Введение к работе
Актуальность проблемы. Онкологические заболевания занимают одно из первых мест в мире по уровню смертности, и одним из немногих способов их эффективного лечения является цитостатическая химиотерапия. Общеизвестно, что цитостатические препараты не оказывают избирательного действия на опухоль и обладают токсическим влиянием на активно обновляющиеся клетки организма. Следствием этого является целый ряд тяжелых побочных эффектов и осложнений, возникающих при применении цитостатиков. В связи с этим поиск и создание средств, повышающих эффективность и снижающих токсические эффекты цитостатической терапии, является актуальной проблемой современной медицинской и фармацевтической науки.
Одним из наиболее перспективных направлений в данной области является поиск агентов, препятствующих развитию иммунологической резистентности опухоли, которая формируется в результате опухолепротективного влияния макрофагов и дендритных клеток, инфильтрующих опухолевую ткань и, в силу своих регуляторных способностей, обуславливающих локальную иммуносупрессию и жизнеобеспечение опухолевых клеток (ангиогенез, пролиферацию, ремоделирование тканей и т.д.) [Shurin M.R. et al. 2001; Wyckoff J.B. et al. 2007]. Известно, что макрофаги и дендритные клетки способны изменять свое функциональное состояние под влиянием веществ микробного происхождения – липополисахариды, пептидогликаны, тейхоевые кислоты и т. д. Полисахариды высших растений являются структурными аналогами этих веществ и представляют значительный интерес для онкофармакологии, т.к. они, в отличие от препаратов бактериального происхождения, обладают низкой токсичностью, не вызывают пирогенной реакции, не обладают сенсибилизирующими свойствами. Исследования последних лет свидетельствуют о том, что растительные полисахариды являются перспективными кандидатами на роль средств комплексной терапии злокачественных новообразований [Chauhan D. et al. 2005; Xie J.T. et al. 2006; Lavi I. et al. 2009; Miao Y. et al. 2009; Hsu J.W. et al. 2009; Mao F. et al. 2010]. Вместе с тем, полисахариды, в силу особенностей химической структуры, являются весьма сложной для изучения группой биологически активных веществ. Существующие в настоящее время общепринятые в фармацевтической практике методики не позволяют селективно выделять индивидуальные полисахариды из растительного сырья, определять их химическую структуру и проводить стандартизацию исследуемых образцов, что значительно усложняет проведение адекватной оценки их фармакологической активности и затрудняет интерпретацию полученных данных. В связи с этим процесс поиска и разработки новых лекарственных средств на основе полисахаридов, в настоящее время, характеризуется низкой эффективностью ввиду отсутствия единой методологической схемы, обосновывающей оптимальные пути реализации каждого этапа таких исследований.
Цель работы. На основании химико-фармакологического исследования полисахаридов высших растений разработать рациональные методологические подходы к поиску, оценке эффективности и созданию новых лекарственных средств комплексной терапии злокачественных новообразований.
Задачи исследования:
-
Выбрать растения, перспективные в качестве источников биологически активных полисахаридов, выделить и охарактеризовать полисахаридные комплексы из них.
-
Провести скрининговое исследование влияния полученных полисахаридных комплексов на эффективность химиотерапии злокачественных новообразований и выбрать образцы, обладающие наибольшей биологической активностью для дальнейшего изучения.
-
Провести углубленное изучение наиболее активных образцов в терапии злокачественных новообразований (выбор оптимальной дозы, эксперименты на разных видах лабораторных животных и различных моделях экспериментальных опухолей и т.д.).
-
Выделить индивидуальные компоненты наиболее активных полисахаридных комплексов.
-
Установить структуру веществ, ответственных за биологическую активность.
-
Разработать методы стандартизации биологически активной субстанции и растительного сырья по содержанию действующих веществ.
-
Исследовать механизмы антибластомного действия полисахаридов.
-
Обосновать рациональные методологические подходы к поиску, оценке эффективности и разработке новых лекарственных средств терапии онкологических заболеваний на основе полисахаридов высших растений.
Научная значимость и новизна результатов: На основании полученных экспериментальных данных разработаны рациональные методологические подходы к поиску, оценке эффективности и разработке новых лекарственных средств комплексной терапии злокачественных новообразований на основе полисахаридов высших растений. Впервые предложена последовательная методологическая схема, обосновывающая оптимальные пути реализации каждого этапа исследований.
Впервые экспериментально обоснована и предложена универсальная методика извлечения полисахаридов из растительного сырья, позволяющая выделять максимальный спектр водорастворимых полисахаридов с минимальным количеством примесей.
Впервые охарактеризованы полисахаридные комплексы из сырья 10 видов высших растений по количественному соотношению и молекулярной массе входящих в их состав компонентов и содержанию уроновых кислот. Впервые показано, что:
полисахаридный комплекс из корневищ с корнями левзеи сафлоровидной содержит 3 основных компонента с молекулярной массой 700 кДа (12,8%), 250 кДа (80,9%) и 30 кДа (6,3%) (общее содержание уроновых кислот 38,91±0,22%);
полисахаридный комплекс из побегов багульника болотного также состоит из трех основных компонентов с молекулярной массой 500 кДа (8,66%), 360 кДа (73,23%) и 20 кДа (18,10%), с общим содержанием уроновых кислот 95,32±0,23%;
полисахаридный комплекс из корневищ с корнями родиолы розовой содержит 2 основных компонента с молекулярной массой 750 кДа (31,65%) и 380 кДа (68,45%) с содержанием уроновых кислот 10,25±0,11%;
полисахаридный комплекс из корневищ аира болотного состоит из 5 компонентов 720 кДа (8,82%), 460 кДа (8,96%), 370 кДа (46,92%), 290 кДа (4,76%), 40 кДа (30,53%) и содержит 24,36±0,04% уроновых кислот.
Впервые показано, что в корнях одуванчика, кроме инулина и инулиноподобных полисахаридов, в большом количестве (около 2,5%) содержатся кислые полисахариды с молекулярной массой 310 и 700 кДа.
Впервые детально изучен химический состав полисахаридного комплекса из корневищ аира болотного, показано, что в его составе содержится 3 нейтральных и 2 кислых полисахарида и установлена их химическая структура: a-(1,4)-D-глюкан с молекулярной массой 40 кДа; a-D-галакто-(1,4)-a-D-глюкан с разветвлениями, состоящими из остатков a-L-рамнопиранозы и молекулярной массой 280 кДа; (1,3)-D-ксилопиранозил-a(1,4)-D-галакто-a(1,4)-D-глюкан с молекулярной массой 440 кДа; рамно-a(1,4)-D-галактопиранозилуронан с разветвлениями из остатков нейтральных сахаров (ксилозы, галактозы и глюкозы) и молекулярной массой 370 кДа и сильноразветвленный рамногалактуронан I с молекулярной массой 740 кДа.
Экспериментально обоснованы и оптимизированы методические подходы к стандартизации полисахаридсодержащего растительного сырья по содержанию биологически активных полисахаридов.
Впервые предложено проводить стандартизацию корневищ аира болотного по содержанию галактуронана и разработана методика его количественного определения в растительном сырье и в субстанции, позволяющая селективно определять галактуронан в присутствии нейтральных полисахаридов.
Проведено исследование влияния полисахаридных комплексов из сырья 10 видов высших растений на развитие экспериментальной опухоли и её цитостатическое лечение. Впервые выявлено, что:
полисахаридные комплексы из цветков липы сердцевидной, побегов багульника болотного, корневищ аира болотного и листьев мать-и-мачехи повышают противоопухолевую и антиметастатическую активность циклофосфана в отношении карциномы легких Льюис у мышей;
полисахариды аира оказывают самостоятельное противоопухолевое действие, а полисахариды липы, багульника и солодки проявляют самостоятельный антиметастатический эффект;
полисахариды левзеи, одуванчика и подорожника потенцируют противоопухолевую и не влияют на антиметастатическую активность циклофосфана.
Впервые проведено углублённое фармакологическое изучение полисахаридов аира в комплексной терапии экспериментальных опухолей, показано, что:
полисахариды аира болотного повышают эффективность цитостатиков, отличающихся по механизму действия (циклофосфан и 5-фторурацил), в отношении различных моделей опухолевого роста (меланома В-16, карциносаркома 256 Уокера, карцинома легких Льюис) и на разных видах лабораторных животных (мыши и крысы).
рамно-a(1,4)-D-галактопиранозилуронан с молекулярной массой 370 кДа и содержанием уроновых кислот 84% потенцирует противоопухолевую и антиметастатическую активность циклофосфана;
рамногалактуронан I с молекулярной массой 740 кДа и содержанием уроновых кислот 32% потенцирует антиметастатическую активность циклофосфана в отношении частоты метастазирования, количества и площади метастазов;
галактоглюканы с молекулярной массой 280 кДа и 440 кДа также способны повышать антиметастатическую активность циклофосфана в отношении частоты метастазирования опухоли и площади метастазов.
антибластомная активность полисахаридов аира болотного обусловлена наличием в молекуле полисахарида чередующихся линейных участков a-1,4-связанных остатков D-галактуроновой кислоты и участков, состоящих из a-1,2-связанных остатков D-галактуроновой кислоты и остатков рамнозы с боковыми цепями из D-галактозы (соотношение галактуроновой кислоты и нейтральных сахаров в молекуле полисахарида 1:5).
На примере полисахаридов из корневищ аира болотного, изучены иммунологические механизмы антибластомного действия полисахаридов высших растений. Впервые установлено, что:
полисахариды высших растений стимулируют активность опухоле-специфических лимфоидных клеток и созревание Т- и В-лимфоцитов, в условиях иммуносупрессии, вызванной опухолевым ростом и применением цитостатиков;
полисахариды аира болотного вызывают классическую активацию макрофагов и стимулируют продукцию ими провоспалительных цитокинов IL-12 и TNFa;
одним из механизмов антибластомного действия полисахаридов высших растений является стимулирование Th1-типа и подавление Th2-типа иммунологического ответа.
Практическая значимость работы. На основании химико-фармакологического изучения полисахаридов из 10 видов лекарственных растений разработаны рациональные методологические подходы к поиску, оценке эффективности и созданию новых лекарственных средств повышающих эффективность химиотерапии злокачественных новообразований. Впервые предложена последовательная методологическая схема реализации каждого этапа исследований.
Данные фармакологического исследования свидетельствуют, что цветки липы сердцевидной, побеги багульника болотного, корневища аира болотного и листья мать-и-мачехи являются перспективными источниками полисахаридов, повышающих эффективность противораковой терапии. Разработка и внедрение в медицинскую практику новых лекарственных препаратов и биологически активных добавок на основе исследованных полисахаридов позволит расширить ассортимент средств комплексной терапии онкологических заболеваний.
Исследование иммунотропной активности образцов позволило выявить факт снижения продукции иммуноглобулинов класса E и G1 под влиянием полисахаридов аира, мать-и-мачехи и календулы, что дает основания для их дальнейшего исследования с целью разработки на их основе новых лекарственных средств, предназначенных для терапии аллергических заболеваний.
С использованием предложенной методологической схемы поиска и разработки новых лекарственных средств для комплексной терапии злокачественных новообразований, разработан новый лекарственный препарат Полистан на основе полисахаридов аира: проведено изучение специфической фармакологической активности, общетоксических свойств и возможного мутагенного действия биологически активной субстанции.
На основе химико-фармакологических и фармакогностических исследований разработана методика извлечения полисахаридов из растительного сырья. На основании полученных данных разработана лабораторная технология и лабораторный регламент биологически активной субстанции полисахаридов аира.
На основании фитохимического анализа разработан проект Фармакопейной статьи предприятия «Аира болотного корневища», который является основой нормативной документации, регламентирующей стандартизацию растительного сырья для производства препарата на основе полисахаридов аира болотного.
Результаты фитохимических и фармакологических исследований позволили обосновать, в соответствии с современными требованиями, аналитические подходы в решении проблемы стандартизации полисахаридсодержащего лекарственного растительного сырья и лекарственных препаратов на его основе. Разработаны валидированные методики количественного определения полисахаридов растительном сырье и субстанции. Унификация и внедрение разработанной методики в практику контрольно-аналитических лабораторий позволит расширить арсенал методов стандартизации полисахаридсодержащего растительного сырья.
На основные практически значимые результаты диссертационной работы получено 8 патентов РФ: Патент №2308285, №2311918, №2329821, №2337700, №2337699, №2379047, №2378004, №2397774.
Материалы внедрения: На основе материалов Патента № 2308285 от 14.12.2005 г. «Средство, на основе полисахаридов аира болотного, повышающее противоопухолевую и противометастатическую активность цитостатических препаратов» компанией «Инноком» (г. Томск) ведется разработка нового лекарственного препарата Полистан, предназначенного для комплексной терапии злокачественных новообразований. Разработанные в рамках требований Департамента государственного регулирования обращения лекарственных средств Минздравсоцразвития России материалы (лабораторный регламент «Субстанция Полистан», проект Фармакопейной статьи предприятия «Аира болотного корневища» и отчеты по изучению специфической фармакологической активности, острой и хронической токсичности, возможных мутагенных свойств нового лекарственного препарата) используются для составления регистрационного досье (акты внедрения от 17.05.2011 г.).
Материалы Патентов №2397774 от 17.06.2009 г. «Средство, снижающее гематотоксичность цитостатических препаратов» и №2329821 от 14.03.2007 г. «Средство, обладающее иммуномодулирующей активностью» используются компанией «БиоСистемы» (г.Томск) для разработки биологически активной добавки, обладающей иммуномодулирующим эффектом и предназначенной для профилактики побочных эффектов химиотерапии (акт внедрения от 20.05.2011 г.)
Разработанная методика количественного определения кислых полисахаридов в растительном сырье, включенная в проект ФСП «Аира болотного корневища», апробирована в контрольно-аналитической лаборатории Центра по сертификации и контролю качества лекарственных средств Томской области (акт апробации от 05.05.2010 г.).
Результаты диссертационной работы включены в монографию Зуевой Е.П.. Лопатиной К.А. Разиной Т.Г., Гурьева А.М. «Полисахариды в онкологии» и в учебные пособия «Методы количественного определения поли- и олигосахаридов», «Роль поляризации антигенпрезентирующих клеток в механизмах развития иммунологической толерантности опухолей», «Разработка новых противоопухолевых лекарственных средств на основе природных БАВ», «Применение аира болотного в официнальной и народной медицине», которые внедрены в образовательный процесс Самарского государственного медицинского университета, Сибирского государственного медицинского университета и Новосибирского государственного медицинского университета (акты внедрения от 31.05.2011 г., 30.05.2011 г., 26.05.2011 г. и 24.09.2004 г.).
На защиту выносится: Научно-методическое обоснование использования растительных полисахаридов в качестве средств комплексной терапии злокачественных новообразований в т.ч.:
результаты изучения влияния полисахаридов из 10 видов лекарственных растений на развитие карциномы легких Льюис и эффективность лечения циклофосфаном;
результаты изучения химической структуры полисахаридов из корневищ аира болотного;
результаты изучения влияния полисахаридов из корневищ аира болотного на эффективность циклофосфана и 5-фторурацила, на различных моделях опухолевого роста и на разных видах лабораторных животных;
обоснование методических подходов к разработке методов стандартизации растительного сырья и проекта Фармакопейной статьи предприятия «Аира болотного корневища»;
результаты изучения механизмов антибластомного действия полисахаридов из корневищ аира болотного.
Апробация работы. Материалы диссертации апробированы на V конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2004); Российской научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2004); II международной конференции по природным и физиологически активным веществам «Natural Products and Phisiologically Active Substances» ICNPAS-2004 (Новосибирск, 2004); Российско-китайской Международной конференции по фармакологии (Китай, Харбин, 2005); конференции молодых ученых НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2005);. IV всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, 2006); 43-й Республиканской научной конференции ”Создание новых лекарственных препаратов” (Томск, 2007); II международной конференции "Natural Products: Chemistry, Technology & Medicinal Perspectives" (Алматы, 2007), конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2010); XVIII международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Крым, 2010); I всероссийской молодежной конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии» (Томск, 2010); XIV всероссийской медико-биологической конференции с международным участием. (Санкт-Петербург, 2011); юбилейной научно-практической конференции молодых ученых «Медицина XXI века». (Новокузнецк, 2011), XII Российского конгресса молодых ученых с международным участием «Науки о человеке» (Томск, 2011), XIX международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Крым, 2011).
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры фармации ФПК и ППС и Лаборатории инновационных фармацевтических технологий ЦНИЛ Сибирского государственного медицинского университета и в рамках комплексной целевой программы СО АМН РФ «Здоровье человека в Сибири» (№ Гос.регистрации 01.9.2002479).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 55 научных работ, отражающих основное содержание диссертации, из них 25 в журналах, рекомендуемых ВАК, 1 монография и 8 патентов на изобретения.
Экспериментальные исследования по теме диссертации выполнялись в Лаборатории инновационных фармацевтических технологий совместно с кафедрами химии, фармации, фармакогнозии с курсами ботаники и экологии, фармацевтической технологии Сибирского государственного медицинского университета, а также в сотрудничестве с коллективами других научных организаций: НИИ фармакологии СО РАМН г. Томск (лаборатория онкофармакологии, лаборатория экспериментального биомоделирования, лаборатория лекарственной токсикологии); НИИ органической химии СО РАН г. Новосибирск (лаборатория терпеноидов). НИИ физиологии УроРАН г.Сыктывкар.
Исследования по теме диссертации выполнены при поддержке грантов Российского фонда фундаментальных исследований (Грант 06-04-96968-офи), Фонда содействия развитию малых форм предпринимательства в научно-технической сфере (ГК № 4213р/6607 от 26.06.2006 г.), Администрации Томской области в сфере научно-исследовательских и инновационных разработок (ГК № 101 от 20.09. 2005 г. и № 255 от 23.06. 2008 г.), Федеральной целевой программы "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009-2013 годы (ГК № 02.740.11.5211 от 10.07.2010 г.).
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 293 страницах машинописного текста и состоит из введения, восьми глав, выводов, списка литературы и приложений. Работа иллюстрирована 57 таблицами и 61 рисунком. Библиографический указатель включает 448 источников литературы, из них 382 зарубежных.
Похожие диссертации на Химико-фармакологическое исследование полисахаридов высших растений и перспективы их использования в терапии злокачественных новообразований
