного сырья - солодки корней 73
4.1. Методики приготовления растворов и реактивов 73
4.2. Методика качественного анализа солодки корней 74
4.3. Методика количественного анализа солодки корней 78
4.4. Методика качественного анализа солодки экстракта жидкого 82
4.5. Методика количественного анализа солодки экстракта жидкого...83
4.6. Методика качественного анализа солодки сиропа 87
4.7. Методика количественного анализа солодки сиропа 87
4.8. Методика качественного анализа солодки экстракта густого 90
4.9. Методика количественного анализа солодки экстракта густого 91
4.10. Методика качественного анализа солодки экстракта сухого 93
4.11. Методика количественного анализа солодки экстракта сухого...94
Глава 5. Исследования по разработке новых препаратов на основе корней солодки 98
5.1. Технология получения солодки экстракта жидкого 98
5.2. Разработка способа получения солодки сиропа 101
Общие выводы 106
Список литературы 108
Приложение
- Ботанико-фармакогностическая характеристика солодки
- Лекарственные средства на основе корней солодки
- Методы исследования веществ солодки корней
- Методика качественного анализа солодки корней
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время особую актуальность
приобретают исследования в плане расширения ассортимента доступных
широким слоям населения препаратов на основе лекарственного
растительного сырья (ЛРС). В этом отношении особый интерес представляют
виды солодки (солодка голая - Glycyrrhiza glabra L., солодка уральская -
Glycyrrhiza uralensis Fisch.), на основе корней которых выпускается целый
ряд препаратов (экстракты густой, сухой, сироп солодкового корня и др.).
Однако создание современных препаратов возможно лишь на основе
методик, отвечающих параметрам валидации. С учетом этого обстоятельства,
а также такого явления, как фальсификация лекарственных средств, особую
актуальность приобретают исследования, направленные на
совершенствование методик качественного и количественного анализа ЛРС и фитопрепаратов. Для стандартизации сырья и суммарных препаратов солодки ранее не использовались методы тонкослойной хроматографии (ТСХ) и государственные стандартные образцы (ГСО).
Кроме того, при решении этой проблемы необходимо учитывать то обстоятельство, что методики качественного и количественного анализа должны соответствовать принципу унификации или гармонизации в ряду: сырье-субстанция-лекарственная форма.
В ходе исследований учеными Самарского государственного медицинского университета и Всероссийского института лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) разработан Государственный стандартный образец глицирам (ФС 42-0034-00), причем при этом исправлена химическая структура глицирама и изучены особенности физико-химических свойств глицирризиновой кислоты. Ранее харьковскими учеными для целей стандартизации флавоноидных препаратов (ликвиритон, флакарбин) предложено использовать ГСО ликуразида (ФС 42-2573-88). Следовательно, появились объективные предпосылки для совершенствования методик
5 качественного анализа сырья и препаратов солодки с использованием хроматографических методов, в частности ТСХ, и соответствующих ГСО.
Цели и задачи исследования Целью настоящей работы является исследование по разработке методик качественного и количественного анализа сырья и препаратов солодки (экстракт жидкий).
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
Систематизация литературных данных о химическом составе солодки и ее фармакологическом действии.
Изучение условий хроматографического разделения сапонинов и флавоноидов корней солодки, позволяющих обнаруживать доминирующие биологически активные соединения (БАС) — глицирризиновую кислоту и ликуразид.
Разработка методики качественного анализа корней солодки.
Разработка методики количественного анализа корней солодки.
Разработка методик качественного и количественного анализа препарата «Экстракт солодки жидкий».
Обоснование способа получения препарата «Солодки сироп» на основе солодки экстракта жидкого.
Разработка проекта ФС «Солодки корни».
Научная новизна. Впервые изучен химический состав корней солодки голой, произрастающей в Самарской области. При этом выделены и идентифицированы с использованием УФ-, ЯМР-спектроскопии, масс-спектрометрии и результатов химических превращений глицирризиновая кислота, ликуразид, изоликвиритигенин, изоликвиритин, ликвиритигенин, ликвиритин, формононетин и ононин. Показана целесообразность проведения стандартизации сырья и препаратов солодки по доминирующим группам БАС - сапонинам (глицирризиновая кислота) и флавоноидам (ликуразид).
Для достоверного определения диагностических веществ в сырье и препаратах солодки предложено использовать ГСО. В случае определения
глицирризиновой кислоты предложено использовать стандарт глицирам (ФС 42-0034-00), а для анализа флавоноидов - ликуразид (ФС 42-2573-88), что позволит более четко осуществлять идентификацию диагностических веществ и, следовательно, обеспечит валидацию методик качественного анализа сырья и препаратов солодки.
Научно обоснована необходимость унификации методик качественного и количественного анализа сырья и суммарных препаратов солодки («солодки экстракт жидкий», «солодки экстракт густой», «солодки экстракт сухой» и «солодки сироп») с использованием методов тонкослойной хроматографии и прямой спектрофотометрии.
Практическая значимость.
Разработаны методики качественного и количественного анализа сырья солодки, что отражено в проекте ФС «Солодки корни».
Унифицированы методики качественного и количественного анализа сырья и препаратов солодки с использованием ТСХ-анализа и спектрофотометрии.
Разработаны методики качественного и количественного анализа «солодки экстракта жидкого».
Обоснована целесообразность оптимизации способа изготовления сиропа солодкового корня, что позволяет повысить содержание глицирризиновой кислоты в данном препарате в 3-3,5 раза.
Оформлен проект ФС «Солодки корни», который проходит экспертизу в Фармакопейном государственном комитете Минздравсоцразвития РФ (письмо № 130 от 27.01.05 г.).
Результаты исследований используются в научных изысканиях и в учебном процессе на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии Самарского государственного медицинского университета (акты внедрения от 01.03.2005 г.).
7 Положения, выдвигаемые на защиту:
Результаты изучения химического состава корней солодки, произрастающей в Самарской области.
Данные проведенных исследований по разработке подходов к стандартизации сырья солодки.
Методики качественного и количественного анализа «солодки экстракта жидкого».
Способ получения «солодки сиропа».
Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ Самарского государственного медицинского университета (№ Государственной регистрации 01200105332) и Республиканских программ:
1. «Совершенствование лекарственного обеспечения населения и
лечебно-профилактических учреждений в рыночных условиях» по теме:
«Создание лекарственных средств природного происхождения антимикробного, адаптогенного и гепатопротекторного действия» (№ Государственной регистрации 01990005277).
2. «Разработка методик качественного и количественного анализа
сырья, препаратов лекарственных растений, содержащих фенилпропаноиды
и флавоноиды» (№ Государственной регистрации 01990007536).
Апробация работы и публикации. Основные положения работы доложены и обсуждены на 2-ой Международной конференции молодых ученых и студентов « Актуальные проблемы современной науки» (Самара, 2001г.); на VII Всероссийском конгрессе «Экология и здоровье человека» (Самара,2001г.); на VIII Международном конгрессе «Актуальные проблемы экологии человека» (Самара, 2002 г.); на IX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2002 г.); на X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва,
8 2003г.); на Всероссийской конференции «Молодые ученые - медицине» -Аспирантские чтения -2003 (Самара, 2003 г.); на 4-ой Международной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные проблемы современной науки» (Самара, 2003 г.); на Региональной медицинской конференции «Тенденции и перспективы развития» (Самара, 2004 г.); на XXI International conference on polyphenols (Marrakech - Morocco, 2002r.); на XXII International conference on polyphenols (Helsinki-Finland,2004 г.).
Основное содержание диссертации опубликовано в 12 научных работах.
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 127 страницах машинописного текста, содержит 18 таблиц, 21 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (Глава 1), описания объектов и методик исследования (Глава 2), 3 глав, отражающих результаты собственных эксперементальных исследований и их обсуждение, общих выводов, приложения и списка литературы, включающего 204 источников, из которых 51 - на иностранных языках.
Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, отмечена новизна и практическая значимость полученных результатов, а также изложены положения, выносимые на защиту.
Ботанико-фармакогностическая характеристика солодки
В научной медицине используются три вида солодки: солодка голая {Glycyrrhiza glabra L.), солодка уральская (Glycyrrhiza uralensis Fisch.,) и солодка Коржинского (Glycyrrhiza Korshinskyi G. Grig), причем последний вид, возможно, гибридного происхождения солодки голой и солодки уральской. На практике предпочтение отдается солодке голой, так как в ней содержание БАС (глицирризиновая кислота) несколько выше. Солодка голая (Glycyrrhiza glabra L.) (солодка гладкая, лакрица, лакричник) (рис.1) - стебли прямостоячие, крепкие, простые или ветвистые, 50 -80 (150) см высотой, негусто коротко - пушистые и обычно с редко рассеянными точечными железками или железистыми шипиками; листочки прямые, ланцетно-шиловидные, мелкие, ко времени цветения опадающие; листья около 5-20 см длиной на коротко - пушистых и скудно — железистых черешках 1-3 см длиной, с 2-9 парами листочков; листочки продолговато-яйцевидные, эллиптические или ланцетные, около 2-4 см длиной и 1- 2,5 см шириной, снизу и (реже сверху) могут быть густо усажены точечными железками, нередко клейкие от обильных смолистых выделений [82,97,154,139]. Цветочные кисти довольно рыхлые, 5-12 см длиной; цветоносы около 3-7 см длиной, так же как и ось соцветия, коротко пушистые и слегка железистые; цветки 6-12 мм длиной; чашечка 5-7 мм длиной, может быть коротко-пушистая и железистая, с узко-ланцетными зубцами, равными трубке или немного превышающими ее; два верхних зубца почти вдвое короче, чем остальные; венчик беловато-фиолетовый; край листа и нижняя часть флага нередко беловатые; прилистники флага яйцевидные или эллиптические, на конце островатые, постепенно суженные в короткий ноготок; бобы продолговатые, прямые или слегка изогнутые, около 2-3 см длиной и 4-6 мм шириной, с крепкими стенками, голые или густо усаженные железистыми шипиками, нераскрывающиеся или раскрывающиеся поздно (после высыхания стеблей).
Солодка уральская (Glycyrrhiza uralensis Fisch.,) — отличается от солодки голой тем, что имеет густые цветочные кисти, плотные, 2-7 мм длиной с цветоносами 3-6 см длиной, которые, как и оси соцветий могут быть коротко-пушистые и железистые; цветки 14-23 мм длиной; чашечка 8-14 мм длиной, при основании сверху несколько мешковидно вздутая, прилистники флага продолговато-яйцевидные, эллиптические или продолговато-эллиптические, на конце округлые или слегка выемчатые, Рис. 1 СОЛОДКА ГОЛАЯ Glycyrrhiza glabra L. постепенно суженные в короткий ноготок; бобы линейно - продолговатые, 2-4 см длиной и 5-8 см шириной, серповидно изогнутые и поперечно- извилистые (со стороны швов), тесно скученные и переплетенные в плотный клубок; стенки бобов густо пушистые и усаженные точечными железками или железистыми шипиками; иногда развито только простое опушение или только железки или шипики [139,145].
Солодка Коржинского {Glycyrrhiza Korshinskyi G.GrigJ - имеет ряд особенностей которые отличают ее от солодки голой и солодки уральской. Стебли прямостоячие или приподнимающиеся, 30-70 см высотой, густо усаженные клейкими коричневатыми железками. Листья 5-12 см длиной, с короткими или железистыми (как оси листьев) черешками, с 2-5 парами листочков; листочки широко - эллиптические, яйцевидные или обратнояйцевид-ные, около 1-3 см длиной и 0,6-2,5 см шириной, с обеих сторон, но преимущественно с нижней. Цветочные кисти довольно рыхлые 2-6 см длиной. Бобы продолговатые, 1-3 см длиной и 4-7 см шириной, б.м. серповидно-изогнутые, поперечно-извилистые (при взгляде со стороны швов), густо усаженные бурыми железками или короткими железистыми шипиками. В остальном же по ботаническому описанию солодка Коржинского похожа на солодку голую и солодку уральскую [75,139,145].
Внешние признаки сырья. Куски корней и подземных побегов цилиндрической формы различной длины, толщиной от 0,5 до 5 см и более. Встречаются куски корней, переходящие в сильно разросшееся корневище до 15 см толщиной. Поверхность неочищенных корней и побегов слегка продольно морщинистая, покрытая бурой пробкой; очищенное сырье снаружи от светло-желтого до буровато-желтого цвета с незначительными остатками пробки; излом светло-желтый, волокнистый. Запах отсутствует; вкус сладкий, приторный, слегка раздражающий [36,113,117,146,156].
Строение корней и подземных побегов беспучковое. На поперечном разрезе видны многочисленные широкие сердцевинные лучи, придающие корням ясно лучистое строение, в ксилеме видны широкие просветы сосудов. Вдоль сердцевинных лучей часто образуются радиальные трещины. У побегов имеется небольшая сердцевина, у корней сердцевины нет.
Используется также резаное сырье, представляющее собой кусочки различной формы, размером: для неочищенного корня — от 1 до 10 мм, для очищенного — от 3 до 6 мм. Кроме того, используется порошок, состоящий из очищенного сырья светло-желтого цвета, проходящий сквозь сито с размером отверстий 0,125 мм [184,198,199].
Микроскопия. На поперечном срезе неочищенного корня видна многослойная пробка [75,139,145]. Под пробкой — первичная кора, состоящая из крупных тангентально - вытянутых клеток. У очищенных корней вместе с пробкой частично удалена и первичная кора. За первичной корой идет сильно развитая широкая вторичная кора. В ней хорошо заметны широкие, кнаружи иногда расширяющиеся сердцевинные лучи, чередующиеся с лубом, состоящим из ситовидных трубок, лубяных волокон и паренхимных клеток. Ситовидные трубки, кроме узкого слоя, прилегающего к камбию, сдавлены и представляют собой так называемый деформированный луб, образующий удлиненный конус, обращенный широким основанием к камбию, а вытянутая вершина проходит, изгибаясь между группами лубяных волокон. Лубяные волокна с сильно утолщенными стенками и малой, почти точечной полостью собраны группами и окружены кристаллоносной обкладкой. Паренхим-ные клетки коры и сердцевинных лучей содержат зерна крахмала — простые, округлые или яйцевидные, величиной 2—12 мкм, редко до 20 мкм. Древесина состоит из сосудов разного диаметра - от узкого до очень широкого, групп склеренхимных волокон с кристаллоносной обкладкой и паренхимы, содержащей крахмал. При окраске раствором йода сердцевинные лучи и паренхима окрашиваются в синий цвет, деформированный луб не окрашивается и остается сероватым, сосуды желтые, группы волокон коры и древесины оранжевые. На продольно-радиальном срезе в коре и древесине видны длинные, сильно утолщенные склеренхимные волокна с кристаллоносной обкладкой; в древесине узкие сосуды - сетчатые, средние - со щелевидными порами и широкие - с бочковидными короткими члениками и ромбическими окаймленными порами, расположенными косыми рядами.
В порошке под микроскопом видны обрывки тонкостенной паренхимы, клетки которой содержат большое количество крахмальных зерен, группы склеренхимных волокон коры и древесины, обычно с остатками кристалло-носной обкладки, и обрывки сосудов. Элементов пробковой ткани почти не встречается. При смачивании 80% серной кислотой порошок окрашивается в оранжево-желтый цвет (глицирризин) [113,156].
Лекарственные средства на основе корней солодки
В медицинской практике применяют порошок, сложный лакричный порошок, густой и сухой экстракты, сироп. Резаный корень входит в состав грудных, слабительных и мочегонных сборов [148]. Сложный порошок солодкового корня. Применяют при заболеваниях желудочно-кишечного тракта. Состав: 20 частей порошка корня солодки, 20 частей порошка из листьев сены, 10 частей порошка плодов укропа, 10 частей серы очищенной и 40 частей сахара. Порошок зеленовато-бурого цвета с запахом укропа и неприятным горьковато-соленым вкусом. Применяют как легкое слабительное средство при хроническом запоре.
Из сухого корня солодки в домашних условиях готовят также отвар: 10 г корня помещают в эмалированную посуду, заливают 200 мл горячей воды, нагревают в кипящей водяной бане под плотной крышкой 30 мин, и процеживают горячими через 10 мин, после снятия с водяной бани отжимают остаток, доводят кипяченой водой до первоначального объема (200 мл). Принимают по 1 столовой ложке 3-4 раза в день в течение 10 дней, в качестве отхаркивающего, спазмолитического и противовоспалительного средства.
Солодки экстракт густой (Glycyrrhizae extractum spissum) представляет собой густую массу бурого цвета со своеобразным запахом и приторно-сладким вкусом. При взбалтывании с водой образует коллоидный, сильно пенящийся раствор. Данный экстракт используется в качестве исходного сырья для производства препарата глицирама. Входит в состав некоторых галеновых препаратов, классический пилюльный экстракт и corrigens в микстурах [93,159].
Солодки экстракт сухой (Glycyrrhizae extractum siccum) или экстракт лакричного корня сухой. Буровато-желтый порошок со своеобразным запахом и приторно-сладким вкусом. При взбалтывании с водой образует коллоидный, сильно пенящийся раствор. Содержит не менее 25% глицирри-зиновой кислоты. Применяется так же, как и густой экстракт. На его основе изготавливают сироп и лакричный эликсир [57,93,143,158].
Солодки сироп (Glycyrrhizae sirup!) используют в педиатрии. Получают из экстракта солодкового корня густого (4 г), сахарного сиропа (86 г), спирта (10 г). Жидкость желто-бурого, своеобразного запаха и вкуса. Применяют в качестве отхаркивающего, противовоспалительного средства для облегчения отхождения мокроты при острых и хронических воспалительных заболеваниях верхних дыхательных путей и легких, а также для исправления вкуса в микстурах.
Эликсир грудной (Elixir pectoralis). Состав препарата: экстракта солодкового корня 60 частей, анисового масла 1 часть, спирта этилового 49 частей, раствора аммиака 10 частей, воды дистиллированной 180 частей. Представляет собой жидкость бурого цвета, сладковатую на вкус, с запахом аммиака и анисового масла. Применяют как отхаркивающее средство по 20-40 капель на прием. Детям назначают на прием столько капель, сколько лет ребенку [93].
Глицирам (Glycyramum) - аммониевая соль глицирризиновой кислоты, полученная из корней солодки, оказывает противовоспалительное и антиаллергическое действие, обусловленное умеренным стимулирующим влиянием на кору надпочечников [30,33]. Применяют при бронхиальной астме, экземе, аллергических дерматитах самостоятельно или в комбинации с кор-тикостероидами, кроме того, используют для предупреждения синдрома1 отмены при прекращении лечениякортикостероидами.
Выпускается в таблетках по 0,05 г в упаковках по 50 штук. Принимают таблетки внутрь по 0,05-0,1 г 2-4 раза в день за 30 мин до еды. Курс лечения от 2 недель до 6 месяцев [32,101]. Препарат из корней солодки "Глицирам" эффективен у детей, больных бронхиальной астмой, в дозе 0,2-0,6 г/сут. Под влиянием лечения на 7-10-й день у большинства больных разрешается бронхоспазм, улучшаются функциональные показатели проходимости дыхательных путей, уменьшается эо-зинофилия. Курс лечения продолжается 3-12 нед. Глицирам позволяет уменьшить дозу гормональных препаратов у гормональнозависимых больных или отменить их. На фоне клинического улучшения проба с АКТГ указывает на повышение активности коры надпочечников. Побочных явлений при применении препаратов солодки не отмечено [30,31,103,108].
Галеновые формы корня солодки и препарат "Глицирам" применяют при заболеваниях, связанных с гипофункцией надпочечников, при аддисоно-вой болезни, при системной красной волчанке, пузырчатке, хронических кожных заболеваниях, аллергических заболеваниях, у больных длительно принимающих стероиды [43,94]. При экземе, нейродермитах и аллергических дерматитах местное лечение сочетают с приемом внутрь глицирама в таблетках по 0,05 г 2-3 раза в сутки. Наилучшие результаты получены у больных с экземой и аллергическим дерматитом. Препараты солодки важны для практической медицины как антиаллергическое средство, так как в отличие от кортизона не нарушают физиологической защиты.
Ликвиритон (Liquiritonum) содержит сумму флавоноидов из корней солодки голой или солодки уральской [64,114]. Применяют при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, хронических гастритах в качестве спазмолитического, антисекреторного, противовоспалительного и способствующего регенерации слизистой оболочки средства. Выпускают в таблетках по 0,1 г, назначают внутрь по 0,1-0,2 г 3-4 раза в день за 30 мин до еды [140,141]. Курс лечения 20-30 дней. Препарат хорошо переносится больными.
Флакарбин (Flacarbinum) - комбинированный препарат, в 100 г которого содержится по 2 г ликуразида и кверцетина, по 10 г пектина и натрий -карбоксиметилцеллюлозы и 76 г глюкозы. Применяют как противовоспалительное, спазмолитическое, капилляроукрепляющее и мягкопослабляющее средство у больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки. Выпускают в гранулах зеленовато-желтого цвета, сладковатого вкуса. Назначают внутрь по 1/2 чайной ложки гранул 3 раза в день перед едой, запивают теплой водой.
В настоящее время особую актуальность приобретают исследования в плане совершенствования методик стандартизации сырья и изготовленных на их основе препаратов [10,42,47-49,53,67,137,179,180,191,203]. Это связано с тем, что в действующей нормативной документации на сырье (ГФ 10) и суммарные препараты «солодки экстракт густой» (ФС 42-2614-96), «солодки экстракт сухой» (ФС 42-2636-89) и «солодки сироп» (ФС 42-1187-78) в разделе качественные реакции не используются физико-химические методы, в частности, ТСХ, а также не применяются ГСО. В разделе количественное определение в нормативной документации на корни солодки и соответствующие препараты в методике количественного определения глицирризиновой кислоты также не используется ГСО. Кроме того, методики количественного определения глицирризиновой кислоты в сырье и суммарных препаратах не унифицированы, в особенности, в части реагента, используемого на стадии экстракции: в сырье - экстракцию осуществляют 3% ацетоновым раствором азотной кислоты, а в препаратах -3% ацетоновым раствором трихлоруксусной кислоты.
На наш взгляд, более удачно этот вопрос решен в случае препаратов, тогда как в анализе корней солодки методика плохо воспроизводима. Учитывая, что учеными Самарского государственного медицинского университета и ВИЛАР был разработан ГСО глицирам (ФС 42-0034-00) [51,56,58,91,92,120,125], причем была исправлена химическая структура гли-цирама и глицирризиновой кислоты и изучены особенности их физико-химических свойств. Кроме того, ранее харьковскими учеными для целей стандартизации флавоноидных препаратов (ликвиритон, флакарбин) предложено использовать ГСО ликуразида (ФС 42-2573-88). Следовательно, появились объективные предпосылки для совершенствования методик качественного и количественного анализа сырья, и препаратов солодки.
Методы исследования веществ солодки корней
С помощью метода колоночной хроматографии изучали химический состав корней солодки голой. Измельченные (3-6 мм) корни солодки (100,0) экстрагировали 40% спиртом, методом реперколяции по Чулкову (описание метода в главе 5). Для колоночной хроматографии экстрактивных веществ использовали следующие сорбенты: 1. Полиамид «Woelm» (Германия); полиамид, изготовленный на Олайн-ском заводе химреактивов. 2. Силикагель марки L 40/ 100 мкм и L 100/250 мкм (Чехия) 3. Сефадекс LH-20 (Швеция) Для элюирования использовали смеси растворителей, такие как: хлороформ - этиловый спирт, этиловый спирт - вода в различных соотношениях. При этом выделены тритерпеновые сапонины (таблица 9 соединение 1 и 2) и флавоноиды (таблица 9 соединение 3-9).
При кислотном гидролизе глицирризиновой кислоты получен агликон, соответствующий по своим физико-химическим константам 18-Р-глицирретовой кислоте (2). Таким образом, соединение (1) имеет структуру 3-0-(2 -0-p-D-глюкуронопиранозил) P-D-глюкуронопиранозида 18-Р-глицирретовой кислоты и является глицирризиновой кислотой [109,132,133]. Особенностью доминирующих флавоноидов солодки является, отсутствие в их структуре 5-ОН-группы, характерной для большинства флавоноидных соединений. Это подтверждается отсутствием в Н-ЯМР-спектрах (рис. 14 и 15) синглетного сигнала 5-ОН-группы в области 11,0-13,0 м.д. Об этом свидетельствует также обнаруженный в ЯМР-спектре дублетный сигнал Н-5 с КССВ 9 Гц при 7,72 м.д. Н-ЯМР спектр ликвиритигенина (3) (рис. 14) содержит характерные для флаванонов сигналы: двойные дублеты Н-2а с КССВ 13 и 3 Гц, Н-За с КССВ 17 и 13 Гц и Н-Зе с КССВ 17 и 3 Гц при 5,5 м.д., 3,0 м.д. и 2,6 м.д. соответственно.
В Н-ЯМР- спектре соединения 3 обнаружены также сигналы протонов Н-6 и Н-8 соответственно в виде двойного дублета с КССВ 2,5 и 9 Гц и дублета с КССВ 2,5 Гц. В ЯМР спектре ликвиритигенина присутствуют характерные для и-замещенного бокового фенила (кольцо В) двухпротонные дублетные сигналы с КССВ 9 Гц при 7,4 м.д. (2Н-2 ,6 ) и 6,9 м.д. (2Н-3 ,5 ). В данном спектре обнаружены такие синглетные сигналы 7-ОН и 4 -ОН групп при 9,50 и 8,60 м.д. соответственно. Масс спектр электронного удара соединения 3 содержит пик молекулярного иона (М+) с m/z 256, соответствующий составу С15Н12О4. В УФ-спектре соединения (3) присутствует максимум поглощения при 275 нм, характерный для флаванонов корней солодки.
Таким образом, совокупность УФ-, Н-ЯМР- и масс-спектров, а также данные физико-химических констант позволяют идентифицировать соединение 3 как ликвиритигенин (7,4 - дигидроксифлаванон) [55,61,61].
Соединение 4 имеет близкие к ликвиритигенину (3) спектральные характеристики (УФ-,ЯМР - спектры), но отличается хроматографической подвижностью и содержит в Н-ЯМР-спектре дополнительные сигналы, принадлежащие к углеводной части.
Наличие в Н-ЯМР-спектре дублетного сигнала аномерного протона глюкозы с КССВ 7 Гц при 5,0 м.д., а также обнаружение глюкозы и ликвиритигенина в кислотном гидролизате свидетельствует о том, что соединение 4 является (3-глюкопиранозидом ликвиритигенина. На основании данных УФ-спектров (наличие батохромного сдвига в присутствии ацетата натрия) глюкоза отнесена к 4 -ОН-группе ликвиритигенина. Таким образом, соединение (4) имеет структуру 4 -0-p-D-глюкопиранозида 7, 4 -дигидроксифлаванона (ликвиритин) [65].
Соединения 5-7 имеют оранжевую окраску, что в совокупности с данными УФ-спектров (характерные максимумы поглощения при 370 нм) позволило предположить, что они имеют халконовую природу. Доминирующим халконом является соединение (7), которое при кислотном и ферментативном гидролизе дает глюкозу, апиозу и агликон, идентифицированный как изоликвиритигенин (5).
В Н-ЯМР-спектре соединения 7 (рис. 15) обнаружены сигналы аномерных протонов глюкозы (дублет с КССВ 7 Гц при 5,18 м.д.) и апиозы (уширенный синглет при 5,53 м.д.). В данном Н-ЯМР спектре имеются сигналы, принадлежащие ароматическим протонам агликона: магнитный сигнал 2 -0Н-группы при 12,9 м.д., дублетный сигнал Н-6 с КССВ 9 Гц при 8,23 м.д., дублетный синглет протонов Н-а и Н-(3 с КССВ 2 Гц при 7,87 м.д., двухпротонные дублеты Н-2,6 и Н-3,5 с КССВ 9,0 Гц при 7,78 и 6,95 м.д.соответственно, двойной дублет Н-5 с КССВ 2,5 и 9 Гц при 6,67 м.д. и дублет Н-3 с КССВ 2,5 Гц при 6,6 м.д.
На основании- спектральных данных, результатов кислотного и ферментативного гидролиза, а также сравнения с достоверно известным образцом ГСО ликуразида соединение (7) идентифицировано как ликуразид.
Аналогичным образом идентифицированы также соединения 5 и 6, одно из которых является изоликвиритигенином (5), а другое-изоликвиритином (6) [177, 202].
Из корней- солодки выделены также изофлавоны 8 и 9, идентифицированные на основании данных УФ-, 1Я-ЯМР -спектров, результатов химических превращений и непосредственного сравнения с достоверно известными образцами веществ как формононетин (8) и ононин (9) [154,155,202].
Методика качественного анализа солодки корней
Исследования химического состава корней солодки позволили сформулировать подходы к стандартизации и разработать методики качественного и количественного анализа корней солодки с учетом принципа унификации и валидации методов анализа [42,47,48,49,177,195,196].
Нами были изучены условия- хроматографического разделения сапонинов и флавоноидов корней солодки, позволяющие обнаруживать доминирующие БАС — глицирризиновую кислоту и ликуразид. Для достоверного определения веществ нами предложено использовать государственные стандартные образцы. Так, для определения глицирризиновой кислоты предложено использовать стандарт глицирам (ФС 42-0034-00), а для флавоноидов - ликуразид (ФС 42-2573-88) [142]. Использование данных стандартов позволяет исключить ошибки при идентификации диагностических веществ и, следовательно, обеспечивать валидацию методик качественного анализа сырья и препаратов солодки. Использование в качестве ГСО глицирама объясняется тем, что глицирризиновая кислота вещество нестабильное, что препятствует использованию данного соединения в качестве государственного стандартного образца.
При использовании пластинок «Силуфол УФ 254» и «Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ» (система растворителей хлороформ - метанол - вода, 26:14:3) ликуразид обнаруживается на хроматограмме в виде доминирующего желтого или желтовато-оранжевого пятна с величиной Rf около 0,5, а глицирризиновая кислота - в виде фиолетового флуоресцирующего пятна (254 нм) с величиной Rf около 0,3 (на уровне ГСО глицирама). При этом обнаруживаются также пятна ликвиритина (Rf около 0,6), ононина (Rf около 0,7), ликвиритигенина и изоликвиритигенина (Rf около 0,8), а также формононетина (Rf около 0,9) (рис. 18). К 2,0 г измельченного сырья (с точностью до 0,01 г) прибавляют 20 мл 40 % этилового спирта и извлекают при нагревании на водяной бане в течение 15 минут. Затем полученное извлечение фильтруют через фильтр (красная полоса).
На линию старта пластинки "Силуфол УФ-254" или "Сорбфил-ПТСХ-П-А-УФ" микропипеткой наносят 0,01 мл полученного фильтрата и затем рядом 0,02 мл (20 мкг) 0,1 % раствора ГСО глицирама и 0,02 мл (20 мкг) 0,1% раствора ликуразида. Пластинку с нанесенными пробами помещают- в вертикальную камеру, которую предварительно насыщают не менее 24 ч смесью растворителей: хлороформ-метанол-вода в соотношении 26:14:3, и хроматографируют восходящим способом.
Когда фронт растворителей пройдет около 13 см (силуфол) или 9 см (сорбфил), пластинку вынимают из камеры, сушат на воздухе в течение 5 мин и просматривают в видимом свете и в УФ-свете при длине волны 254 нм. На хроматограмме на уровне пятна ГСО ликуразида должно обнаруживаться пятно желтого цвета с величиной Rf около 0,5 (ликуразид), а также фиолетовое флуоресцирующее пятно с Rf около 0,3 (глицирам). Хроматограмму опрыскивают свежеприготовленным раствором диазобензолсульфокислоты в насыщенном растворе карбоната натрия, помещают в сушильный шкаф - и выдерживают при температуре 110 С в течение 5 мин. На хроматограмме извлечения- на уровне пятна ГСО ликуразида должно проявиться оранжевое пятно с Rf около 0,5 соответствующее пятну ликуразида; допускается наличие других пятен (рис.18).
Проведены исследования по использованию определенных систем растворителей (рис. 17,18). При этом показано, что оптимальное разделение диагностических компонентов (глицирризиновая кислота и ликуразид) достигается в более полярной системе (рис. 18). За основу разработанной методики нами взят фармакопейный метод (Государственная..., 1968), предусматривающий определение глицирризиновой кислоты методом прямой спектрофотометрии после препоративного выделения и очистки целевого продукта. Однако в методику внесены следующие изменения: во-первых, вместо 3 % ацетонового раствора азотной кислоты нами взят 3 % ацетоновый раствор трихлоруксусной кислоты, что позволяет сделать методику воспроизводимой (в фармакопейном методе выпадения осадка после подкисления не наблюдается), во-вторых, в методику включено использование ГСО глицирама, что повышает достоверность анализа. Использование 3 % ацетонового раствора трихлоруксусной кислоты позволяет не только унифицировать подход к извлечению глицирризиновой кислоты, используемый в случае экстрактов солодки (Фармакопейная..., 1989; 1996), но и обеспечить валидацию параметров с точки зрения воспроизводимости методики. УФ-спектр раствора очищенной глицирризиновой кислоты имеет кривую поглощения, сопоставимую по характеристикам с УФ-спектром раствора глицирама (рис. 19), что позволяет использовать ее в качестве ГСО.
Около 2,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу коническую со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 20 мл 96% этилового спирта. В колбу вносят 20 мл 3 % ацетонового раствора кислоты трихлоруксусной и нагревают на водяной бане в течение 30 мин. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр, колбу промывают двумя порциями ацетона по 5 мл и выливают в общий объем. К полученному фильтрату прибавляют по каплям раствор аммиака концентрированный, не встряхивая колбу до появления обильного осадка (рН от 8,3-9 по универсальному индикатору). Раствор с осадком переносят на фильтр. Колбу и фильтр промывают 10 мл ацетона. Осадок с фильтром переносят в колбу, в которой проводилось осаждение, и растворяют в 50 мл воды, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 250 мл и доводят объем раствора водой до метки (раствор А).
