Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Абстинентный синдром 11
1.1.1. Абстинентный синдром при опийной наркомании и принципы его купирования 11
1.2. Общая характеристика обезболивающих препаратов, применяющихся в период абстиненции 14
1.2.1. Характеристика наркотических анальгетиков, механизм их действия 14
1.2.2. Характеристика ненаркотических (неопиоидных) анальгетиков и нестероидных противовоспалительных средств, механизм действия НПВС 18
1.3. Общая характеристика снотворных средств 21
1.4. Буторфанол 24
1.4.1. Применение буторфанола в медицинской практике, механизм действия и побочные эффекты 24
1.4.2. Аналитические методы исследования буторфанола 27
1.5.Диклофенак 28
1.5.1. Применение диклофенака в медицинской практике, фармакокинетика, побочные действия 28
1.5.2. Аналитические методы исследования диклофенака 31
1.6.Кеторолак 32
1.6.1. Применение кеторолака в медицинской практике, метаболизм, побочные действия 32
1.6.2. Аналитические методы исследования кеторолака 34
1.7.Доксиламин 35
1.7.1. Применение доксиламина в медицинской практике, метаболизм, побочные действия 35
1.7.2. Аналитические методы исследования доксиламина 37
1.8. Современные аналитические технологии и перспективы их применения в химико- токсикологическом анализе 38
Экспериментальная часть.
ГЛАВА 2. Методы и объекты исследования 51
2.1. Объекты исследования 51
2.2. Методы исследования, приборы и реактивы 52
ГЛАВА 3. Разработка хроматографических методов анализа буторфанола, кеторолака, диклофенака и доксиламина 54
3.1. Разработка условий ТСХ-анализа буторфанола, диклофенака, кеторолака и доксиламина. Количественное определение исследуемых веществ методом хроматоденситометрии 54
3.2. Определение буторфанола, диклофенака, кеторолака и доксиламина методом газовой хроматографии 63
3.3. Разработка условий анализа буторфанола, кеторолака, диклофенака и доксиламина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии 69
3.3.1. Выбор сорбента и условий детектирования 69
3.3.2. Выбор подвижной фазы 70
3.3.3. Качественное и количественное определение исследуемых веществ методом ВЭЖХ 75
ГЛАВА 4. Разработка спектральных методик определения буторфанола, кеторолака, диклофенака и доксиламина 79
4.1. Изучение возможности применения ИК-спектроскопии для идентификации исследуемых веществ 79
4.2. Разработка методик обнаружения и количественного определения буторфанола, диклофенака, кеторолака и доксиламина методом УФ-спектрометрии 83
ГЛАВА 5. Определение буторфанола, кеторолака, диклофенака и доксиламина в биологических объектах 87
5.1. Изолирование буторфанола, диклофенака, кеторолака и доксиламина из
биологических жидкостей (кровь, моча) 88
5.1.1. Выбор условий экстракции буторфанола, кеторолака, диклофенака и доксиламина из водных растворов 88
5.1.2. Экстракция буторфанола, кеторолака, диклофенака и доксиламина из мочи 91
5.1.3. Экстракция буторфанола, кеторолака, диклофенака и доксиламина из крови 96
5.2. Определение буторфанола, кеторолака, диклофенака и доксиламина в биологических жидкостях экспериментальных животных 100
5.3. Определение буторфанола, кеторолака, диклофенака и доксиламина в моче при совместном присутствии с другими наркотическими средствами 106
5.4. Сохраняемость буторфанола, кеторолака, диклофенака и доксиламина в крови и моче экспериментальных животных 108
Выводы 111
Список литературы
- Абстинентный синдром при опийной наркомании и принципы его купирования
- Характеристика ненаркотических (неопиоидных) анальгетиков и нестероидных противовоспалительных средств, механизм действия НПВС
- Определение буторфанола, диклофенака, кеторолака и доксиламина методом газовой хроматографии
- Разработка методик обнаружения и количественного определения буторфанола, диклофенака, кеторолака и доксиламина методом УФ-спектрометрии
Введение к работе
Актуальность проблемы. Масштаб злоупотребления наркотическими средствами, а также соединениями, обладающими подобным действием на организм, в Российской Федерации год от года неуклонно расширяется. Эта проблема становится одной из важнейших социальных проблем [27,78]. За последнее десятилетие число только официально зарегистрированных наркозависимых людей в России возросло в 10 раз [18,39]. По данным органов здравоохранения в России на 1 января 2006 года на учете Наркологических диспансеров состояло более 765 тысяч лиц, злоупотребляющих наркотическими средствами, из них 689,5 тысяч - с диагнозом «наркомания». По экспертным оценкам реальное количество потребителей наркотиков превышает данные показатели в 5-10 раз [11]. Постоянное увеличение потребления психотропных препаратов отмечается в первую очередь в подростковой и молодежной среде, о чем свидетельствует тот факт, что по сравнению с 2005 годом количество подростков, больных наркоманией, в 2006 году увеличилось на 27,5%. Особую тревогу вызывает снижение среднего возраста людей, употребляющих наркотические средства и психотропные вещества. В 2005 году поставлен диагноз наркомания свыше 9 тыс. детей в возрасте до 14 лет [34,82]. По данным отделений интенсивной терапии острых отравлений частота отравлений психотропными препаратами составляет 75-85% от общего числа поступающих больных. Следует обратить внимание на тот факт, что средний возраст пациентов, доставляемых в отделения острых отравлений в связи с острой интоксикацией наркотическими средствами, не превышает 27 лет [4]. Подавляющее большинство наркоманов (67,3%) составляют лица в возрасте до 30 лет [82].
Токсикологическую ситуацию в стране усугубляет целый ряд факторов. Во-первых, распространение психотропных веществ, изготовляемых кустарным способом, зачастую затрудняет проведение клинической и лабораторной диагностики. Токсическое действие кустарных наркотических средств усиливается вследствие загрязнения их в процессе
изготовления растворителями, добавками, используемыми с целью усиления токсического эффекта или с целью обмана «покупателя» (тальк, мел, крахмал, сода, сахарная пудра, хингамин, сульфат, силикат магния) [20,22]. В таких случаях клиническая картина обусловлена не только действием самих наркотических анальгетиков, но и «эффектом второго соединения». Во-вторых, в токсикологической практике часто встречаются отравления накротическими средствами в комбинации с психотропными препаратами. При этом на фоне клиники отравления опиоидами чаще всего обнаруживаются проявления, связанные с приемом бензодиазепинов, атропина, димедрола, амфетаминов. Особенно тяжело протекают отравления смесями наркотических средств, например, комбинацией героин/кокаин («спид-болл»). Подобная ситуация наблюдается и в других странах. Так, по данным центрального департамента и центра токсикологического контроля г. Нью-Йорка за период 2004-2005 гг. зарегистрировано 465 случаев передозировки «уличными наркотиками»; в клинической картине отравления героином преобладали клинические эффекты скополамина, антихолинергических веществ [3,39].
Особую озабоченность в последнее время вызывает злоупотребление
лекарственными препаратами, обладающими обезболивающим эффектом, а
также снотворным и седативным действием, в среде лиц, страдающих
наркозависимостью. Такие препараты используются в клинической практике
в качестве заменителей наркотических средств в период абстиненции. К их
числу следует отнести буторфанол, доксиламин, кеторолак, имован,
феназепам, терпинкод, амитриптилин, пипольфен, диклофенак. В связи с
расширением контингента, злоупотребляющего наркотическими
средствами, постоянно ведутся поиски новых веществ по анальгетической активности не уступающих, а по безопасности значительно превышающих современные препараты. Круг этих лекарственных препаратов постоянно расширяется. Все большая доступность этих веществ способствует распространению наркомании. В результате проведенных сотрудниками кафедры ОиУФ СПХФА исследований установлено, что спрос из аптечных
организаций на данные препараты возрос [25,63]. Это в свою очередь (по данным бюро судебно-медицинской экспертизы (БСМЭ)) привело к увеличению числа острых отравлений ими, в том числе и со смертельным исходом. При одновременном применении буторфанола, кеторолака, диклофенака и доксиламина с опийными алкалоидами, производными барбитуровой кислоты, производными 1,4-бензодиазепина, нейролептиками, транквилизаторами отмечается усиление угнетающего влияния на центральную нервную систему, что также приводит к летальному исходу. По данным БСМЭ г. Санкт-Петербурга и Ленинградской области, а также Центра по лечению острых отравлений СПб НИИ Скорой помощи им. И.И. Джанелидзе, следует отметить: число отравлений доксиламином составило в 2006 году 46, кеторолаком - 7, имованом - 10, диклофенаком - 12, буторфанолом - 2, препаратом терпинкод - 18, амитриптилином - 280, производными 1,4-бенздиазепина, в том числе феназепамом - 1066.
Анализ литературных данных показал, что данные химико-токсикологического анализа буторфанола, диклофенака, кеторолака и доксиламина противоречивы, нет систематических исследований по разработке методик изолирования, обнаружения и количественного определения. В связи с отсутствием методик химико-токсикологического анализа биологических объектов на присутствие буторфанола, кеторолака, диклофенака, доксиламина судебно-химические отделения БСМЭ и химико-токсикологические лаборатории наркодиспансеров испытывают значительные затруднения для доказательства отравления или исключения использования этих лекарственных препаратов в немедицинских целях, в том числе при приеме совместно с наркотическими средствами, психотропными и другими токсическими веществами.
Целью работы является разработка методик химико-токсикологического анализа буторфанола, кеторолака, диклофенака, доксиламина в вещественных доказательствах и биологических жидкостях при судебно-химическом и химико-токсикологическом исследовании, и внедрение их в практику судебно-химических отделений БСМЭ и химико-
токсикологических лабораторий наркологических диспансеров России.
Задачи, которые необходимо было решить для достижения поставленной цели:
- изучить особенности выделения (изолирования) исследуемых веществ
из водных растворов разными органическими растворителями и их смесями,
выявить закономерности процесса изолирования и влияния на него разных
факторов, определить универсальный изолирующий агент.
- разработать методики изолирования исследуемых веществ из
биологических жидкостей (кровь, моча).
- определить возможность использования спектральных методов при
судебно-химическом исследовании изучаемых веществ.
разработать методики качественного определения доксиламина, буторфанола, кеторолака и диклофенака методами хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ), газожидкостной (ГЖХ), высокоэффективной (ВЭЖХ), газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ/МС), УФ, ИК-спектроскопии, хроматоденситометрии, цветных и осадочных реакций.
предложить методы количественного определения исследуемых веществ, выделенных из биологических жидкостей. Сравнить сопоставимость и воспроизводимость этих методов.
определить сроки сохраняемости доксиламина, буторфанола, кеторолака и диклофенака в гнилостно разлагающихся биологических жидкостях.
- разработать общую схему химико-токсикологического анализа при
отравлениях изучаемыми веществами.
Научная новизна: Впервые выявлены особенности изолирования изучаемых веществ из водных растворов и биологических жидкостей разными органическими растворителями и их смесями. Установлено, что на процесс изолирования из биологических жидкостей методом жидкость-жидкостной экстракции влияет структура анализируемого соединения, его рКа, связь с биологической матрицей, рН среды и высаливающий реагент, растворитель или смесь растворителей.
На основе методов УФ, ИК-спектроскопии, ТСХ, ВЭЖХ, ГХ/МС
разработаны оригинальные методики обнаружения доксиламина,
буторфанола, кеторолака и диклофенака при совместном присутствии с наркотическими и психотропными веществами, их качественного и количественного определения с использованием оборудования, рекомендованного МЗ СР РФ для оснащения химико-токсикологических лабораторий и Центров по лечению острых отравлений.
Установлено, что ИК-спектроскопия не может быть использована для
изучаемых веществ, выделенных из биологических жидкостей, а только для
"вещественных доказательств". Метод УФ-спектрометрии не позволяет
идентифицировать диклофенак и буторфанол при совместном присутствии с
наркотическими анальгетиками, но может быть использован при их
совместном присутствии с нестероидными противовоспалительными
средствами. Для доксиламина и кеторолака этот метод может быть
использован. При проведении анализа методом ВЭЖХ следует использовать
градиентный режим, при ГХ/ЭЗД исследовании следует проводить
дериватизацию буторфанола. При исследовании методом ГХ/МС определены
характеристичные ионы исследуемых веществ. Установлено, что для ГХ/МС
определения буторфанола необходимо синтезировать его
пентафторпропионильные и триметисилильные производные.
Впервые определены необходимые объем и полнота судебно-химического исследования, позволяющие достоверно установить факт отравления изученными препаратами при летальном исходе и при приеме их в немедицинских целях.
Практическая значимость. Разработаны оригинальные экономичные методики изолирования, обнаружения и количественного определения буторфанола, кеторолака, диклофенака и доксиламина в биологических жидкостях (кровь, моча). Использование цветных и осадочных реакций (на предварительном этапе), разных видов хроматографиии, УФ, ИК-спектроскопии, ГХ/МС позволяет достоверно установить факт отравления изученными препаратами. Доказано и обосновано применение этих методик
в практике химико-токсикологических лабораторий, что позволяет сократить время диагностирования отравления изученными препаратами, дать оценку степени отравления для оказания своевременной медицинской помощи пострадавшему. Разработанные методики апробированы, утверждены и внедрены в практику работы судебно-химических отделений БСМЭ Ленинградской, Новгородской, Рязанской областей, г. Санкт-Петербурга, химико-токсикологических лабораторий Центра по лечению острых отравлений СПб НИИ Скорой помощи им. И.И. Джанелидзе и ГУЗ МНД № 1; в учебный процесс Региональных центров аналитической диагностики наличия наркотических средств, психотропных и других токсических веществ, Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической и Пермской государственной фармацевтической академий (Акты о внедрении).
Апробация работы. Основные материалы работы доложены на международной научно-практической конференции «Выпускник фармацевтического ВУЗа (факультета) в прошлом, настоящем и будущем», посвященной 85-летию Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической ' академии (Санкт-Петербург, 2004), юбилейной конференции «Подготовка кадров для фармацевтической промышленности», посвященной 60-летию факультета промышленной технологии лекарств (Санкт-Петербург, 2005), научных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2006, 2007), региональной научной конференции студентов и аспирантов («Молодые ученые - практическому здравоохранению», (Санкт-Петербург, 2007).
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 129 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (4-х глав), выводов, списка литературы, включающего 152 наименования (69 источников зарубежной литературы), приложения, содержит 29 таблиц и 20 рисунков.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ.
Абстинентный синдром при опийной наркомании и принципы его купирования
Анальгезирующими средствами, или анальгетиками (от греч. algos -боль и an - без), называют лекарственные средства, обладающие специфической способностью ослаблять или устранять чувство боли, т.е. средства, доминирующим эффектом которых является анальгезия, наступающая в результате резорбтивного действия и не сопровождающаяся в терапевтических дозах выключением сознания и выраженным нарушением двигательных функций.
По химической природе, характеру и механизмам фармакологической активности современные анальгетики делят на две основные группы: наркотические (опиоидные) и ненаркотические (неопиоидные) анальгетики [7,29,100].
Наркотические анальгетики характеризуются следующими основными свойствами: - сильная анальгезирующая активность, обеспечивающая возможность их использования в качестве высокоэффективных болеутоляющих средств в различных областях медицины; - особое влияние на ЦНС человека, которое проявляется эйфорией и появлением физической и психической зависимости при повторном применении препарата; - появление синдрома абстиненции у лиц с развившийся зависимостью при лишении их анальгетического препарата; - снятие вызываемых воздействий на ЦНС, нарушений сердечной деятельности, а также анальгезии специфическими антагонистами [7,79].
Механизм действия наркотических (опиоидных) анальгетиков с точки зрения нейрофизиологии связан с угнетением таламических центров болевой чувствительности и блокированием передачи болевых импульсов к коре.
В нейрохимическом аспекте механизм действия наркотических анальгетиков связан , с действием энкефалиновых пресинаптических тормозных рецепторов, являющихся частью антиноцицептивной системы. В качестве медиаторов передачи импульса в этих рецепторах выступают олигопептиды: эндорфины и энкефалины, а также другие пептиды (динорфины и др.). Связываясь с опиатными рецепторами, эндорфины и энкефалины оказывают анальгетическое действие [28].
В настоящее время общепринята следующая точка зрения: наркотические анальгетики взаимодействуют со специализированными участками клеточной мембраны - опиатными рецепторами [95]. Связывание наркотических анальгетиков с опиатными рецепторами обусловлено тем, что определенная часть молекулы всех наркотических анальгетиков имеет структурное и конформационное сходство с частью молекул (тирозиновым остатком) энкефалинов и эндорфинов.
В зависимости от взаимодействия с опиатными рецепторами опиаты делят на четыре группы: полные агонисты, частичные агонисты, агонист-антагонисты, полные антагонисты [97].
Полные и частичные агонисты взаимодействуют с ц.-рецепторами, в результате чего достигается анальгетический эффект. Для полных агонистов характерен дозозависимый эффект, который заключается в возрастании степени анальгезии при увеличении количества лекарственного средства (в пределах терапевтических доз) [79,86,97]. Частичные агонисты также взаимодействуют с .-опиатными рецепторами, но при их использовании дозозависимого эффекта не наблюдается. Анальгезия возрастает до определенной степени, при дальнейшем увеличении дозы препарата степень анальгезии не меняется.
Агонист-антагонисты являются антагонистами [i-опиатных рецепторов. Поэтому они способны вызвать синдром абстиненции или купировать явления передозировки при введении пациенту, принимающему полные агонисты. Анальгезия при применении агонист-антагонистов достигается в результате взаимодействия их с к- и а-опиатными рецепторами [4,92].
Полными антагонистами по отношению ко всем типам опиатных рецепторов являются налоксон, налтрексон и налмефен [86,114].
В современной медицинской практике наркотические анальгетики используются: - для купирования острой боли во время операции и в раннем послеоперационном периоде; - в терапии хронического болевого синдрома; - в комплексной интенсивной терапии отдельных клинических состояний (антагонисты наркотических анальгетиков); - для лечения наркомании [52].
Характеристика ненаркотических (неопиоидных) анальгетиков и нестероидных противовоспалительных средств, механизм действия НПВС
После внутримышечного введения буторфанол хорошо абсорбируется из места инъекции. Уже через 5 мин. распределяется половина введенного препарата. Стах в плазме крови достигается через 0,5-1 ч. после внутримышечного или интраназального введения. Связывание с белками плазмы составляет около 80%. Т\ц— 2,7 ч [61,93]. При энтеральном введении буторфанол малоэффективен, так как интенсивно метаболизируется в печени [36,61]. В организме буторфанол подвергается интенсивной биотрансформации путем гидроксилирования, N-деалкилирования и конъюгации [9,104].
Выводится буторфанол главным образом с мочой (72% введенной дозы выводится в течение 96 ч - 5% в виде свободного буторфанола, 36%) -свободный гидроксибуторфанол, 4% - свободный норбуторфанол, 4% -конъюгированный норбуторфанол); 14 % выводится с желчью. Гидроксибуторфанол (неактивный метаболит) также присутствует в плазме в концентрации, близкой к концентрации самого буторфанола [93]. Буторфанол проникает через плацентарный барьер, выделяется с грудным молоком матери [36,61].
Применяют буторфанол главным образом при сильных болях: в послеоперационном периоде, у онкологических больных, при почечных коликах, сильных травмах. Буторфанол вводят внутримышечно или внутривенно. Обычная разовая доза для взрослых: внутримышечно — 2 мг каждые 4 ч (от 1 до 4 мг в зависимости от интенсивности боли); внутривенно - 1 мг (от 1,5 до 2 мг) каждые 3-4 ч. В анестезиологической практике буторфанол применяют для премедикации, во время операции и в послеоперационном периоде. С целью премедикации вводят внутримышечно в дозе 2 мг за 30 - 60 мин. до операции. Во время операции вводят внутривенно в дозе 2-4 мг, при необходимости - дополнительно 2 мг при общей дозе 4 - 12,5 мг (0,06 - 0,18 мг/кг). У онкологических больных буторфанол применяют внутримышечно в разовой дозе 1 - 2 мг и суточной дозе 2 - 24 мг [36,62].
При введении буторфанола могут наблюдаться следующие побочные действия: - со стороны центральной нервной системы (ЦНС) и периферической нервной системы: сонливость, головокружение, спутанность сознания; при интраназальном применении возможна бессонница. - со стороны пищеварительной системы: тошнота, рвота, сухость во рту. - со стороны сердечно-сосудистой системы: редко - увеличение частоты сердечных сокращений (ЧСС), артериальная гипотензия; в единичных случаях - артериальная гипертензия. - аллергические реакции: редко — кожный зуд. - прочие: повышенное потоотделение; редко - нарушение остроты зрения; при интраназальном применении возможна отечность слизистой оболочки носовой полости [57,62].
Противопоказаниями к применению буторфанола являются тяжелые нарушения функции печени и/или почек, беременность (кроме подготовки к родам), лактация (грудное вскармливание), повышенная чувствительность к буторфанолу. В период подготовки к родам следует применять с осторожностью и при условии тщательного контроля врача. Данные о безопасности применения буторфанола при беременности до 37 недель в период лактации отсутствуют [36,61]. Не рекомендуется применять буторфанол у больных с наркотической зависимостью, а также сразу после применения наркотических средств. В случаях крайней необходимости перед применением буторфанола у таких пациентов следует принять меры, направленные на полное выведение наркотического вещества из организма.
При применении буторфанола с чистыми агонистами (например, морфином) возможно уменьшение степени анальгезии или возникновение состояния абстиненции. При одновременном применении буторфанол усиливает действие препаратов, угнетающих ЦНС (барбитураты, транквилизаторы, блокаторы гистаминовых Hi-рецепторов, этанрл и этанолсодержащие препараты). При одновременном применении с ингибиторами моноаминоксидазы (МАО) существует высокий риск развития тяжелых побочных реакций. Буторфанол фармацевтически несовместим с диазепамом и барбитуратами [35,61].
Определение буторфанола, диклофенака, кеторолака и доксиламина методом газовой хроматографии
Газовая хроматография — одна из наиболее бурно и прогрессивно развивающихся областей хроматографии. За последние годы в связи с разработкой все более чувствительной и надежной газохроматографической аппаратуры этот метод стал основным в судебно-химическом и токсикологическом анализе. Чувствительность газовой хроматографии превышает чувствительность большинства других методов, включая УФ-спектрометрию и высокоэффективную жидкостную хроматографию. Большинство исследовательских работ в газовой хроматографии стимулировалось необходимостью превратить ее из метода разделения в процедуру специфической идентификации соединений. В результате были разработаны новые виды детекторов, эффективные методы экстракции, высокоэффективные колонки. Возможность использования различных типов детекторов, а также сочетание газовой хроматографии с масс-спектрометрией, позволяет еще более повысить чувствительность и специфичность определения лекарственных веществ и их метаболитов в биологической матрице [23,38].
В работе мы использовали газовую хроматографию с электронозахватным детектором и в сочетании с масс-спектрометрией.
Электронозахватный детектор высокочувствителен к органическим соединениям, которые обладают высоким сродством к электронам. Таким образом, характеристика электронозахватного детектора зависит от молекулярной структуры анализируемого соединения, особенно от присутствия электрофоров. Электронозахватный детектор используется для детектирования алкил-галогенидов (особенно полигалогенидов), конъюгированных карбоксилов, нитрилов, металлоорганических и серосодержащих соединений [13,53].
Изучение молекулярной структуры диклофенака позволяет установить, что это хлорсодержащее соединение может быть идентифицировано методом газовой хроматографии с электронозахватным детектором. Молекула буторфанола, в отличие от диклофенака, не содержит электроноакцепторных групп. Однако содержащиеся в ее структуре две гидроксильные группы способны вступать в реакции ацилирования, что может быть использовано для введения в молекулу полигалогенового фрагмента. Помимо получения пригодного для анализа производного, метод дериватизации позволяет улучшить аналитические характеристики определяемых веществ и устранить некоторые факторы, усложняющие хроматографический процесс, а именно: 1) повысить летучесть анализируемых веществ; 2) повысить термическую стабильность анализируемых веществ; 3) значительно снизить необратимую адсорбцию; 4) улучшить разделение структурно-подобных веществ; 5) получить характерные ионы в режиме селективного ионного мониторинга (SIM) в хроматомасс-спектрометрии и увеличить массы молекулярных ионов; 6) провести дополнительную идентификацию веществ [37,58].
При изучении условий хроматографирования буторфанола нами были получены два вида его производных: триметилсилильные и пентафторпропионильные.
Исследование методом газовой хроматографии с электронозахватным детектированием осуществляли на газовом хроматографе «Кристалл»-2000М, оснащенном модулем детекторов ЭЗД, ПИД, ТИД (рабочий детектор ЭЗД) с программным обеспечением «Хроматэк Аналитик». Условия хроматографического разделения: капиллярная колонка НР-1 размерами 30 м х 0,32 мм с толщиной неподвижной фазы 0,33 мкм. Температуру колонки программировали от 130С до 240С со скоростью 25С/мин., с последующим повышением ее до 290С со скоростью 7С/мин., температура детектора и испарителя соответственно 290С и 270С. Расход газа-носителя (азота) составлял 1,35 мл/мин. Пробу вводили в газовый хроматограф в режиме деления потока газа-носителя 1:4. Объем вводимой пробы составляет 1 мкл.
Для проведения исследований нами были использованы рабочие растворы исследуемых веществ, приготовление которых осуществлялось добавлением 9 мл метанола к 1 мл стандартных метанольных растворов изучаемых веществ с концентрацией 1 мг/мл. Концентрация полученных рабочих растворов составила 0,1 мг/мл.
При исследовании диклофенака в инжектор газового хроматографа вводили рабочий метанольный раствор диклофенака с концентрацией 0,1 мг/мл.
При анализе буторфанола исследовали пробу, полученную после дериватизации пентафторпропионовым ангидридом: 100 мкл рабочего метанольного раствора буторфанола с концентрацией 0,1 мг/мл испаряли досуха в токе азота. К сухому остатку добавляли по 50 мкл ацетонитрила и пентафторпропионового ангидрида, термостатировали при 75С 15 мин., охлаждали до комнатной температуры, испаряли в токе азота. Сухой остаток растворяли в 100 мкл метанола. Пробу объемом 1 мкл вводили в инжектор газового хроматографа Аналогичным образом получали пентафторпропионильные производные морфина и 6-моноацетилморфина. Установлено, что абсолютные времена удерживания диклофенака и пентафторпропионильного производного буторфанола, отличаются друг от друга и от времен удерживания пентафторпропионильных производных морфина и 6-моноацетилморфина, что позволяет использовать метод газовой хроматографии с электронозахватным детектированием для определения диклофенака и буторфанола при совместном присутствии с другими наркотическими анальгетиками (табл. 5).
Разработка методик обнаружения и количественного определения буторфанола, диклофенака, кеторолака и доксиламина методом УФ-спектрометрии
В качестве экстрагентов нами использовались органические растворители и их смеси, наиболее часто применяемые в химико-токсикологическом анализе: хлороформ, диэтиловый эфир, гексан, этилацетат, хлороформ-2-пропанол (9:1), хлороформ-2-пропанол-гептан (50:17:33) [59,67]. Для создания необходимых значений рН среды 2,0, 4,0, 7,0, 9,0 и 12,0 использовали соответствующие универсальные буферные смеси Бриттона-Робинсона.
В практике судебно-химических и токсикологических лабораторий одними из основных требований, предъявляемых к методам изолирования, являются быстрота проведения анализа и его стоимость. Использование экстракционных туб Irvine малого объема (10 мл) вместо делительных воронок позволяет сократить время анализа в 12 раз, а расход растворителей уменьшить в 20 раз. Сравнение эффективности извлечения делительными воронками и экстракционными тубами проводилось нами на примере буторфанола. Изолирование из водного раствора проводилось одними и теми же растворителями при рН среды 12,0. Полученные результаты представлены в таблице 15.
Основываясь на полученных результатах, дальнейшие исследования мы проводили в экстракционных тубах. По 3 мл каждого буферного раствора помещали в экстракционную тубу объемом 10 мл. В тубу добавляли по 10 мкл стандартных метанольных растворов исследуемых веществ с концентрацией 1 мг/мл, по 10 мкл метанольного раствора внутреннего стандарта (МРРН) с концентрацией 30 мкг/мл, по 3 мл органического растворителя и по 3,0 г натрия хлорида. Добавление натрия хлорида позволяет разрушить образующиеся эмульсии, избавиться от белковых фракций при помощи высаливания, а также достигнуть эффекта обращения фаз. После экстракции на механическом встряхивателе в течение 5 мин. тубу центрифугировали 3 мин. при скорости 3000 об/мин для более полного разделения фаз. Органический слой отбирали в виалу и испаряли в токе азота. Сухой остаток растворяли в 100 мкл подвижной фазы (ацетонитрил -фосфатный буфер рН среды 3,8 (15:85)), 25 мкл раствора вводили в жидкостный хроматограф. Исследование проводили методом ВЭЖХ по методике, описанной ранее (глава 3). Полученные результаты, рассчитанные как среднее значение из пяти измерений, представлены в таблице 7 Приложения.
На основании полученных данных установлено, что буторфанол эффективно извлекается при рН среды 11,0-12,0 всеми органическими растворителями за исключением диэтилового эфира. Максимальная степень его изолирования достигнута при использовании смеси растворителей хлороформ-2-пропанол (9:1) и составила 97,0%. Наибольшее количество доксиламина (97,5%) извлекается при рН среды 9,0-10,0 смесью хлороформ-2-пропанол-гептан (50:17:33). Диклофенак эффективно извлекается и в кислой, и в щелочной среде всеми исследуемыми органическими растворителями. Максимальный % извлечения диклофенака и кеторолака был достигнут при рН среды 2,0 с использованием в качестве экстрагента хлороформа, и составил 86,4% и 98,0% соответственно. Поэтому изолирование изучаемых веществ при целенаправленном исследовании следует проводить в следующих условиях: буторфанол - хлороформ-2-пропанол (9:1), рН среды 11,-12,0; кеторолак и диклофенак - хлороформ, рН среды 2,0-3,0; доксиламин - хлороформ-2-пропанол-гептан (50:17:33), рН среды 9,0-10,0.
При совместном присутствии исследуемых веществ их изолирование целесообразно проводить смесью растворителей хлороформ-2-пропанол-гептан (50:17:33) при рН 9,0-10,0. Однако следует учитывать, что при данном значении рН количество выделенного из водного раствора кеторолака составляет не более 55%. % извлечения остальных исследуемых веществ в данных условиях составляет: буторфанол - 90,5%, диклофенак - 84,2%, доксиламин - 97,5%.
Для проведения экспериментов по изучению условий изолирования исследуемых веществ из мочи производили ее затравку по следующей методике: в мерные колбы на 50 мл вносили по 0,5 мл стандартных метанольных растворов исследуемых веществ с концентрацией 1 мг/мл. Объем жидкости в мерной колбе доводили до метки мочой, не содержащей наркотические средства, психотропные, исследуемые и другие токсические вещества. Таким образом, в 1 мл мочи содержалось по 10 мкг исследуемых веществ. Исследование мочи проводилось через сутки.
Была изучена зависимость степени экстракции буторфанола, кеторолака, диклофенака и доксиламина из мочи от природы органического растворителя и кратности экстракции. 1 мл Мочи, содержащей затравку, помещали в тубы для экстракции объемом 10 мл. В тубы добавляли по 2 мл воды очищенной, по 10 мкл метанольного раствора внутреннего стандарта (МРРН) с концентрацией 30 мкг/мл, по 1 мл буферного раствора для установки рН среды (доксиламин - карбонатный буфер до рН среды 9,0; буторфанол - раствор аммония гидроксида 25% до рН среды 12,0; диклофенак и кеторолак - раствор кислоты хлористоводородной 0,1 М до рН среды 2,0), по 3,0 г натрия хлорида и по 3 мл органического растворителя (хлороформ, этилацета) или смеси (хлороформ-2-пропанол-гептан (50:17:33), хлороформ-2-пропанол (9:1)). После однократной экстракции на механическом встряхивателе в течение 5 мин. тубу центрифугировали 3 мин. при скорости 3000 об/мин для более полного разделения фаз. Органический слой отбирали пастеровской пипеткой в виалу и испаряли в токе азота. Сухой остаток растворяли в 100 мкл подвижной фазы [ацетонитрил -фосфатный буфер рН среды 3,8 (15:85)], 25 мкл раствора вводили в жидкостный хроматограф.
