Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Химический состав, биологическая активность и методы стандартизации сырья и препаратов элеутерококка и лимонника (литературный обзор) 11
1.1 Химический состав корневищ и корней элеутерококка колючего 11
1.2 Химический состав плодов и семян лимонника китайского 14
1.3 Стандартизация сырья и препаратов элеутерококка 19
1.4 Стандартизация сырья и препаратов лимонника 21
1.5 Фармакологическая активность действующих веществ элеутерококка колючего 24
1.6 Фармакологическая активность действующих веществ лимонника китайского 25
1.7 Заключение к главе 1 26
Глава II. Разработка метода стандартизации препарата «Элима» 28
2.1 Изучение химического состава препарата "Элима" 29
2.2 Определение подлинности препарата "Элима" 33
2.2.1 Определение подлинности по спектрам поглощения и качественным реакциям .- 34
2.2.2 Определение подлинности методом ВЭТСХ 39
2.2.2.1 Подтверждение подлинности элимы по наличию элеутерозида В 41
2.2.2.2 Подтверждение подлинности элимы по наличию схизандринов 48
2.2.2.3 Подтверждение подлинности элимы по наличию рутина 51
2.3 Количественное определение элеутерозида В в препарате "Элима"
методом ВЭТСХ 56
2.4 Обсуждение результатов и заключение к главе II 63
Глава III. Анализ сырья элеутерококка и экстракта элеутерококка жидкого с использованием метода ВЭТСХ 67
3.1 Определение подлинности сырья и препаратов элеутерококка методом ВЭТСХ 68
3.2 Количественное определение элеутерозида В в сырье элеутерококка методом ВЭТСХ 71
3.3 Количественное определение элеутерозида В в экстракте элеутерококка жидком методом ВЭТСХ 76
3.4 Количественное определение элеутерозида В в оригинальном препарате методом ВЭТСХ 80
3.5 Обсуждение результатов и заключение к главе III 81
Глава IV. Изучение содержания БАВ в свежих, высушенных и замороженных плодах лимонника, в настоях и соке из плодов 84
4.1 Исследование содержания БАВ в свелшх плодах и соке лимонника 85
4.1.1 Качественный анализ БАВ свежих плодов и сока лимонника 86
4.1.1.1 Изучение лигнанового комплекса плодов, мякоти и сока лимонника 88
4.1.2 Количественное определение БАВ в свежих плодах и соке лимонника 94
4.2 Изучение влияния условий сушки на содержание БАБ в плодах лимонника 100
4.3 Изучение влияния замораживания на содержание БАБ в плодах лимонника 105
4.4.1 Исследование изменений в содержании БАБ
при хранении замороженных плодов 108
4.5 Выход БАБ из высушенных плодов лимонника в настои ПО
4.6 Обсуждение результатов и заключение к главе IV 113
Глава V. Разработка вопросов стандартизации свежих плодов и сиропа лимонника 116
5.1 Разработка метода стандартизации свежих плодов лимонника 116
5.1.1 Фармакогностические показатели качества свежих плодов лимонника 118
5.1.2 Определение подлинности свежих плодов лимонника 120
5.1.3 Разработка методики количественного определения органических кислот в плодах лимонника 122
5.2. Разработка метода стандартизации сиропа лимонника 126
5.2.1 Определение подлинности сиропа лимонника по спектрам поглощения и качественным реакциям 126
5.2.2 Количественное определение содержания суммы органических кислот в сиропе лимонника 132
5.2.3 Изучение вопросов хранения сиропа лимонника 135
5.2.4 Сравнительное исследование сиропов лимонника различных производителей 142
5.3 Обсуждение результатов и заключение к главе V 147
Общие выводы 149
Литература 151
- Стандартизация сырья и препаратов элеутерококка
- Определение подлинности по спектрам поглощения и качественным реакциям
- Количественное определение элеутерозида В в сырье элеутерококка методом ВЭТСХ
- Количественное определение БАВ в свежих плодах и соке лимонника
Введение к работе
Актуальность темы. Несмотря на возросшую мировую популярность таких известных дальневосточных адаптогенов, как элеутерококк колючий и лимонник китайский, за более чем десятилетний период на их основе не было зарегистрировано оригинальных отечественных лекарственных средств. Это и послужило предпосылкой для разработки на кафедре фармакогнозии и ботаники Дальневосточного медицинского университета нового многокомпонентного препарата "Элима". Для производства препарата, кроме сырья элеутерококка и лимонника, используется сырье витаминных растений.
Чрезвычайно важно при оценке подлинности многокомпонентных препаратов подтверждение присутствия действующих веществ, обусловленных каждым из сырьевых компонентов, особенно дорогостоящих видов сырья, таких, как семена лимонника китайского.
Современные требования к стандартизации фитопрепаратов предполагают оценку их качества по содержанию действующих веществ, обеспечивающих фармакологическую активность. Наиболее важным в фармакологическом отношении и относительно нестабильным из биологически активных веществ (БАВ) элеутерококка является элеутерозид В. В связи с этим разработка метода количественного определения элеутерозида В в новом препарате и, соответственно, в сырье элеутерококка представляет научно-практический интерес.
В последние годы за рубежом для анализа фитопрепаратов и растительного сырья все большее значение приобретает метод ВЭТСХ. В частности, этот метод приводится в американской монографии на плоды лимонника китайского. Метод ВЭТСХ особенно актуален для анализа многокомпонентных фитопрепаратов.
Не менее важным для отечественной фармации является вопрос использования плодов лимонника. Несмотря на тот общеизвестный факт, что
лимонник представляет собой ценное лекарственное растение, он недостаточно используется в фармации: высушенные плоды в основном не поступают на фармацевтический рынок, а свежие и замороженные применяются как пищевое сырье, преимущественно для получения соков и сиропов. Это связано с отсутствием положительного практического опыта по сушке плодов и научных данных по содержанию БАВ в свежих и замороженных плодах, в соке и сиропе лимонника, обосновывающих возможность их применения в фармации. Следовательно, научное обоснование использования свежего сырья лимонника для производства лекарственных средств и биологически активных добавок, изучение способов консервирования свежих плодов и разработка методов оценки их качества в определенной степени обеспечивают решение описанной проблемы.
Таким образом, разработка вопросов стандартизации сырья и препаратов элеутерококка и лимонника, в первую очередь оригинального лекарственного средства «Элима», относится к важному направлению фармацевтических исследований.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилась разработка научно-обоснованных методов стандартизации сырья и препаратов лимонника и элеутерококка. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
определить качественный химический состав препарата "Элима";
разработать метод определения подлинности препарата "Элима";
разработать методику количественного определения элеутерозида В в препарате «Элима», сырье элеутерококка и экстракте элеутерококка жидком;
определить содержание БАВ в свежих плодах, соке и настоях лимонника;
определить влияние сушки и замораживания плодов лимонника на содержание БАВ;
разработать метод стандартизации свежих плодов и сиропа лимонника;
- изучить влияние сроков и условий хранения на содержание БАВ в сиропе лимонника.
Связь исследования с проблемным планом фармацевтических наук.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Дальневосточного государственного медицинского университета и Вычислительного Центра ДВО РАН. Тема утверждена на заседании научно-плановой комиссии ДВГМУ (прот. № 7 от 12.04.02).
Научная новизна. Изучен качественный состав нового препарата «Элима», установлено содержание основных макро- и микроэлементов, идентифицированы 17 веществ в препарате. Установлено положение экстремальных точек в УФ спектре элимы, разработаны условия хроматографирования и идентификации препарата.
Разработан ВЭТСХ метод количественного определения элеутерозида В в препарате «Элима», сырье и экстракте элеутерококка. Метод ВЭТСХ впервые предложен для стандартизации отечественных фитопрепаратов.
Определено количественное содержание БАВ в свежих плодах, соке и настоях лимонника. Впервые проведена идентификация лигнанов в мякоти и соке лимонника. Исследовано влияние трех способов сушки на содержание БАВ в плодах лимонника.
Научно обоснована возможность использования свежих плодов лимонника в фармацевтической практике. Установлены фармакогностические показатели плодов и рекомендованы нормативы содержания действующих веществ, обеспечивающие рациональное использование свежего сырья лимонника.
Статистически обоснованы спектральные характеристики плодов и сиропа лимонника. Исследовано влияние сроков хранения сиропа на содержание БАВ: количественные изменения БАВ выражены в уравнениях регрессии. Приведенные формулы позволяют рассчитывать срок хранения по
Методы анализа элимы и сиропа лимонника использованы в работе ОТК предприятий-производителей. Получены акты внедрения.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 9 работ. Основные результаты доложены на научных конференциях молодых ученых Дальневосточного государственного медицинского университета в 1999 и 2000 гг., региональной научно-практической конференции "Клиническая фармакология на Дальнем Востоке" в 2001 году, международной научной конференции «Азиатско-тихоокеанский регион в глобальной политике, экономике и культуре XXI века» (Хабаровск, 2002), межлабораторной конференции Вычислительного центра ДВО РАН (Хабаровск, 2003), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 65-летию Хабаровского края «Природные ресурсы Хабаровского края: проблемы науки и образования» (Хабаровск, 2003), межкафедральной научной конференции (Хабаровск, 2003), заседании Ученого Совета ВЦ ДВО РАН (Хабаровск, 2004).
На защиту выносятся: обоснование методик определения подлинности и количественного содержания элеутерозида В в препарате "Элима", сырье и препаратах элеутерококка; результаты изучения содержания БАВ в свежих и замороженных плодах, соке и настоях лимонника, влияния способов сушки на содержание БАБ; обоснование методов стандартизации плодов и сиропа лимонника, результаты изучения влияния сроков и способов хранения сиропов на содержание действующих веществ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 165 страницах, содержит 52 таблицы, 32 рисунка. Работа состоит из введения, литературного обзора (I гл.), экспериментальной части (II-V гл.), выводов, списка литературы, включающего 141 источник и приложения.
В литературном обзоре рассматриваются вопросы, касающиеся химического состава сырья лимонника и элеутерококка, методы стандартизации сырья и препаратов этих растений, а также фармакологическое
действие индивидуальных веществ. Во второй главе описана разработка метода определения подлинности и количественного определения элеутерозида В в препарате «Элима». В третьей главе приводятся разработанные методики качественного и количественного определения элеутерозида В в сырье элеутерококка, экстракте элеутерококка жидком и биологически активных добавках, содержащих сырье элеутерококка. В четвертой главе приводятся данные качественного и количественного анализа свежих плодов и сока лимонника, результаты изучения влияния сушки и замораживания на содержание БАВ в плодах лимонника. В пятой главе описана разработка метода стандартизации свежих плодов и сиропа лимонника. В приложении приведены документы на элиму и сироп лимонника, а также акты внедрения материалов диссертации.
Стандартизация сырья и препаратов элеутерококка
Элеутерококк колючий - Eleutherococus senticosus (Rupr. et Maxim.) Maxim. - является официнальным лекарственным растением в России. В Государственном Реестре лекарственных средств, разрешенных к применению, приведены корневища и корни элеутерококка, а также экстракты элеутерококка сухой и жидкий и таблетки экстракта элеутерококка сухого [31].
Не все методы определения подлинности, включенные в действовавшие фармакопейные статьи, отличались высокой специфичностью. Так, ранее, в качестве фармакопейной качественной реакции для экстракта элеутерококка жидкого описана реакция с хлоридом железа на фенольные соединения [91].
В современных действующих нормативных документах на сырье и экстракты элеутерококка для определения подлинности используются хромато-графические методы. В фармакопейной статье на экстракт элеутерококка сухой ВФС 42-2090-92 и в новом проекте ФС предлагается для подтверждения подлинности применять метод ВЭЖХ [15]. Идентификация проводится путем соотнесения времени удерживания раствора исследуемого экстракта и раствора эл еутерозида В.
Для подверждения подлинности сырья и экстракта элеутерококка жидкого в действующей документации на сырье ФС 42-2725-90 и в новом проекте ФС на экстракт предлагается использовать ТСХ в системе хлороформ — метанол 20 вода. Детектирование элеутерозида В осуществляется в УФ свете при длине волны 254 нм.
В. А. Куркин считает, что проблемы, возникающие при качественном анализе сырья и препаратов элеутерококка настолько серьезны, что не исключают возможности фальсификации продукции [50]. Для определения подлинности сырья и препаратов элеутерококка этот ученый предлагает использовать ТСХ. Детектирование веществ проводится в УФ свете при длине волны 254 и 366 нм и в видимом свете после обработки серной кислотой. При этом предлагается использовать значения Rs относительно пятна элеутерозида В, рассчитанные для наиболее характерных компонентов корневищ элеутерококка - элеутерозидов D, Bi и изофраксидина [51].
Тот факт, что сырье и препараты элеутерококка представляют большой практический интерес для фармации и медицины с одной стороны, современные требования к эффективности и безопасности лекарственных средств с другой, делают актуальным поиск экономичных, универсальных и специфичных физико-химических методов анализа для включения их в новые проекты НД. Так, например, ранее для количественного определения суммы элеутерозидов в корнях и корневищах элеутерококка колючего применялся спектрофотометри-ческий метод после экстракции метанолом и предварительного хроматографи-рования [55]. Метод был включен в ФС 42-2725-90. В настоящее время в Изменении к ФС 42-2725-90 включено количественное определение элеутерозида В методом ВЭЖХ. Этот же метод предложен в качестве фармакопейного для определения содержания элеутерозида В в экстракте элеутерококка сухом [15].
Метод микроколоночной ВЭЖХ был предложен для количественного определения элеутерозида В в сухом экстракте и таблетках экстракта элеутерококка сухого [21,22].
В последнее время в России все большее внимание уделяется разработке методик сквозного аналитического контроля всех стадий производства препаратов из корней и корневищ элеутерококка [65]. С. А. Пинеевым и Т. А. Со 21
Кольской разработана методика определения элеутерозида В методом ВЭЖХ в изократическом режиме на обращенно-фазных колонках, в результате чего время анализа сократилось до 15 минут. Воспроизводимость результатов при этом экспресс-анализе вполне удовлетворительная: погрешность единичного определения анализов составила 4,7% в жидком экстракте, 13,2% - корнях элеутерококка, 3,9% - сухом экстракте, 7,5% - таблетках.
Работы по стандартизации сырья и препаратов элеутерококка проводятся и за рубежом. Так, D. A. Whiting и Н. Wagner была разработана методика ВЭЖХ-анализа, позволяющая контролировать содержание элеутерозида В и элеутерозида D (раздельно) [99,136].
Для качественного анализа препаратов, содержащих сырье элеутерококка, зарубежными учеными предложен метод ВЭТСХ. Присутствие гликозидов лигнанов и производных кофейной кислоты подтверждается в системе хлороформ: метанол: вода (70:30:4), агликоны, сирингорезинол, изофраксидин, сито-стерол и олеаноловая кислота - в системе толуол: этилацетат: ацетон (60:20:8). Детектирование веществ проводится в УФ свете при 254 и 366 нм, а также в видимом свете после обработки полиэтиленгликоль - реактивом, ванилин-фосфорным реактивом или 20% раствором хлорида ртути в хлороформе [100].
Из вышеизложенного можно заключить, что в современных условиях для анализа сырья и препаратов элеутерококка используются хроматографические методы, преимущественно ВЭЖХ.
Определение подлинности по спектрам поглощения и качественным реакциям
При стандартизации многокомпонентного препарата на первый план выходят трудности выбора биологически активных соединений, позволяющих репрезентативно оценивать качество препарата [61]. Наиболее важной и одновременно сложной задачей при разработке раздела "подлинность" многокомпонентных препаратов является подтверждение использования всех сырьевых компонентов при получении препарата. Решению этой задачи оптимально подходит подтверждение соответствующих видов сырья по специфическим веществам-маркерам, не обязательно имеющим высокую фармакологическую активность, но соответствующим строго определенному сырьевому компонен-ту[77Д01]. Особенно это касается дорогостоящих видов сырья, таких, например, как семена лимонника китайского. В качестве специфичных маркеров для сырья лимонника могут выступать схизандрины, для корневищ и корней эле утерококка — элеутерозиды, для корней аралии - аралозиды. Обнаружение этих веществ в составе препарата обосновало выбор маркеров для стандартизации элимы.
В ряде случаев при анализе многокомпонентных фитопрепаратов, видимо, имеет смысл использовать маркеры, соответствующие нескольким сырьевым компонентам, по определению Н. А. Тюкавкиной - приоритетные [77]. В качестве такого маркера для анализа элимы может использоваться рутин, содержащийся в препарате и соответствующий сырью шиповника, крапивы и рябины.
В современной нормативной документации (НД) достаточно часто для определения подлинности индивидуальных и многокомпонентных препаратов, лекарственного растительного сырья применяются спектрофотометрические методы. Например, спектр о фотометрически подтверждается подлинность эликсиров и бальзамов "Демидовский", "Московия", сборов «Гепафит» и «Элека-сол», плодов калины обыкновенной[14,16,17,18]
Качественные реакции, хотя и обладают низкой специфичностью, приводятся практически в каждом нормативном документе на фитопрепараты. В связи с этим УФ спектр и качественные реакции на некоторые группы БАВ были рассмотрены как возможные варианты определения подлинности препарата.
В целом для определения подлинности элимы наиболее целесообразным представляется подход, сочетающий традиционные методы и современные тенденции в анализе: определение подлинности как по специфическим веществам, так и по одной или нескольким группам веществ, характерных для разных видов сырья.
Для определения подлинности многокомпонентного препарата "Элима" были опробованы качественные реакции на дубильные вещества, тритерпено-вые соединения и сапонины, а также УФ спектры водного и спиртового растворов препарата и препарата с добавками кислоты хлористоводородной и натрия карбоната.
В ходе разработки методики 1 мл препарата помещали в мерную колбу вместимостью 250 мл, доводили до метки водой или раствором спирта этилового 40%, перемешивали и снимали УФ спектр в диапазоне длин волн 240-380 нм. К 100 мл полученного раствора добавляли 2 мл НС1 разведенной, к другим 100 мл добавляли 1,0 г натрия карбоната и также снимали УФ спектр. В качестве раствора сравнения использовали соответственно воду, раствор спирта этилового 40%, кислоту хлористоводородную и раствор натрия карбоната. Поскольку разведение элимы водой не приводило к появлению осадка или помутнению, а спектры водного и спиртового растворов препарата существенно не различались, все выполненные далее анализы относятся к водным растворам препарата. Соответствующие спектры для одного образца препарата представлены на рисунке 3.
Для подтверждения наличия дубильных веществ к 2 мл препарата прибавляли несколько капель раствора железа окисного хлорида, раствор окрашивался в буро-зеленый цвет. Также проводилась реакция с 1% раствором ванилина в концентрированной серной кислоте на тритерпеновые соединения: по мере развития реакции на границе двух слоев образовывалось красно-бурое кольцо.
Для подтверждения наличия сапонинов 5 мл препарата помещали в мерный цилиндр с пришлифованной пробкой вместимостью 25 мл, доводили объем водой до 20 мл, энергично встряхивали в течение 1 минуты. Образовывалась стойкая пена, не исчезающая в течение 1 минуты. Результаты качественных реакций с разными сериями препарата приведены в таблице
По результатам проделанной работы можно заключить, что для подтверждения подлинности препарата "Элима" можно использовать качественные реакции и спектрофотометричекие методы анализа. В УФ части спектра соответствующих растворов должны обнаруживаться экстремумы: для водного раствора препарата - максимум и плечо в интервалах 277-289 нм и 305-325 нм и минимум - 260-267 нм; для раствора препарата с добавлением натрия гидрокарбоната — отсутствие максимума при 280 нм и наличие плеча или максимума в интервале 342-368.
В утвержденной редакции ФСП 42-0281122001, в разделе подлинность получение спектров с добавками не предусмотрено, т. к. они не дают дополнительной информации, но удлиняют анализ препарата: добавка кислоты хлористоводородной не вызывает изменений в характере спектра, добавка натрия карбоната приводит к изменениям, характерным для фенольных соединений. Поскольку присутствие фенолов подтверждается по ФСП реакцией с хлоридом железа (III), приведение еще одного доказательства представляется нерациональным.
Однако, хотя вышеописанные методы и характеризуются рядом достоинств, таких, как хорошая воспроизводимость и малая трудоемкость, имеется и основной недостаток этих методов - низкая специфичность. Особенно проявляется этот недостаток в анализе многокомпонентных препаратов, таких, как рассматриваемый нами. Поэтому возникла необходимость в использовании дополнительных методов определения подлинности, отличающихся высокой специфичностью.
Количественное определение элеутерозида В в сырье элеутерококка методом ВЭТСХ
В ходе отработки методики были опробованы различные системы растворителей: бутанол - уксусная кислота- вода (БУВ) (4:1:5), БУВ (4:1:2), этил-ацетат - уксусная кислота - вода (ЭУВ) (10:4:1), толуол -этилацетат - уксусная кислота (70:33:3), этилацетат - муравьиная кислота- вода (10:4:1), хлороформ -этанол - вода (ХЭВ) (71:33:6). Хроматографирование проводилось на пластинках разных марок: Kieselgel 60 F254 фирмы Merck, Silpres N-1, Силуфол УФ254 и Сорбфил ПТСХ. Наилучшие результаты при хроматографировании удалось получить, используя пластинку Merck Kieselgel 60 F254 и систему растворителей БУВ (85:5:10). Для подготовки пробы к хроматографическому определению в качестве базовой использовалась методика, приведенная в Изменении к ФС на сырье элеутерококка [90]. Предварительно устанавливались оптимальные условия методики: продолжительность экстрагирования элеутерозида В, соотношение сырье - экстрагент, необходимость очистки от сопутствующих соединений, мешающих определению.
На начальном этапе были опробованы два варианта методики: с очисткой спиртового извлечения на хроматографической колонке и без очистки. 1,0 г измельченного сырья помещали в коническую колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 40 мл спирта этилового 60 % и нагревали на водяной бане с обратным холодильником в течение 30 минут. Полученное извлечение фильтровали, 20 мл наносили на колонку с алюминия оксидом. Элеутерозид В элюи-ровали с колонки 60 мл спирта этилового 60%, полученный элюат упаривали и наносили на хроматографическую пластинку. Содержание элеутерозида В в первом случае составило 0,056%. Во втором варианте методики, исключающем стадию очистки, содержание элеутерозида В было 0,059%. Различия между двумя полученными значениями оказались статистически недостоверными. Дополнительным подтверждением чистоты пятна, соответствующего элеутеро-зиду В в треке неочищенного экстракта, стало УФ детектирование. При УФ де тектировании пятен на хроматограммах было установлено, что спектр пятна в треке извлечения отождествляется со спектром элеутерозида В, как в первом, так и во втором вариантах методики (рис. 17).
Для полной идентификации пятен хроматограммы сканировали при трех длинах волн:265 нм, 300 нм, 350 нм. Анализ хроматограммы, построенной самописцем "Metrohm", подтвердил предположение о соответствии веществ в треках стандартного препарата и извлечения из сырья: при А,=265 нм пики имеют одинаковую форму и положение на хроматограмме, при 350 нм поглощение отсутствует и при 300 нм имеется незначительное поглощение во всех случаях. На следующем этапе определялись оптимальное время и кратность экстрагирования. Были проверены четыре варианта условий экстрагирования: - экстракция на водяной бане в течение 2 часов; - экстракция на водяной бане в течение 1 часа; - экстракция на водяной бане в течение 30 минут; - 3-х кратная экстракция по 30 минут.
Сравнение данных по критериям Стьюдента и Фишера (Р=0,95) показало отсутствие значимого влияния выбранных параметров методики на результаты анализа (FH. FKp. и tH. tKp.). В связи с этим для методики было выбрано время экстрагирования 30 минут. Оптимальное соотношение сырье-экстрагент- 1:50. Метрологическая характеристика принятого варианта методики приведена в таблице 16. Относительная погрешность определения составила 2,8%, є отдельного результата - 7,4%.
Методика апробирована на 8 партиях сырья. Среднее содержание элеутерозида В составило 0,049%, относительное отклонение содержания элеутерозида В ( є ) для разных партий сырья - 11,8 % (табл. 17).
Нижний предел содержания элеутерозида В в сырье элеутерококка, определенный экспериментально (0,039%) и расчетным путем по формуле х±Зо (0,028%), в принципе совпадает с утвержденным ранее фармакопейным нормативом - не менее 0,03%. Таким образом, можно считать, что ВЭТСХ методика удовлетворяет решению задач стандартизации сырья элеутерококка. Для включения в ФС в качестве альтернативной может быть предложена нижеследующая методика.
Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в коническую колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 45 мл спирта этилового 60 % и нагревают на водяной бане с обратным холодильником в течение 30 минут. Полученное извлечение фильтруют в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят спиртом этиловым 60% до метки. Полученный раствор упаривают на роторном испарителе до сухого остатка, растворяют в 2-3 мл спирта этилового 40% и переносят в мерную колбу вместимостью 5 мл, доводят объем раствора спиртом этиловым 40% до метки и перемешивают. 2 мкл испытуемого раствора наносят на хроматографическую пластинку Kieselgel 60 F254 фирмы "Merck" полоской шириной 10 мм на расстоянии 15 мм от нижнего края пластинки с помощью линомата "Camag". На эту же пластинку наносят 2 мкл 0,03% раствора ГСО элеутерозида В. Пластинку высушивают на воздухе в течение 5 минут, затем помещают в камеру со смесью растворителей бутанол - уксусная кислота - вода (85:5:10) и хромато-графируют восходящим способом.
Когда фронт растворителей пройдет 65 мм от линии старта, пластинку вынимают, высушивают на воздухе в течение 5 минут и сканируют денситометром "Camag" при длине волны 265 нм. Скорость сканирования 1 мм/сек, скорость движения ленты самописца 50 мм/мин.
Количественное определение БАВ в свежих плодах и соке лимонника
Качественный анализ проводился хроматографически (БХ, ТСХ) с использованием соответствующих детектирующих реактивов. Хроматограммы просматривались в видимом и УФ свете при 254 и 366 нм. Для анализа применялись вещества-свидетели и стандартные хроматограммы.
Акцент делался на обнаружение органических кислот и фенольных соединений лимонника.
Изучение органических кислот плодов лимонника китайского проводилось методом восходящей бумажной хроматографии в системе растворителей этиловый спирт: аммиак : вода (13:4:3) на бумаге "Filtrak" FN-1. Хроматогра-фированию подвергались водные извлечения, которые получали следующим образом: 10 г свежих плодов лимонника измельчались с 10 мл воды, не нарушая целостности семян, сок выдавливался через марлю и отфильтровывался. В качестве веществ - свидетелей на хроматограмму наносились водные и спиртовые растворы органических, фенольных и оксикоричных кислот: лимонной, яблочной, винной, янтарной, щавелевой, уксусной, муравьиной, бензойной, салициловой, кофейной, коричной, хлорогеновой, сорбиновой. Идентификация веществ проводилась в УФ свете при длине волны 366 нм до и после обработки бромтимоловым синим. Было подтверждено присутствие в плодах лимонника лимонной кислоты (Rf=0,42), щавелевой кислоты (Rf=0,46), винной кислоты (Rf=0,55), яблочной кислоты (Rf=0,63), янтарной кислоты (Rf=0,68), сорбиновой кислоты (Rf=0,75). Информация об обнаружении сорбиновой кислоты в плодах лимонника в литературе отсутствует.
Полученные данные в равной степени относятся к плодам и соку лимонника, так как подготовка пробы плодов к анализу фактически сводилась к получению сока.
Для обнаружения антоцианов в плодах лимонника применялась ТСХ в системе растворителей этилацетат : муравьиная кислота : вода (44:33:1) на пластинках марки Sorbfil. После хроматографирования наблюдались два пятна розового цвета со значениями Rf, равными 0,2 и 0,4. Сравнение пластинки со стандартной хроматограммой калины подтвердила предположение о принадлежности этих веществ к классу антоцианов.
Для обнаружения флавоноидов 5 г мякоти (измельченных семян) лимонника экстрагировались три раза 50 мл спирта этилового 60 %. Полученные спиртовые экстракты упаривались под вакуумом до объема 20 мл и фильтровались через бумажный фильтр. Затем последовательно проводилась трехкратная экстракция фильтратов семян и мякоти, а также сока лимонника в делительной воронке 20 мл хлороформа и 20 мл этилацетата. Полученные этилацетатные фракции упаривались до объема 1мл и хроматографировались на пластинке Merck в системе растворителей бутанол : метанол : вода : муравьиная кислота (50:3:2:6). В качестве веществ - свидетелей на хроматограмму наносились рутин, кверцетин, лютеолин, лютеолин-7-глюкозид, гиперозид. Идентификация проводилась сравнением УФ-спектров пятен, соответствующих веществам свидетелям, с УФ спектрами пятен в треках этилацетатных фракций семян, мякоти и сока лимонника. Было подверждено присутствие лютеолин-7-глюкозида в мякоти плодов и соке лимонника (Rf=0,84). Кроме того, на хроматограмме наблюдались дополнительные пятна с разными значениями Rf. Обработка хро-матограммы 3% раствором хлорида железа (Ш) позволила сделать вывод о наличии в семенах, мякоти и соке лимонника фенольных соединений.
Анализ плодов и сока на полисахариды, проведенный по ГФ XI, дал положительный результат. Изучение лигнанового комплекса в свежих плодах, мякоти и соке лимонника представляет большой интерес, обусловленный рядом обстоятельств.
Во-первых, схизандрины наиболее важные в фармакологическом отношении вещества, с действием которых связывают активность высушенных плодов и семян, а также получаемых из них готовых лекарственных средств и биологически активных добавок к пище.
Во-вторых, неизвестно, содержатся ли лигнаны только в семенах или они также находятся в мякоти и переходят в сок.
Наконец, производство сока лимонника и распространение в последние годы парафармацевтической продукции, полученной из мякоти или сока лимонника, делает чрезвычайно важным научное обоснование использования такого рода средств с позиций химического состава. В настоящее время продукции, полученной из сока лимонника, часто присваиваются биологические свойства, установленные для семян или настойки из семян лимонника.
Обнаружение лигнанового комплекса и изучение его качественного состава в плодах, мякоти и соке проводилось методом ВЭТСХ. Параллельно при анализе хроматографировалась проба семян, так как это облегчало идентификацию схизандринов.
На первом этапе брали около 5,0 г плодов, около 5,0 мякоти и около 2,0 семян лимонника из одной партии . Для приготовления образцов для хромато-графирования каждую навеску экстрагировали в аппарате Сокслета объемом 100 мл спиртом этиловым 96% в течение 2 часов. Полученный экстракт фильтровали через бумажный фильтр и упаривали до 2-3 мл, после чего переносили в мерную колбу вместимостью 5 мл и доводили спиртом этиловым 96% до метки.
На стартовую линию пластинки Kieselgel 60 F254 фирмы Мегск.наносили по 2 мкл полученных растворов из плодов, семян и мякоти. Пластинку помещали в камеру, обложенную фильтровальной бумагой, в систему растворителей толуол - этилацетат - ледяная уксусная кислота (70:33:3). Хроматографирова-ние проводили восходящим способом.
