Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Галоперидол как объект химико-токсикологического исследования при комбинированных отравлениях с психотропными веществами 12
1.1 Общая характеристика галоперидола, хлорпромазина,
левомепромазина, амитриптилина и имипрамина 12
1.1.1 Применение галоперидола, хлорпромазина, левомепромазина, амитриптилина и имипрамина в медицинской практике 13
1.1.2 Фармакодинамика, фармакокинетика и метаболизм галоперидола, хлорпромазина, левомепромазина, амитриптилина и имипрамина 14
1.2 Токсикологическая характеристика галоперидола, хлорпромазина,
левомепромазина, амитриптилина и имипрамина 19
1.2.1 Побочные действия галоперидола, хлорпромазина, левомепромазина, амитриптилина, имипрамина и противопоказания к их применению 19
1.3 Отравления антипсихотическими нейролептиками и трициклическими антидепрессантами 22
1.3.1 Применение галоперидола в медицинской практике в комбинациях с психотропными препаратами 23
1.4 Методы изолирования галоперидола, хлорпромазина,левомепромазина, амитриптилина и имипрамина из биологических объектов 24
1.5 Методы обнаружения и количественного определения галоперидола, хлорпромазина, левомепромазина, амитриптилина и имипрамина 27
1.5.1 Качественный анализ хромогенными и микрокристаллоскопическими реакциями 27
1.5.2 Обнаружение изучаемых лекарственных веществ методом хроматографии в тонком слое сорбента 29
1.5.3 Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии в анализе изучаемых лекарственных веществ 31
1.5.4 Применение газожидкостной хроматографии в анализе изучаемых лекарственных веществ 33
1.5.5 Метод фотоколориметрии в анализе изучаемых лекарственных веществ 35
1.5.6 Метод спектрометрии в анализе изучаемых лекарственных веществ 35 1.6 Заключение по обзору литературы 38
Экспериментальная часть 39
Объекты исследования CLASS Глава 2 Разработка методик обнаружения галоперидола в биологических объектах при комбинированных отравлениях с хлорпромазином, левомепромазином, амитриптилином или имипрамином 43 CLASS
2.1 Химические реакции обнаружения 43
2.1.1 Хромогенные реакции 43
2.1.2 Микрокристаллоскопические реакции 45
2.2 Обнаружение изучаемых лекарственных веществ методом хроматографии в тонком слое сорбента 52
2.3 Обнаружение исследуемых лекарственных веществ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии 63
2.4 Обнаружение изучаемых лекарственных веществ методом газожидкостной хроматографии 68
Выводы по главе 74
Глава 3 Разработка методик количественного определения галоперидола, хлорпромазина, левомепромазина, амитриптилина и имипрамина с помощью метода ВЭЖХ 75
3.1 Определение галоперидола 75
3.2 Определение 4-(4-хлорфенил)-4-гидроксипиперидина 77
3.3 Определение хлорпромазина 78
3.4 Определение левомепромазина 80
3.5 Определение амитриптилина 82
3.6 Определение имипрамина 84
Выводы по главе 86
Глава 4 Разработка методик изолирования галоперидола из биологических объектов в смесях с хлорпромазином, левомепромазином, амитриптилином или имипрамином 87
4.1 Изучение оптимальных условий экстракции галоперидола из водных растворов 88
4.2 Разработка методик изолирования галоперидола из биологических объектов (кровь, желчь, моча) при комбинированных отравлениях с хлорпромазином, левомепромазином, амитриптилином или имипрамином. 96
4.2.1 Изолирование галоперидола, хлорпромазина, левомепромазина, амитриптилина и имипрамина из крови при комбинированных отравлениях 97
4.2.2 Изолирование галоперидола, хлорпромазина, левомепромазина, амитриптилина и имипрамина из желчи при комбинированных отравлениях 103
4.2.3 Изолирование галоперидола, хлорпромазина, левомепромазина, амитриптилина и имипрамина из мочи при комбинированных отравлениях 108
4.3 Схема химико-токсикологического исследования галоперидола в биологических жидкостях при комбинированных отравлениях с хлорпромазином, левомепромазином, амитриптилином или имипрамином 124
Выводы по главе 127
Общие выводы 129
Список литературы
- Применение галоперидола, хлорпромазина, левомепромазина, амитриптилина и имипрамина в медицинской практике
- Методы изолирования галоперидола, хлорпромазина,левомепромазина, амитриптилина и имипрамина из биологических объектов
- Обнаружение изучаемых лекарственных веществ методом хроматографии в тонком слое сорбента
- Разработка методик изолирования галоперидола из биологических объектов (кровь, желчь, моча) при комбинированных отравлениях с хлорпромазином, левомепромазином, амитриптилином или имипрамином.
Введение к работе
Актуальность темы. В медицинской практике довольно широко применяют психотропные лекарственные средства группы нейролептиков. Эти лекарственные препараты составляют «стержень» фармакотерапии^ в современной психиатрии. Несмотря на появление новых нейролептических лекарственных препаратов, использование галоперидола в лечении тяжелых психических расстройств остается наиболее предпочтительным. Галоперидол применяют как в монотерапии, так и в комбинациях с другими психотропными веществами. Наиболее часто галоперидол сочетают с производными фенотиазина, такими как левомепромазин, хлорпромазин и трициклическими антидепрессантами — амитриптилин, имипрамин. Наряду с положительным терапевтическим эффектом, галоперидол как индивидуально, так и в смесях с другими психотропными веществами в определенных условиях (при передозировке, злоупотреблении, повышенной чувствительности организма) оказывает токсическое действие на организм человека, в том числе с летальным исходом.
Отравления нейролептиками антипсихотического действия занимают 3-4 место среди отравлений лекарственными препаратами. Наиболее часто встречаются отравления галоперидолом среди подростков от 13 до 16 лет, которые принимают его для получения наркотического эффекта и отравления у детей младшего возраста.
Длительное применение галоперидола, как и его передозировка, сопровождаются поражением нервной системы по типу экстрапирамидных расстройств с нарушением двигательной активности. В наиболее тяжелых случаях отравлений, развивается так называемый' синдром «внезапной смерти». Крайне тяжелым осложнением является развитие злокачественного нейролептического синдрома, летальность при котором достигает 15-22%. В связи с этим, галоперидол включен в «Перечень наименований токсичных веществ, наиболее часто встречающихся при острых отравлениях» - приказ
6
МЗ РФ №460 от 29 декабря 2000 г. «Об утверждении учетной документации
токсикологического мониторинга». Согласно Международной
статистической классификации болезней и проблем, связанных со здоровьем (МКБ - 10) галоперидолу присвоен код «Т 43 Отравление психотропными средствами...».
Анализ данных литературы свидетельствует о том, что были разработаны ряд методик судебно-химического анализа галоперидола, опубликованы отдельные работы по его химико-токсикологическому анализу. Вместе с тем не проводилось систематических исследований по разработке методик изолирования, обнаружения и количественного определения галоперидола с помощью доступных, современных физико-химических методов анализа. В литературе отсутствуют данные по химико-токсикологическому исследованию галоперидола при комбинированных отравлениях с другими психотропными лекарственными средствами.
Разработка схемы химико-токсикологического анализа галоперидола и сочетаемых совместно с ним производных фенотиазина (хлорпромазин, левомепромазин) и трициклических антидепрессантов (амитриптилин, имипрамин) позволит надежно и оперативно диагностировать отравление и выбрать способ детоксикации.
В связи с этим комплексное исследование по разработке методик химико-токсикологического анализа галоперидола при комбинированных отравлениях является актуальной проблемой.
Цель и задачи исследования: Целью исследования является разработка методик изолирования, идентификации и количественного определения галоперидола в биологических жидкостях с помощью современных физико-химических методов при комбинированных отравлениях с производными фенотиазина (хлорпромазин, левомепромазин) и трициклическими антидепрессантами (амитриптилин, имипрамин).
Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
-осуществить выбор оптимальных условий изолирования галоперидола из
биологических объектов (кровь, моча, желчь); -разработать методики обнаружения галоперидола и его метаболитов при совместном присутствии с производными фенотиазина (хлорпромазин, левомепромазин) и три циклическими антидепрессантами - (амитриптилин, имипрамин) в извлечениях из биологических объектов с помощью современных физико-химических методов; -разработать методики количественного определения галоперидола, его метаболитов, и сочетаемых с ним хлорпромазина, левомепромазина, амитриптилина или имипрамина в извлечениях из биологических объектов; -предложить схему химико-токсикологического анализа галоперидола при комбинированных отравлениях с хлорпромазином, левомепромазином, амитриптилином или имипрамином.
Научная новизна работы. Методом математического планирования
эксперимента «латинский квадрат» изучена зависимость степени экстракции
галоперидола из водных растворов от значения рН среды, природы
і органического растворителя, наличия электролита и продолжительности
экстракции. Установлено, что на процесс изолирования галоперидола методом жидкость-жидкостной экстракции влияет значение рН среды и природа органического растворителя.
Впервые установлена степень экстракции метаболитов галоперидола из водных растворов и предложены условия их изолирования из модельных проб мочи, позволяющие выделить 4-(4-хлорфенил)-4-гидроксипиперидина (ХФГП) до 89% и 3-(4-фторбензоил)-пропионовой кислоты (ФБПК) до 86%. В опытах на экспериментальных животных показано, что метаболит 3-(4-фторбензоил)-пропионовая кислота в моче не обнаруживается:
Найдены оптимальные условия для изолирования галоперидола из биологических жидкостей (кровь, желчь, моча), его идентификации и количественного определения при совместном присутствии с производными фенотиазина (хлорпромазин, левомепромазин) и трициклическими
антидепрессантами (амитриптилин, имипрамин) с помощью химических (хромогенных, и микрокристаллоскопических реакций) и физико-химических методов (ТСХ, ГЖХ, ВЭЖХ). Наибольший выход изучаемых лекарственных веществ достигается при использовании гидролиза их комплексов с эндогенными соединениями биологических объектов (кровь, желчь, моча) в щелочной среде. Изучена зависимость степени экстракции данных лекарственных веществ из- биологических жидкостей от их концентрации в исследуемых объектах.
Установлено, что при использовании в качестве объекта исследования мочи, диагностику отравлений галоперидолом с помощью хроматографических методов, необходимо проводить по его метаболиту - 4-(4-хлорфенил)-4-гидроксипиперидину. При этом анализ мочи методом ГЖХ следует проводить после предварительной дериватизации метаболита.. Используемые условия идентификации с помощью метода ВЭЖХ позволяют провести количественное определение галоперидола, производных фенотиазина (хлорпромазин, левомепромазин) и трициклических антидепрессантов (амитриптилин, имипрамин) в извлечениях из биологических жидкостей как каждого индивидуально, так и при их' совместном присутствии.
Практическая значимость работы и внедрение результатов исследования.
Разработаны методики химико-токсикологического анализа
галоперидола при комбинированных отравлениях с производными фенотиазина- и трициклическими антидепрессантами, которые в отличие от ранее опубликованных позволяют надежно диагностировать факт их совместного применения. Обосновано применение этих методик в практике химико-токсикологических лабораторий, что позволит сократить время. диагностирования отравления исследуемыми лекарственными препаратами, оценить степень отравления с целью оказания эффективной медицинской помощи пострадавшему.
На основании разработанных методик предложена схема химико-токсикологического анализа исследуемых лекарственных веществ, вошедшая в основу новой медицинской технологии для практических работников химико-токсикологических лабораторий.
Материалы внедрения. Разработанные методики изолирования, идентификации и количественного определения галоперидола, его метаболита - 4-(4-хлорфенил)-4-гидроксипиперидина, хлорпромазина, левомепромазина, амитриптилина или имипрамина в биологических объектах при комбинированных отравлениях апробированы в химико-токсикологической лаборатории наркологического диспансера, г. Ростова-на-Дону и в судебно-химическом отделении Бюро судебно-медицинской экспертизы Краснодарского края, г. Краснодара. Разработана новая медицинская технология «Химико-токсикологическое исследование галоперидола в биологических жидкостях при комбинированных отравлениях с левомепромазином, хлорпромазином, амитриптилином или имипрамином», проект которой направлен к рассмотрению в Российский центр судебно-медицинской экспертизы г. Москва.
Связь задач с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена по плану научно-исследовательских работ Пятигорской государственной фармацевтической академии (номер государственной регистрации №01200206156).
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 147 страницах машинописного текста, содержит 29 рисунков и 29 таблиц, состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (3 главы), общих выводов, списка литературы, включающего 162 источников, из которых 44 иностранных и приложения.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на 61-й и 62-й конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» г. Пятигорск.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них три в ведущих научных журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией.
Основные положения, выносимые на защиту.
Результаты оптимизации условий изолирования галоперидола из биологических объектов (кровь, желчь, моча) с использованием метода математического планирования эксперимента «латинский квадрат».
Результаты применения разработанных методик для идентификации и количественного определения галоперидола в извлечениях из биологических объектов при комбинированных отравлениях с хлорпромазином, левомепромазином, амитриптилином или имипрамином с помощью методов ТСХ, ГЖХ и ВЭЖХ.
Схемы химико-токсикологического и судебно-химического исследования галоперидола в биологических объектах при комбинированных отравлениях с хлорпромазином, левомепромазином, амитриптилином или имипрамином.
Применение галоперидола, хлорпромазина, левомепромазина, амитриптилина и имипрамина в медицинской практике
Основной механизм действия антипсихотических нейролептиков, заключается в формировании блокады дофаминергических систем в мезолимбической области, на уровне базальных ганглиев и гипоталамуса [48]. Седативный эффект галоперидола выражен слабо с преобладанием умеренной стимуляции, особенно при использовании малых доз препарата. Фенотиазиновые производные (хлорпромазин, левомепромазин) относятся к группе «седативных нейролептиков», поэтому данный эффект у них сильно выражен.
Антипсихотические нейролептики потенцируют действие барбитуратов и наркотических анальгетиков. Главной причиной указанного взаимодействия служит запуск нейролептиками функции гипногенных структур головного мозга и, прежде всего хвостатого ядра. За счет своего ограниченного влияния на ретикулярные структуры, а также в результате моторной инактивации данное взаимодействие увеличивает готовность ко сну, облегчает засыпание. Антипсихотические нейролептики, подавляя дофаминергическую передачу, способствуют мобилизации пептидергических механизмов мозга. За счет этого может обеспечиваться собственно анальгетическое действие и способность потенцировать эффект обезболивающих лекарственных препаратов [27, 48].
Галоперидол принимают перорально (раствор 0,2% по 10 мл, таблетки по 1,5 и 5 мг) и парентерально (0,5% раствор по 1 мл). Начальная доза для взрослых - 0,5-5 мг 2-3 раза в сутки. При необходимости дозу постепенно увеличивают до достижения желаемого терапевтического эффекта (в среднем-до 10-15 мг, при хронических формах шизофрении-до 20-60 мг). Максимальная суточная доза-200 мг [60, 89, 144].
Хлорпромазин, левомепромазин принимают внутрь, внутримышечно, внутривенно, начальная1 суточная доза 25-100 мг. Затем дозу постепенно повышают на 25-50 мг каждые 3-4 дня, до достижения желаемого эффекта. В случае малоэффективности дозу увеличивают до 700-1000 мг в сутки, в некоторых крайних случаях дозу можно повысить до 1200-1500 мг в сутки. Максимальная суточная доза 1,5 г [60, 89, 144].
Трициклические антидепрессанты структурно сходны с фенотиазинами. В основе их действия лежит блокада обратного захвата норадреналина, серотонина и частично дофамина. Трициклические антидепрессанты блокируют центральные М-холинореактивные системы, вызывая центральный и периферический «антихолинергический синдром». Существенной особенностью препаратов этого класса является альфа-адренолитическое действие, клинически сопровождающееся ортостатической гипотензией. Так же препараты данной группы оказывают антигистаминное действие, которое усиливает седацию и понижает «судорожный порог», что способствует возникновению судорог [48].
Трициклические антидепрессанты (амитриптилин, имипрамин) принимают внутрь, внутримышечно или внутривенно. Начальная доза 25-50 мг, затем дозу постепенно увеличивают до 150-200 мг в сутки. Максимальная суточная доза 300 мг [60, 89, 144]. При приеме внутрь абсорбция галоперидола составляет 70%, максимальная концентрация галоперидола в крови при пероральном приеме достигает через три часа, при внутримышечном введении - 10-20 минут. Период полувыведения галоперидола при пероральном приеме - 24 часа (от 12 до 37 часов), при внутримышечном введении — 14 часов (от 10 до 19 часов). После внутримышечного введения пролонгированной лекарственной формы (галоперидола деканоата) абсорбция медленная и постоянная (за счет либерации из депо). Концентрация в плазме постепенно растет, достигая максимальной концентрации через 3-9 дней после инъекции (у пожилых пациентов — 1 день), и затем снижается. Период полувыведения пролонгированной лекарственной формы галоперидола — 3 недели. В крови на 92% связывается с белками плазмы. Легко проходит через гистогематические барьеры, включая гематоэнцефалический.
Биодоступность галоперидола составляет около 65%, проникает в грудное молоко [60, 89, 108]. Лучший терапевтический эффект у больных шизофренией достигается при накоплении галоперидола в крови только в определенной концентрации - (8-17 нг/мл). Оптимальное содержание галоперидола в плазме крови удается получить чаще всего спустя 18 дней от начала лечения при использовании средних доз препарата [89]. Галоперидол метаболизирует с образованием неактивных метаболитов: 4-(4-хлорфенил)-4-гидроксипиперидина, 3-(4-фторбензоил)-пропионовой кислоты, и ее коньюгата с глицином. Кроме того, галоперидол восстанавливается по кетогруппе до первичного спирта [128, 131, 144].
Методы изолирования галоперидола, хлорпромазина,левомепромазина, амитриптилина и имипрамина из биологических объектов
В химико-токсикологическом анализе для идентификации используются качественные реакции, основанные на взаимодействии реактива с лекарственным веществом с получением специфической окраски или осадка. Однако окраска является достаточно субъективным мнением конкретного эксперта, либо бывает трудно описать цвет полученного продукта реакции.
Окончательное решение о результатах пробы должно быть сделано после сравнения полученных результатов с результатами исследования известного вещества.
В работе О.Д. Туркевич описаны хромогенные реакции на галоперидол с реактивом Фреде и с раствором м-динитробензола [104].
В работе Е.М: Саломатина предложено обнаружение хлорпромазина и имипрамина с помощью осадительных, микрокристаллоскопических реакций и реакций окрашивания. Хлорпромазин и имипрамин образуют характерные окрашивания с реактивами: Эрдмана, Фреде, Марки, Манделина, с 5% раствором золота хлорида, 2% раствором, железа (III) хлорида, с фосфорномолибденовой кислотой, с концентрированными кислотами: серной, азотной, уксусной, при проведении реакции Витали-Морена (температура нитрования 120-140С) [111]. Предложены хромогенные реакции на имипрамин, амитриптилин [8].
Микрокристаллоскопические реакции достаточно широко используются в химико-токсикологическом анализе. Для проведения данного метода анализа требуются малые количества исследуемых веществ. При обнаружении химических соединений с помощью микрокристаллоскопического метода в большинстве случаев исключаются такие громоздкие операции, как фильтрование, выпаривание, прокаливание и т.д.
Микрокристаллоскопический анализ основан- на обнаружении! веществ по форме, величине и окраске их. кристаллов. В большинстве случаев, для идентификации, химических соединений с помощью микрокристаллоскопического метода определяют форму и окраску не самих веществ, а кристаллических продуктов, которые образуются при взаимодействии исследуемых веществ с соответствующими реактивами. Недостатками данного метода является ограниченное число форм кристаллов, образующихся при микрокристаллоскопических реакциях, и большое число веществ, которые определяют с помощью этих реакций. Это обстоятельство является причиной понижения специфичности микрокристаллоскопических реакций. Выполнение контрольных опытов до некоторой степени исключает возможность ошибки при оценке результатов микрокристаллоскопических реакций.
В литературе отсутствуют данные по возможности идентификации галоперидола с помощью микрокристаллоскопического метода. Описана микрокристаллоскопическая реакции на хлорпромазин с 5% раствором железа (III) хлорида [111]. Амитриптилин и имипрамин, с раствором индигокармина образуют характерные кристаллы [109].
Метод тонкослойной хроматографии занимает важное место благодаря своей экспрессности, воспроизводимости, простоте и низкой стоимости. Тонкослойная хроматография является наиболее распространенным методом анализа для многих лекарственных веществ, имеющих токсикологическое значение на этапе скрининга [26, 36].
Для обнаружения галоперидола методом ТСХ применялись стеклянные пластины с нанесенным на них тонким слоем силикагеля КСК, закрепленным гипсом в системе растворителей: этилацетат - бензол - диэтиламин (100:10:1), а для его проявления на хроматограммах применялся реактив Дрегендорфа, модифицированный по Мунье [104]. Также имеются данные по анализу дроперидола методом хроматографии в тонких слоях силикагеля КСК и на пластинах «силуфол» с использованием систем растворителей: ацетон - хлороформ (7:3) и бензол - метанол (4:1), для проявления также
зо использовался вышеуказанный реагент [57]. В работе А.Ф. Фартушного с соавторами предложен метод хроматографии дроперидола в тонком слое сорбента на пластинах «силуфол» в системах растворителей: толуол - ацетон — 96% этанол-раствор аммиака концентрированный (45:45:7:3), хлороформ -метанол-раствор аммиака концентрированный (32:7:1), этилацетат - толуол -диэтиламин (30:20:5). Проявляли реактивом Драгендорфа в модификации по Мунье [38]. Разработана методика идентификации галоперидола и его метаболита - 3-(4-фторбензоил)-пропионовой кислоты извлеченных из мочи с использованием хроматографических пластин «SILUFOL UF» [128].
Обнаружение изучаемых лекарственных веществ методом хроматографии в тонком слое сорбента
Несмотря на внедрение в практику химико-токсикологического анализа современных физико-химических методов, обладающих высокой чувствительностью, избирательностью, хроматография в тонком слое сорбента не утратила своего значения благодаря доступности, дешевизне, не сложному аппаратурному оснащению, простоте выполнения и подготовки к анализу.
Тонкослойная хроматография является наиболее распространенным методом анализа лекарственных, наркотических веществ и их метаболитов в биологических объектах и на этапе скрининга служит преобладающим источником информации [18, 29, 34, 51, 152].
Метод ТСХ получил наиболее широкое распространение благодаря своей доступности и простоте выполнения анализа, и в то же время высокой эффективности, чувствительности, экспрессности и экономичности. Данный метод применяется в общем и частном скрининге. На основе хроматографии в тонком слое сорбента разработаны методики для многих лекарственных и наркотических веществ имеющих токсикологическое значение. В тонкослойной хроматографии роль неподвижной фазы выполняет фиксированный тонкий слой сорбента (силикагель, оксид алюминия и др.), нанесенный на пластину из стекла, фольги, полимера. Роль подвижной фазы выполняет индивидуальный растворитель или их смесь (хроматографическая система).
Для выбора-условий разделения исследуемых веществ, методом ТСХ использовали- пластины на основе силикагеля «Сорбфил» ИТСХ-П-А-УФ, которые имеют высокую степень активности и перемещения подвижной фазы, строго стандартизированную толщину сорбента и размер зерен.
Детекцию пятен проводили путем просмотра пластин в УФ-свете при длине волны 254 нм, парами йода и с помощью опрыскивания реактивом Драгендорфа с предварительным опрыскиванием пластины 10% раствором кислоты серной и без неё.
В процессе хранения происходит загрязнение хроматографических пластин - это связано с тем, что адсорбенты пластин сорбируют не только влагу, но и другие вещества, содержащиеся в воздухе, что ведет к искажению результатов анализа, появлению фронта «грязи», изменению состава подвижной фазы за счет воды содержащейся на сорбенте. Поэтому перед использованием хроматографических пластин, проводили их предварительную подготовку путем разгонки спиртом этиловым на всю высоту пластины, с последующей сушкой в сушильном шкафу при температуре 110-120С в течение 1 часа.
На линию старта хроматографической пластины с помощью микрошприца для тонкослойной хроматографии наносили по 1 мкл 1% растворов исследуемых веществ (галоперидол, дроперидол, ХФГП, хлорпромазин, левомепромазин, амитриптилин, имипрамин), что соответствует количеству 10 мкг. После удаления органического растворителя пластины хроматографировали в исследуемых системах растворителей.
Основная величина хроматографического измерения вещества в тонкослойной хроматографии - это величина Rf (rate fraction), определяемая по следующей формуле: Эта величина изменяется от 0 до 1. Однако чаще пользуются величинами RfxlOO, чтобы исключить пользование дробями и обозначаются как hRf [24].
Предварительно нами была определена хроматографическая подвижность исследуемых веществ в общих системах растворителей, наиболее часто применяемых для веществ основного характера в химико-токсикологическом анализе [109].
Проведенные исследования показали, что величина hRf галоперидола от исследуемых других веществ на пластинах «Сорбфил» наиболее отличается при использовании системы № V. В системе № I наблюдается, размытие зон адсорбции, а также наличие «хвостов». В системе № VI все вещества остались на линии старта. Общая система № VII является наиболее подходящей для-разделения исследуемых лекарственных веществ, и может быть рекомендована в скрининге при проведении ненаправленного анализа. Для селективности данной хроматографической системы проводили хроматографирование извлечений из биологических жидкостей (кровь, желчь, моча), в результате исследования значение hRf соэкстрактивных веществ совпадает со значением hRf галоперидола, что приводит к невозможности использования, данной системы, для идентификации галоперидола в крови и моче. В остальных исследуемых общих системах, разделение психотропных веществ идет недостаточно четко, в результате чего необходима разработка частных систем хроматографирования, позволяющая- достаточно четко разделить галоперидол от его метаболита -ХФГП и изучаемых лекарственных веществ.
Поиск оптимальных условий идентификации исследуемых веществ проводили путем изучения их хроматографической подвижности в растворителях с различной полярностью. В качестве критерия полярности использовали величину диэлектрической проницаемости (є).
На линию старта хроматографической пластины наносили 1 мкл 1% растворов- исследуемых веществ в хлороформе (10 мкг).
Хроматографирование осуществляли в стеклянных камерах с предварительным насыщением парами растворителей в течение 30 минут. Хроматографирование в каждой системе растворителей проводили в шести повторностях-. с последующей1 статистической обработкой полученных результатов.
Разработка методик изолирования галоперидола из биологических объектов (кровь, желчь, моча) при комбинированных отравлениях с хлорпромазином, левомепромазином, амитриптилином или имипрамином.
Метод газожидкостной хроматографии довольно широко используется в судебно-химических и химико-токсикологических лабораториях для идентификации- и количественного определения летучих соединений, пестицидов и лекарственных веществ при отравлениях [6, 34, 47, 75, 90]:
Газожидкостная хроматография - вид хроматографии, в котором подвижная фаза находится- в состоянии газа или пара (газ-носитель). Неподвижной фазой является высокомолекулярная жидкость, закрепленная-на пористый носитель колонки или на стенки длинной капиллярной трубки. Предложенная Голлеем в 1957 г. капиллярная высокоэффективная газовая хроматография, в которой в качестве колонки используется капилляр длиной в несколько десятков метров, открыла новые возможности в анализе. Разрешающая способность подобных колонок в 10-1000 раз выше, чем у обычных насадочных колонок.
Исследования методом ГЖХ были выполнены на аппаратно-программном комплексе на базе хроматографа «Кристалл 2000М». Хроматограф- снабжен сменным аналитическим модулем с пламенно-ионизационным- (ПИД), электронозахватным- (ЭЗД) и термоионным (ТИД) детекторами. Предусмотрено автоматическое регулирование температур термостатов;, расходов газа-носителя и вспомогательных газов, автоматический поджиг детекторов и контроль горения пламени в процессе работы. Разделение исследуемых веществ проводили на высокоэффективной капиллярной колонке фирмы Хьюлетт Паккард (НР-5) длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мм с неполярной неподвижной жидкой фазой (5% дифенил и 95% диметилполисилоксан). В качестве подвижной фазы выступал азот. ПИД - наиболее широко используемый детектор в газовой хроматографии. Он реагирует почти на все соединения, содержащие СН-группы, но не реагирует на газы, азот, аммиак и воду [12, 13, 67], поэтому для- обнаружения исследуемых веществ использовали пламенно-ионизационный детектор, как наиболее чувствительный к данной" группе веществ. Хроматографирование проводили с использованием современной программы «Хроматэк Аналитик» в версии 2.5, которая позволяет в соответствии с заданной программой обеспечивать, выполнение всех циклов хроматографирования.
Для проведения исследования готовили растворы изучаемых веществ с концентрацией 500 мкг/мл в 95% спирте.
Нами было изучено влияние температурных параметров на поведение исследуемых веществ в процессе хроматографирования. Установлено, что наиболее существенными факторами, способствующими термическим превращениям левомепромазина, являются высокие температуры в испарителе и в колонке хроматографа. Из литературных источников известно, что левомепромазин имеет температуру плавления 187С с последующей деструкцией [144], остальные исследуемые вещества устойчивы к действию высоких температур. Галоперидол детектируется при температуре колонки более 250С, что очевидно связано с его высоким сродством-к неподвижной жидкой фазе. В связи с этим нами-предложены условия хроматографирования исследуемых веществ в режиме ступенчатого1 программирования температуры колонки. Наибольшая! эффективность, колонки- при оптимальной чувствительности- определения.была- получена.при-следующих условиях: температурные параметры: детектор- ПИД-300С, испаритель-250С, колонка- 180С-10 минут, подъем: до 290С со скоростью 20С в минуту, выдержка при 29СГС-10 минут. Общее время хроматографирования-25 минут. расходы газов (мл/мин): азот-7,5; водород-20; воздух-200. Коэффициент деления потока газа-носителя 1:4,5; объемная скорость потока азота, проходящего через колонку, с учетом коэффициента деления составила 1,5 мл/мин.
Идентификацию исследуемых веществ осуществляли по временам удерживания [25, 67].
Специфичность методики подтверждали набором хроматограмм: растворов РСО исследуемых веществ, растворителя и извлечения из крови и желчи, не содержащих изучаемые вещества, извлечений из крови, желчи и мочи, содержащих смесь галоперидола и одного из изучаемых веществ. Хроматограммы растворов извлечений из модельных смесей крови, желчи и мочи с исследуемыми веществами представлены в приложении Б.
