Введение к работе
Актуальность темы. Многие нитропроизводные анилина обладают выраженной биологической активностью и широко применяются в медицине, ветеринарии и растениеводстве. Например, 2,6-динитро-4-(трифторметил)-М,М-дипропиланилин (трифлуралин) является лекарственным средством для лечения лейшманиоза, малярии, болезни Шагасса и системным почвенным гербицидом, применяемым, в частности, на посевах лекарственных растений. Отдельные нитропроизводные анилина (2-нитроанилин; 2-нитро-4-метиланилин) используют как полупродукты в фармацевтическом синтезе и синтезе пестицидов, например, при получении трифлуралина, производстве синтетических красителей, в текстильной, лакокрасочной и других отраслях промышленности.
Нитропроизводные анилина являются токсичными веществами, класс токсичности - 2. ЛД50 2-нитроанилина для белых крыс составляет 1500 мг/кг при пероральном приеме и 800 мг/кг при введении в брюшную полость, для мышей - 1070 -1290 мг/кг, для морских свинок - 2350 мг/кг. ЛДзо трифлуралина для крыс составляет 4600 мг/кг (по другим данным 10000 мг/кг), для белых мышей - 3300 мг/кг, для кроликов, собак, кур - 2000 мг/кг.
Нитропроизводные анилина относятся к метгемоглобинобразующим ядам.
Описаны случаи отравления соединениями данной химической группы, в том числе с летальным исходом.
Отравления могут происходить при непосредственном контакте с веществами в процессе их производства, хранения и применения, при необоснованном завышении доз в процессе лечения, ошибочном приёме, вследствие аварий, в условиях загрязнения объектов окружающей среды отходами химических производств, выбросами в атмосферу и сточными водами предприятий, а также при суицидальных попытках.
Широкое применение отдельных нитропроизводных анилина, их токсические свойства, наличие случаев отравлений с летальным исходом обуславливают необходимость изучения этих соединений в химико-токсикологическом отношении.
До настоящего времени остаются недостаточно разработанными вопросы изолирования этих соединений из биологического материала, их обнаружения, идентификации и количественного определения. В доступной литературе отсутствуют данные по вопросам сохраняемости рассматриваемых веществ в биологическом (трупном) материале.
Исходя из вышеизложенного, разработка методик химико-токсикологического исследования 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина и трифлуралина является актуальной.
Цель и задач и исследования. Целью настоящего исследования является разработка методики химико-токсикологического анализа отдельных нитропроизводных анилина: 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина, 2,6-динитро-4-(трифторметил)^,Ы-дипропиланилина (трифлуралина).
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
изучить особенности электронных и колебательных спектров 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина, трифлуралина;
определить характер хроматографической активности исследуемых веществ в тонких слоях и колонках сорбентов с гидроксилированной и привитой поверхностями в случае использования жидких подвижных фаз;
исследовать хроматографическое поведение отдельных нитропроизводных анилина в капиллярных колонках при использовании газообразных подвижных фаз с последующим масс-селективным детектиро ванием;
исследовать особенности изолирования объектов изучения из биологического материала настаиванием с изолирующими агентами различной химической природы, разработать схему очистки извлечений;
изучить распределение 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина и трифлуралина в органах и биожидкостях теплокровных животных;
определить сроки сохранения рассматриваемых веществ в разлагающемся трупном материале.
Научная новизна. Изучены особенности поглощения 2-нитроанилином, 2-нитро-4-метиланилином, трифлуралином электромагнитного излучения в УФ-, видимой и ИК- областях спектра. Для повышения селективности определения рассматриваемых соединений методом электронной спектрофотометрии рассчитан ряд основных оптических характеристик.
Изучены особенности масс-спектров изучаемых веществ, полученных методом электронного удара. Показана возможность селективного и высокочувствительного определения данных соединений по совокупности характеристических сигналов осколков молекулы в масс-спектре и времени удерживания 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина, трифлуралина в капиллярной колонке при хроматографировании методом ГЖХ.
Исследованы закономерности хроматографической активности 2-нитропроизводных анилина в тонких слоях и колонках сорбентов с гидроксилированной и привитой поверхностями в условиях применения различных элюентов; определены оптимальные условия и рассчитаны параметры хроматографирования исследуемых веществ методами ТСХ и жидкостной колоночной хроматографии низкого давления.
На основе предварительных исследований разработаны методики идентификации и количественного определения рассматриваемых соединений спектральными и хромата графическими методами.
Выявлены основные параметры и условия очистки биологических объектов, содержащих 2-нитроанилин, 2-нитро-4-метиланилин и трифлуралин от соэкстрактивных веществ методам жидкость-жидкостной экстракции и различными видами хроматографии.
Впервые для изолирования отдельных нитропроизводных анилина из биологического материала в качестве изолирующего агента предложен ацетон. На основе использования ацетона как изолирующего агента и очистки методами жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии в тонких слоях и колонках сорбентов разработаны оригинальные методики определения рассматриваемых соединений в ткани трупных органов и биожидкостях, приемлемые как для исследования свежего, так и гнилостно-измененного трупного материала.
В эксперименте на животных (крысы) исследованы особенности распределения 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина и трифлуралина в организме теплокровных.
Изучена сохраняемость рассматриваемых отравляющих агентов в зависимости от температурного режима и продолжительности сохранения в гнилостно-разлагающемся трупном материале.
Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований предложено 2 варианта общей схемы исследования биоматериала при отравлении 2-нитроанилином, 2-нитро-4-метиланилином и трифлуралином.
Внедрение результатов работы:
методика идентификации трифлуралина методами ТСХ и УФ-спектрофотометрии (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного национального исследовательского университета с 13 декабря 2010 года);
методика очистки трифлуралина методами жидкость-жидкостной экстракции и нормальнофазовой колоночной хроматографии (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного национального исследовательского университета с 13 декабря 2010 года);
методика изолирования трифлуралина из ткани печени и определения методами ТСХ и УФ-спектрофотометрии (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета с 08 ноября 2010 года);
методика изолирования трифлуралина из крови и определения методами ТСХ и УФ-спектрофотометрии (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета с 08 ноября 2010 года);
методика идентификации 2-нитроанилина и 2-нитро-4-метиланилина методами ТСХ и УФ-спектрофотометрии (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу кафедры общей и биоорганической химии Курского государственного медицинского университета с 04 октября 2010 года);
методика очистки 2-нитроанилина и 2-нитро-4-метиланилина методами жидкость-жидкостной экстракции и обращеннофазовой колоночной хроматографии (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу кафедры общей и биоорганической химии Курского государственного медицинского университета с 04 октября 2010 года);
методика изолирования 2-нитроанилина и 2-нитро-4-метиланилина из ткани печени и определения методами ТСХ и УФ-спектрофотометрии (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу кафедры фармацевтической химии и клинической фармации Воронежской государственной медицинской академии с 18 октября 2010 года):
методика изолирования 2-нитроанилина и 2-нитро-4-метиланшшна из крови и определения методами ТСХ и УФ-спектрофотометрии (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу кафедры фармацевтической химии и клинической фармации ВГМА с 18 октября 2010 года);
методика изолирования 2,6-динитро-4-(трифторметил)-1'>Ш-
дипропиланилина из мочи и определения методами ТСХ и ВЭЖХ при судебно-химическом исследовании биологического материала (апробирована в экспертно-криминалистическом центре УМВД России по Орловской области, акт апробации от 14 февраля 2011 года).
методика изолирования 2-нитроанилина и 2-нитро-4-метиланилина из мочи и определения методами ТСХ и ВЭЖХ при судебно-химическом исследовании биологического материала (апробирована в экспертно-криминалистическом центре УМВД по Орловской области, акт апробации от 14 февраля 2011 года).
Основные положения, выносимые на защиту:
особенности поглощения анализируемыми веществами электромагнитного излучения в УФ-, видимой и ИК- областях спектра;
результаты исследования хроматографического поведения отдельных 2-нитропроизводных анилина в тонких слоях и колонках сорбентов с гидроксилированной и привитой поверхностями;
методики идентификации и количественного определения рассматриваемых веществ методами хроматографии, фотометрии и хромато-масс-спектрометрии;
результаты исследования особенностей очистки 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина, трифлуралина методами жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии;
- методики изолирования объектов исследования из тканей органов и
биожидкостей на основе настаивания с ацетоном и очистки от соэкстрактивных
веществ биоматериала;
- особенности распределения 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина,
трифлуралина в организме теплокровных животных;
- сохраняемость 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина, трифлуралина в
трупном материале.
Апробация работы. Основные положения работы представлены и доложены на II Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология. Биомедицинская инженерия и технология современных социальных практик» (Курск, 2009 г.), на III Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология и биомедицинская инженерия, посвященной 75-летию Курского государственного медицинского университета» (Курск, 2010 г.), на международной научно-практической конференции «Фитодизайн в современных условиях» (Белгород, 2010 г.), на IV Международной конференции «Экстракция органических соединений» (Воронеж, 2010 г.), на областной научно-практической конференции «Белгородская область: прошлое, настоящее и будущее» (Белгород, 2011 г.)
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена по плану научно-исследовательских работ кафедры фармацевтической,
токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета и соответствует проблеме «Фармация» межведомственного научного совета № 36 РАМН и научной проблеме 35.04 «Научные проблемы судебно-медицинской токсикологии, токсикологической и судебной химии» по специальности «Судебная медицина» при РАМН. Номер государственной регистрации 01.2.00960873.
Личный вклад. Автором составлен план и разработана структура исследований, проведён анализ источников литературы по теме диссертации, выполнены экспериментальные исследования, проанализированы совместно с руководителем полученные результаты, проведены статистическая обработка и анализ данных, сделаны выводы и обобщения. В работах, выполненных в соавторстве, использованы результаты исследования с долей участия автора 75-95 %.
Публикации. Основное содержание работы отражено в 20 публикациях, 5 из которых в журналах, рекомендуемых ВАК для опубликования материалов диссертационных исследований.
Объём и структура диссертации. Диссертация включает введение, обзор литературы, пять глав, содержащих результаты экспериментальных исследований, общую схему исследования, общие выводы, список цитируемых литературных источников и приложение. Работа изложена на 173 страницах, содержит 32 рисунка и 59 таблиц. Список литературы состоит из 240 источников, 110 из которых на русском и 130 - на иностранных языках.
В первой главе (обзор литературы) излагается известная информация о 2-нитроанилине, 2-нитро-4-метиланилине, трифлуралине (2,6-динитро-4-(трифторметил)-Ы,М-дипропиланилине) как объектах химического и химико-токсикологического исследования.
В главах со второй по шестую (включительно) приводятся результаты собственных экспериментальных исследований.
Во второй главе рассмотрены особенности идентификации рассматриваемых соединений методами фотометрии, хромато-масс-спектрометрии, хроматографии. Третья глава включает результаты исследований по количественному определению 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина, трифлуралина. В четвертой главе рассматриваются вопросы выделения и очистки анализируемых веществ с применением жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии. Пятая глава посвящена изучению особенностей изолирования 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина, трифлуралина из биологического материала и определения рассматриваемых соединений в получаемых извлечениях. В шестой главе приводятся результаты изучения распределения изучаемых 2-нитропроизводных анилина в организме теплокровных и их сохраняемости в трупном материале.
