Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы. сведения о растениях рода рододендрон (ботаническая характеристика, химический состав, применение, стандартизация)
1.1 Ботаническая характеристика рододендрона золотистого 10
1.2 Химический состав различных видов рододендронов 14
1.3 Применение рододендрона золотистого в медицине 18
1.4 Стандартизация и контроль качества сырья и препаратов рододендрона золотистого 21
1.5 Стандартизация и контроль качества гомеопатических лекарственных средств 29
Выводы к главе I 37
ГЛАВА II. Товароведческий анализ лекарственного растительного сырья рододендрона
2.1 Исследование морфологических признаков сырья 45
2.2 Исследование микроскопических признаков сырья 47
2.3 Установление номенклатуры и норм числовых показателей 53
2.3.1 Определение влажности сырья 53
2.3.2 Определение содержания золы общей и золы, нерастворимой в растворе 10 % хлористоводородной кислоты 53
2.3.3 Определение содержания допустимых примесей 55
2.3.4 Определение измельченности сырья 57
2.3.5 Изучение радиологической и микробиологической чистоты сырья 57
2.4. Изучение стабильности сырья в процессе хранения 60
2.5 Разработка нормативной документации на сырье 63
Выводы к главе II 64
ГЛАВА III. Фитохимическое изучение ЛРС рододендрона 65
3.1 Разработка критериев подлинности ЛРС рододендрона 65
3.2 Разработка методик качественного и количественного определения 70 БАВ
3.2.1 Методики качественного и количественного определения фенольных соединений в сырье рододендрона 71
3.2.1.1 Качественное определение фенольных соединений в побегах рододендрона 71
3.2.1.2 Разработка методики количественного определения суммы фенольных соединений в пересчете на галловую кислоту 74
3.2.1.3 Изучение содержания фенольных соединений в рододендроне Адамса 86
3.2.2 Качественный и количественный анализ арбутина в сырье рододендрона золотистого 87
3.2.3 Исследование тритерпеновых соединений 97
3.2.3.1 Качественный и количественный анализ тритерпеновых соединений сырья рододендрона золотистого 98
3.2.3.2 Изучение содержания тритерпеновых соединений рододендрона Адамса 105
3.2.4 Исследование полисахаридов в ЛРС рододендрона 106
3.2.4.1 Качественный и количественный анализ полисахаридов сырья рододендрона золотистого 106
3.2.4.2 Исследование содержания полисахаридов в рододендроне Адамса 114
3.3 Исследование динамики накопления веществ фенольной природы в ЛРС рододендрона золотистого в зависимости от стадии вегетации 115
Выводы к главе III 116
ГЛАВА IV. Фитохимическое исследование настоек гомеопатических матричных рододендрона
4.1 Технология настоек гомеопатических матричных Rhododendron 118
4.2 Разработка методик качественного и количественного определения фенольных соединений в НГМ рододендрона 119
4.3 Количественное определение арбутина в НГМ рододендрона золотистого 130
4.4 Разработка методик количественного определения тритерпеновых соединений в НГМ рододендрона 134
4.5 Разработка методик количественного определения полисахаридов в НГМ рододендрона 137
4.6 Исследование качественного состава органических кислот в НГМ рододендрона золотистого 141
Выводы к главе IV 144
ГЛАВА V. Разработка показателей качества и установление срока годности ЛРС, НГМ rhododendron aureum, анализ гомеопатических разведений
5.1 Разработка показателей качества побегов рододендрона. Установление срока годности сырья 146
5.2 Разработка показателей качества и установление срока годности НГМ рододендрона 154
5.3 Методика анализа гомеопатических разведений НГМ Rhododendron aurewn 162
Выводы к главе V 165
Общие выводы 166
Литература 168
- Стандартизация и контроль качества сырья и препаратов рододендрона золотистого
- Определение содержания золы общей и золы, нерастворимой в растворе 10 % хлористоводородной кислоты
- Разработка методики количественного определения суммы фенольных соединений в пересчете на галловую кислоту
- Разработка методик количественного определения полисахаридов в НГМ рододендрона
Введение к работе
Актуальность темы. Снижение уровня жизни в сочетании с ухудшающейся экологической обстановкой и неблагоприятными социальными факторами отрицательно сказываются на здоровье людей. В этих условиях внедрение лекарственных средств, обладающих мягким щадящим действием и одновременно оказывающих лечебный эффект в малых дозах является актуальной задачей современной фармацевтической науки. Особое значение в решение данной проблемы приобретают гомеопатические лекарственные средства.
Возросший во всем мире интерес к традиционным методам лечения, к которым в России относят и гомеопатию, привел к значительному увеличению доли гомеопатических лекарственных средств (ГомЛС) на фармацевтическом рынке.
В Российской Федерации отсутствует отечественная гомеопатическая фармакопея, наличие которой унифицировало бы требования к качеству ГомЛС, способствовало бы производству безопасных и действенных лекарственных препаратов.
Исходными субстанциями для изготовления ГомЛС являются настойки гомеопатические матричные (НГМ). Количество зарегистрированных ГомЛС в Российской Федерации насчитывает более 600 наименований комплексных и более 1200 однокомпонентных ГомЛС, при этом зарегистрировано всего около 30 наименований НГМ, что, безусловно, не удовлетворяет существующим потребностям производства.
Для организации выпуска качественных и безопасных ГомЛС своевременным является углубленное изучение исходного лекарственного растительного сырья (ЛРС). В последние годы большое внимание уделяется фитохимическим и фармакологическим исследованиям тех лекарственных растений, которые применяются как в официнальной, так и в народной медицине.
В связи с этим является актуальным фитохимическое изучение лекарственных растений с целью разработки нормативной документации на них (НД) и создание отечественной Гомеопатической фармакопеи.
На данный момент в России зарегистрировано 5 гомеопатических лекарственных средств на основе рододендрона золотистого (Rhododendron aureum Georgi), семейства Вересковые — Ericaceae. Из них 3 монокомпонентных препарата гранулы гомеопатические, капли гомеопатические монокомпонентные, а также гомеопатический многокомпонентный препарат «Метео-плюс» в виде гранул. Помимо выше перечисленного, зарегистрирован также препарат для ветеринарии «Хондратон», выпускаемый в виде таблеток, геля и инъекций. Основными симптомами для принятия гомеопатических препаратов рододендрона золотистого являются:
Ревматические боли с типичным ухудшением в дождливую погоду и перед изменение погоды.
Усиление симптомов ночью и в состоянии покоя, улучшение от движения. Боли локализуются глубоко в надкостнице.
Особые показания: первично-хронический полиартрит мелких суставов (пальцы рук).
Пузырьковые высыпания.
Поражения яичек. Эпвдидимит. Невралгия семенных канатиков. Последствия гонореи и сифилиса (нервные поражения).
Сердечные жалобы. Иногда это связано с ощущением страха и ухудшением при перемене погоды.
Лицевые невралгии, зубные боли с улучшением после еды и от тепла
В связи с этим считаем целесообразным и своевременным разработку из сухого и свежего сырья рододендрона золотистого настойки матричной гомеопатической и соответствующей нормативной документации.
Кроме того, химический состав побегов рододендрона как лекарственного растительного сырья изучен недостаточно, методики стандартизации отсутствуют. Поэтому, актуальным является фитохимическое изучение рододендрона с использованием современных физико-химических методов, разработка методик стандартизации, создание нормативной документации.
Цель и задачи исследования. Целью настоящих исследований является сравнительное изучение высушенных и свежих побегов рододендрона золотистого и настоек гомеопатических матричных и разработка методик их стандартизации.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Изучить фитохимический состав свежесобранного и высушенного сырья рододендрона золотистого с использованием физико-химических методов.
Изучить морфологические признаки сырья.
Разработать методики качественного и количественного анализа биологически активных веществ в рододендроне золотистом.
Получить настойку гомеопатическую матричную из высушенного и свежего сырья рододендрона золотистого и провести исследование химического состава полученных настоек. Разработать методики контроля качества настоек гомеопатических матричных.
Провести сравнительное фитохимическое исследование рододендрона золотистого и рододендрона Адамса.
Разработать и оформить проекты Фармакопейных статей на «Рододендрон золотистый побеги свежие», «Рододендрон золотистый побеги» и настойку гомеопатическую матричную «Rhododendron aureum Dl», «Rhododendron aureum (Rhododendron)».
Научная новизна. Анализ уровня стандартизации сырья и настоек гомеопатических матричных позволил сформулировать необходимость исследования и разработки лекарственного растительного сырья, использования его в гомеопатии и разработку на его основе НГМ.
На основании микроскопического анализа побегов рододендрона, установлены диагностически значимые признаки, характерные для сырья.
Установлены качественные характеристики высушенного и свежего сырья рододендрона золотистого.
Разработаны методики количественной оценки в сырье и НГМ рододендрона золотистого фенольных соединений в пересчете на галловую кислоту, тритерпеновых сапонинов в пересчете на урсоловую кислоту методом, моносахаридов в пересчете на глюкозу методом спектрофотометрии (СФМ); качественное и количественное определение арбутина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ); а также качественное определение органических кислот в НГМ рододендрона методом ВЭЖХ.
Установлены закономерности различия содержания БАВ в зависимости от физического состояния растения.
Разработаны унифицированные методики качественного и количественного анализа сырья и НГМ рододендрона золотистого на основе чего предложены критерии подлинности и нормы содержания действующих веществ.
Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны:
Проект ФС «Рододендрон золотистый свежие побеги»;
Проект ФС «Рододендрон золотистый побеги высушенные»;
Проект ФС «Рододендрона золотистого D1 настойку гомеопатическую матричную»;
Проект ФС «Рододендрона золотистого настойку гомеопатическую матричную».
Основные положения, выносимые на защиту:
Результаты сравнительного изучения химического состава свежесобранного и высушенного сырья и настоек гомеопатических матричных ан его основе;
Результаты разработки методик качественного и количественного анализа действующих веществ в ЛРС и НГМ с использованием современных методов физико-химического анализа рододендрона золотистого;
» Разработка проектов фармакопейных статей на ЛРС и НГМ в соответствии с учетом современных требований качества на лекарственные средства.
Связь задач и исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Работа выполнена в рамках комплексной темы кафедры «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований». Per. Номер 01.2.006 06 352.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ.
Объем и структура диссертации
Стандартизация и контроль качества сырья и препаратов рододендрона золотистого
Рододендроны были известны с древних времен. Первые упоминания растения относятся к 380 год до н.э. Ксенофонтом [17]. многие виды рододендронов издавна находили широкое применение в качестве целительных растений в Индии, Китае, Тибете, Японии [29].
Растение рододендрон золотистый прославил И.Г.Гмелин, отметивший болеутоляющее действие его листьев, применяемых при болях суставов ног [3,4].
Впервые название Rhododendron chrysanthum, вошедшее в научную терминологию, дает Петер Симон Паллас в 1776 году в своем труде, где он описывает использование травы в народной медицине « при ломотах и болезней суставов». В 1786 году П.С. Паллас опубликовывает труд «Описание растений Российского Государства» и в главе под заголовком «Пьянишники» приводит различные виды рододендронов, в том числе и рододендрон золотистый, который применяли в виде крепкого чая при желудочных заболеваниях, ревматизме, подагре, болезнях почек. Доказательством безвредности автор считал продолжительное применение больными отваров в больших дозах, что проверено им самим.
В настоящее время рододендрон золотистый широко используется в современной народной медицине. В качестве сырья используют надземную часть, ветви и листья.
Препараты кашкары обладают выраженным сердечным действием и при применении у больных с сердечно-сосудистой недостаточностью снижают венозное давление, увеличивают скорость кровотока, повышают диурез, уменьшают отеки и нормализуют работу сердца (Орлов, Петухина, 1944). По отношению к стрептококкам, стафилококкам и патогенной кишечной флоре обладают сильным бактерицидным действием (Чуланова, 1959). При заболевании почек препараты растения стоит назначать с большой осторожностью из-за раздражающего действия на мочевыводящие пути. [79,80,92,15 8]
Применяют рододендрон золотистый в виде жидкого экстракта, настойки и настоя [92,156,157]. Настойка на 40% этиловом спирте из надземной части, при приеме внутрь, используется при ревматизме и простуде, вяжущее при желудочных заболеваниях [67,98,152,154], потогонное [130,135], при внутренних кровотечениях и женских болезнях, болеутоляющее — при раке молочной железы [51,98]. В народной медицине кашкару назначают также в виде водочного настоя, который готовят из 1 чайной ложки измельченных листьев кашкары на 200 мл водки. Такой препарат принимают внутрь (1 чайная ложка в четверти стакана теплой воды 3 раза в день) при простудных заболеваниях в качестве потогонного, назначают также как мочегонное средство, при токсикозе, бесплодии, ревматизме, воспалительных заболеваниях, эпилепсии, головной боли, бессоннице и неврозах; в виде спринцеваний - при эрозии шейки матки; в виде полосканий - при заболевании полости рта и горла и т.д.[9,25,39.44,48,57,76,130,68,28,50,136,148,150]. Настойка и настой из сухих ветвей используются как болеутоляющее, противоревматическое и отхаркивающее средство, а так же для лечения подагры и лихорадки [13,33,75,142,143,149,151]. Настой из листьев в тибетской медицине используется для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, гинекологических, гастроэнтеритов, хроническом суставном ревматизме [23,27,28,37,45,146,148,149,150]. Водные отвары и экстракты обладают хорошим противовоспалительным действием и применяются в стоматологии при заболевании десен, стоматитах, неприятном запахе изо рта. Полоскания отваром кашкары назначают при ангинах. Обычно, в этом случае, готовят 10-15% отвар, им полощут горло в течение 3 суток через каждые 30-40 минут (ночью — через 2-3 часа). В виде ванн - при радикулите, полиартрите, ревматизме, подагре, ишиасе, невралгиях и обморожениях [76,77,78,128,138,139,140,141,157], местно при скрофулезе [157]. Ножные ванны, особенно в сочетании с приемом настоя внутрь рекомендуют при гипертонической, болезни [90,92,93,94,105,106,130,136]. Свежие листья используют в виде кашицы при обморожениях, нарывах, фурункулах, абсцессах и в качестве ранозаживляющего средства [23]. В Китае готовят чай из листьев рододендрона золотистого, используемый как гипотензивное средство [125,126,128,129,136]. Рододендрон достаточно широко применяется в гомеопатической медицине. Используется в основном три вида: Rhododendron aureum G., Rhododendron campylocarpum Hook., Rhododendron ferrugineum L. Сырьем являются ветви с листьями и цветками или облиственные ветви [73]. Основными симптомами для принятия гомеопатических препаратов рододендрона золотистого являются: Ревматические боли с типичным ухудшением в дождливую погоду и вообще перед изменение погоды. Усиление симптомов и болей ночью и в состоянии покоя, улучшение от движения. Боли локализуются глубоко в надкостнице. Особые показания: первично-хронический полиартрит маленьких суставов (пальцы рук). Невралгия рук. Пузырьковые высыпания. Поражения яичек. Эпидидимит. Невралгия семенных канатиков. Последствия гонореи и сифилиса (нервные поражения). Сердечные жалобы. Сердце бьется сильно. Иногда это связано с ощущением страха и ухудшением при перемене погоды. Лицевые невралгии, зубные боли с улучшением после еды и от тепла [81,82,95,120,121,122]. Отвар рододендрона золотистого в гомеопатии применяют при отравлениях ртутью, заболеваниях слизистых оболочек, при головной боли, а также в виде гомеопатических гранул D3, СЗ, С6 и выше, капель D3, СЗ и выше при остром и хроническом ревматизме, невралгии, лицевой боли, плеврите, воспалении яичка, лимфатических отеках, расстройствах пищеварения, заболеваниях глаз, ушей, климаксе [4,5,12,23,24,31,49,51,57,81,82].
Определение содержания золы общей и золы, нерастворимой в растворе 10 % хлористоводородной кислоты
Сырье рододендрона золотистого {Rhododendron aureum Georgi) находит разнообразное применение в медицинской практике. Биологическая активность растения зависит от действия комплекса органических и неорганических соединений, содержащихся в них. В этом комплексе наиболее важная роль принадлежит фенольным соединениям (флавоноиды, дубильные вещества, фенолкарбоновые кислоты), тритерпеновым сапонинам, полисахаридами, органическим кислотам и др.
Для установления подлинности побегов рододендрона в НД, кроме макроскопического и микроскопического методов, которые изложены выше (см. п.п. 2.1 и 2.2), нами предложено использовать тесты, основанные на качественных реакций и методике ТСХ.
На основании данных химического изучения состава БАВ рододендрона золотистого, в разделе «Качественные реакции» проекта НД предусмотрено проведение общеизвестных качественных реакций на наличие: танинов (темно-зелёное окрашивание при добавлении 5% раствора железа окисного хлорида), арбутина (реакция с натрия карбонатом и дихлорхинонахлоримидом в спирте этиловом - синее окрашивание), флавоноидов (красное окрашивание при реакции с 95%спиртом этиловым, порошком магния и концентрированной хлористоводородной кислотой), свободных Сахаров с реактивом Фелинга (должно наблюдаться появление осадка кирпично-красного цвета) и методики ТСХ для определения наличия фенольных соединений.
К 2,0 г измельчённого воздушно-сухого сырья рододендрона золотистого, проходящего сквозь сито с размером отверстий 2 мм или к 2.0 г грубоизмельчённого свежего сырья, прибавляют 20 мл 45% спирта этилового. Нагревают с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 1-го часа. Смесь охлаждают, фильтруют (испытуемый раствор). Методика проведения анализа: К 1 мл испытуемого раствора прибавляют 5 мл воды и 1 мл 5% раствора железа окисного хлорида: наблюдается темно-зелёное окрашивание (танины). 1,5 мл раствора испытуемого помещают в выпарительную чашку и выпаривают на кипящей водяной бане досуха. Остаток растворяют в 2 мл воды. Полученный раствор пропускают через колонку, заполненную алюминия оксидом (нейтральный) размером 0,5x2 см. К фильтрату прибавляют 0,1 мл2%раствора натрия карбоната, 0,1 мл 2% раствора дихлорхинонахлоримида в спирте этиловом. Наблюдается синее окрашивание (арбутин). К 1 мл испытуемого раствора прибавляют 1 мл 95% спирта, 0.1 г порошка магния и 1 мл концентрированной хлористоводородной кислоты; постепенно появляется красное окрашивание (флавоноиды); К 1 мл испытуемого раствора прибавляют 2 мл реактива Фелинга и нагревают до кипения. Выпадает кирпично-красный осадок (сахара). На линию старта хроматографической пластинки (Kieselgel 40 F254; E.Merck, Darmstadt) размером 15 х 20 см наносят по 20 мкл испытуемого раствора и 10 мкл растворов сравнения на расстоянии 1,5 см от края (извлечение наносят полосой, растворы свидетелей - в точку). Пластинку подсушивали на воздухе в течение 2-3 минут и хроматографировали в системе растворителей: этилацетат-хлороформ-кислота уксусная ледяная (15:83:2) восходящим способом (предварительное насыщение камеры 1 ч). Длина пробега растворителей 10 см. Затем пластинку вынимают из камеры, высушивают на воздухе и опрыскивают 20% раствором кислоты фосфорномолибденовой в 90% спирте этиловом. Хроматограмму помещают в сушильный шкаф и выдерживают при температуре 100-105 С в течение 10 мин. На хроматограмме испытуемой настойки должны обнаруживаться не менее 4 зон адсорбции с Rf около 0,59 (соответствующее гиперозиду); 0,68 (соответствующее арбутину); 0,75 (соответствующее рутину); 0,92 (соответствующее галловой кислоте). ,Rf= К 2,0 г измельчённого воздушно-сухого сырья рододендрона золотистого, проходящего сквозь сито с размером отверстий 2 мм или к 3.0 г грубоизмельчённого свежего сырья, прибавляют 10 мл 45% спирта этилового. Трехкратно экстрагируют. К полученному извлечению прибавляют 8% раствор ацетата свинца (удаление дубильных веществ, флавоноидов). Выпавший осадок отфильтровали, оставшийся раствор наносили на окись алюминия (4 степень активности) и элюировали этиловым спиртом (испытуемый раствор). На линию старта хроматографической пластинки (Kieselgel 40 F254; E.Merck, Darmstadt) размером 15 х 20 см наносят по 20 мкл испытуемого раствора и 10 мкл растворов сравнения на расстоянии 1,5 см от края. Пластинку подсушивали на воздухе в течение 2-3 минут и хроматографировали в системе растворителей: хлороформ-метанол-вода (63:23:3) восходящим способом (предварительное насыщение камеры 1 ч). Длина пробега растворителей 10 см. Затем пластинку вынимают из камеры, высушивают на воздухе и опрыскивают 0,5% спиртовым раствором ванилина в 50% ортофосфорной кислоте. Хроматограмму помещают в сушильный шкаф и выдерживают при температуре 100-105 С в течение 10 мин. На хроматограмме испытуемого раствора, приготовленного из свежего сырья, обнаруживается 6 зон адсорбции с Rf около 0,46 фиолетового цвета (соответствующее рододендрину), около 0,85 светло-фиолетовый цвет (соответствующее рододендролу), около 0,65 розово-фиолетового цвета (соответствующее арбутину), а также неидентифицированные зоны с Rf около 0,75, 0,60 и 0,68. На хроматограмме испытуемого раствора, приготовленного из высушенного сырья, обнаруживается 6 зон адсорбции с Rf около 0,44 фиолетового цвета (соответствующее рододендрину), около 0,86 светло- фиолетовый цвет (соответствующее рододендролу), около 0,67 розово-фиолетового цвета (соответствующее арбутину), а также неидентифицированные зоны с Rf около 0,77; 0,59 и 0,69.
Разработка методики количественного определения суммы фенольных соединений в пересчете на галловую кислоту
Изучение качественного состава тритерпеновых сапонинов проводили методом ТСХ. Для идентификации использовали водно-спиртовое извлечение. Для этого 10,0 г сухого сырья, предварительно измельчённого до размера частиц, проходящих сквозь сито с размером 2мм или 7,0 свежего грубоизмельчённого сырья помещали в колбу объёмом 200 мл, прибавляли по 70 мл 70 % этилового спирта (для сухого сырья) и 70 мл 90% спирта этилового для свежего сырья, присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течении 1 часа с момента закипания спирто-водной смеси в колбе. После охлаждения смесь фильтровали в мерную колбу вместимостью 100 мл через бумажный фильтр и объём доводили соответствующим растворителем до метки (испытуемый раствор).
В качестве раствора сравнения использовали растворы урсоловой и олеаноловой кислот в 95% спирте этиловом. Для этого около 0,010 г кислот помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляли 25 мл спирта этилового 95 %, перемешивали до растворения и доводили тем же растворителем до метки (РСО).
Методика проведения анализа. В качестве неподвижной фазы использовали пластины Kieselgel 40 F254; E.Merck, Darmstadt. На линию старта пластин наносили по 20 мкл исследуемого раствора и по Юмкл растворов сравнения и хроматографировали восходящим способом в системе растворителей толуол-этилацетат (93:7). Длина пробега фронта растворителей 15 см. Пластину высушивали на воздухе и опрыскивали проявляющим реагентом: анисовый альдегид - уксусная кислота ледяной -серная кислота концентрированная в соотношении:0,5мл-50мл-1мл.
Нагревали в сушильном шкафу при температуре 100-105 С в течение 10 минут. На хроматограммах испытуемых растворов рододендрона золотистого из свежего и высушенного сырья отмечены 14 зон с Rf около: 0,12 (розовая); 0,18 (розовая); 0,24 (синяя); 0,26 (синяя); 0,31 (фиолетовая); 0,38 (фиолетовая); 0,41 (фиолетовая); 0,44 (фиолетовая); 0,52 (фиолетовая); 0,65 (зелёная); 0,81 (красная); 0,84 (голубая); 0.85 (розовая); 0.92 (красно-фиолетовая).
Определение суммы тритерпеновых соединений в пересчете на урсоловую кислоту в сырье рододендрона проводили спектрофотометрическим методом, основанным на взаимодействии урсоловои кислоты с серной кислотой концентрированной и получении окрашенного комплекса.
Для выбора РСО при количественной оценке суммы тритерпеновых соединений были сняты спектры поглощения окрашенных комплексов урсоловои и олеаноловой кислот с серной кислотой концентрированной. Для этого около 0,02 г (точная навеска) РСО урсоловои или олеаноловой кислоты помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 80 мл кислоты серной концентрированной и выдерживали на водяной бане при температуре 70С в течение одного часа и доводили до метки серной кислотой концентрированной. Раствор перемешивали (раствор А). К 0.8 мл раствора А прибавляли 9,2 мл кислоты серной концентрированной. Перемешивали (РСО) и снимали спектр поглощения полученного окрашенного раствора в интервале длин волн 220-430 нм. Таким образом, максимум поглощения окрашенных комплексов урсоловои и олеаноловои кислот с концентрированной серной кислотой совпадают при длине волны 306,0+5 нм. Таким образом, для определения суммы тритерпеновых соединений возможно применение в качестве РСО как олеаноловои, так и урсоловои кислот.
Методика проведения анализа. Для исследования 4,0 г(точная навеска) сухого сырья, предварительно измельчённого до размера частиц, проходящих сквозь сито с размером 2мм, или свежего грубоизмельчённого сырья помещали в колбу объёмом 200 мл, прибавляли по 70 мл 70 %, этилового спирта (для сухого сырья) и 90% спирта этилового для свежего сырья, присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течении 1 часа с момента закипания спирто-водной смеси в колбе. После охлаждения смесь фильтровали в мерную колбу вместимостью 100 мл через бумажный фильтр и объём доводили соответствующим растворителем до метки (раствор А).
По 0,5 мл раствора А помещают в выпарительную чашку и растворитель удаляют нагреванием на водяной бане досуха. Сухой остаток в выпарительной чашке обрабатывают дважды порциями по 5 мл хлороформа. Хлороформные извлечения фильтруют через обеззоленный фильтр «синяя лента». Хлороформ выпаривают на водяной бане. К сухому остатку прибавляют 100 мл серной кислоты концентрированной, перемешивают и выдерживают при температуре 70С (водяная баня) в течение 60 минут.
Спектр поглощения полученного комплекса снимают в интервале длин волн 220-430 нм для выбора длины волны. Спектр поглощения окрашенного комплекса имеет максимум поглощения при длине волны 312±5 нм. Таким образом, в наших исследованиях мы использовали длину волны 311 нм. Время устойчивости комплекса и время гидролиза 60 минут.
Разработка методик количественного определения полисахаридов в НГМ рододендрона
Для идентификации свободных Сахаров сырья рододендрона золотистого использовали водно-спиртовое извлечение. Для этого 10,0 г сухого сырья, предварительно измельчённого до размера частиц, проходящих сквозь сито с размером 2мм или 7,0 свежего грубоизмельчённого сырья помещали в колбу объёмом 200 мл, прибавляли по 70 мл 50 %, этилового спирта (для сухого сырья) и 70 мл 90% спирта этилового для свежего сырья, присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течении 1 часа с момента закипания спирто-водной смеси в колбе. После охлаждения смесь фильтровали в мерную колбу вместимостью 100 мл через бумажный фильтр и объём доводили соответствующим растворителем до метки (исследуемый раствор).
В качестве раствора сравнения использовали растворы Сахаров в спирте этиловом. Для этого по 50 мг глюкозы, фруктозы, арабинозы и рамнозы растворяли в 5 мл воды в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводили до метки спиртом этиловым 50% (РСО).
Методика проведения анализа. В качестве неподвижной фазы использовали пластины Kieselgel 40 F254; E.Merck, Darmstadt. На линию старта пластин наносили по 20 мкл исследуемого раствора и по 20 мкл растворов сравнения и хроматографировали восходящим способом в системе растворителей вода-метанол-уксусная кислота конц-хлористый этилен в соотношении 10:15:25:50. Длина пробега фронта растворителей 15 см.
Пластину высушивали на воздухе и опрыскивали проявляющим реагентом: тимол-серная кислота конц.-спирт этиловый 95% в соотношении 0,5:5:95; нагревали при температуре 100-105С в течение 10 минут. На хроматограммах испытуемых растворов рододендрона золотистого отмечены 4 красно-фиолетовые зоны с Rf около 0,45 (глюкоза); 0,48 (фруктоза); 0,35 (рамноза); 0,53 (арабиноза). С Rf около 0,25(фиолетовая); 0,77 (фиолетовая);0,87 (фиолетовая). Идентифицированные сахара: глюкоза, фруктоза, рамноза и арабиноза присутствуют как в свежем так и в высушенном сырье рододендрона золотистого.
Предлагаемый нами метод для количественной оценки Сахаров в сырье рододендрона предусматривает экстракцию полисахаридного комплекса из сырья водой, его осаждение спиртом этиловым, гидролиз, образование окрашенного комплекса продуктов гидролиза (моносахаридов) с пикриновой кислотой в щелочной среде и последующее измерение оптической плотности. Полученные окрашенные комплексы имеют максимум поглощения при длине волны 466+2 нм, как и комплекс глюкозы с пикриновой кислотой (рис. 3.2.4.1.30 и 3.2.4.1.31). Предложено использовать в качестве аналитической длину волны 466 нм и проводить определение суммы моносахаридов после гидролиза полисахаридов в пересчете на глюкозу.
В ходе разработки методики были подобраны следующие параметры: измельченности сырья, время экстракции, время гидролиза, время образования и устойчивости комплекса. В .результате было установлено, что оптимальным является использование сырья, измельченного до размера частиц проходящих сквозь сито диаметром отверстий 2 мм (для высушенного сырья) или грубоизмельченного (для свежего сырья), при однократной экстракции в течение 60 минут при соотношении сырья/экстрагента 1:100; время гидролиза и время устойчивости комплекса 60 минут.
РСО глюкозы: Около 0,2 г (точная навеска) глюкозы (ФС 42-2419-86), высушенной до постоянной массы, растворяли в мерной колбе вместимостью 250 мл, доводили объем раствора водой очищенной до метки и перемешивали. В 1 мл РСО глюкозы содержалось 0,0008 г глюкозы.
Для приготовления раствора для исследований 2,000 г (точная навеска) сухого или свежего сырья, сухого измельчённого до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм, свежего грубоизмельченного прибавляли 200 мл воды дистиллированной и нагревали с обратным холодильником в течение одного часа. Смесь охлаждали и фильтровали в мерную колбу вместимостью 250 мл и доводили тем же растворителем до метки (исследуемый раствор А). Методика проведения анализа. 10 мл исследуемого раствора помещали в колбу вместимостью 50 мл, прибавляли 10 мл 10% раствора кислоты серной, перемешивали 5 мин и кипятили с обратным холодильником в течении одного часа при температуре 90-95С. Раствор в колбе охлаждали и количественно переносили в стакан вместимостью 50 мл. Колбу промывали 5 мл 30 % раствора натрия гидроксида и 4 раза по 5 мл водой очищенной, присоединяя их к основному раствору, затем нейтрализовали потенциометрически до рН 6,5-7,0 30% раствором натрия гидроксида и 10 % раствором серной кислоты. Раствор количественно переносили в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводили объем раствора до метки водой очищенной, перемешивали и фильтровали через бумажный складчатый фильтр (белая лента), отбрасывая первые 15-20 мл фильтрата (исследуемый раствор Б).
Похожие диссертации на Фармакогностическое изучение и стандартизация лекарственного растительного сырья и настоек гомеопатических матричных рододендрона золотистого
