Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 12
1.1 Физические свойства изучаемых соединений 12
1.2 Получение и применение отдельных производных бис-(-хлорэтил)-амина 14
1.3 Токсикологическая характеристика 16
1.4 Идентификация объектов исследования 21
1.5 Количественное определение 24
1.6 Изолирование и очистка производных бис-(-хлорэтил)-амина 29 1.7 Биотрансформация, метаболизм, распределение в теплокровных организмах производных бис-(-хлорэтил)-амина, их сохраняемость в окружающей среде 31
ГЛАВА 2 Объекты исследования, реактивы, приборы и оборудование, посуда, материалы. методы идентификации исследуемых веществ 34
2.1 Объекты исследования 34
2.2 Реактивы 34
2.3 Приборы и оборудование 35
2.4 Посуда 35
2.5 Материалы 36
2.6 Идентификация объектов исследования 36
2.6.1 Идентификация методом электронной спектрофотометрии 36
2.6.2 Идентификация методом колебательной спектрофотометрии 38
2.6.3 Идентификация методом хромато-масс-спектрометрии 40
2.6.4 Идентификация методом тонкослойной хроматографии 44
ГЛАВА 3 Количественное определение объектов исследования 52
3.1 Определение спектрофотометрическим методом
3.2 Определение спектрофотометрическим методом с предварительным получением нитропроизводных объектов исследования 56
ГЛАВА 4. Выделение и очистка объектов исследования 64
4.1 Экстракционные методы очистки 64
4.2 Хрoматографические мeтоды очистки 72
4.2.1 Очистка методом жидкостной колоночной хроматографии 72
4.2.2 Очистка методом тонкослойной хроматографии 75
4.3 Оценка эффективности очистки извлечений из биологического материала в контрольных опытах 78
4.3.1 Оценка эффективности очистки извлечений методом жидкостной колоночной хроматографии 78
4.3.2 Оценка эффективности очистки извлечений методом тонкослойной хроматографии 80
4.3.3 Оценка эффективности очистки извлечений сочетанием методов жидкость-жидкостной экстракции и колоночной хроматографии 81
ГЛАВА 5 Определение объектов исследования в биологическом материале 83
5.1 Изолирование из биологического материала методом настаивания. Выбор оптимальных условий изолирования 83
5.1.1 Выбор лучшего изолирующего агента 83
5.1.2 Изучение зависимости степени извлечения анализируемых веществ ацетоном от продолжительности настаивания 87
5.1.3 Изучение зависимости степени извлечения анализируемых веществ ацетоном от объема изолирующего агента и кратности изолирования 88
5.2 Методики определения объектов исследования в трупных органах и биожидкостях 92
5.2.1 Изолирование из трупных органов и биожидкостей 92
5.2.2 Определение с применением очистки методом жидкостной колоночной хроматографии 93
5.2.3 Определение с применением очистки методом ТСХ 95 5.2.4 Определение с применением очистки сочетанием методов
жидкость-жидкостной экстракции и жидкостной колоночной хроматографии 96
5.3 Выявление определяемого минимума хлорамбуцила, циклофосфана и ифосфамида в биологическом материале 98
5.4 Общая схема исследования биоматериала при отравлении хлорамбуцилом, циклофосфаном, ифосфамидом 103
ГЛАВА 6 Распределение объектов исследования в организме теплокровных животных и их сохраняемость в трупном материале 109
6.1 Распределение хлорамбуцила, циклофосфана и ифосфамида в организме здоровых теплокровных животных 109
6.2 Распределение хлорамбуцила, циклофосфана и ифосфамида в организме животных с нарушением выделительной функции почек 112
6.3 Сохраняемость хлорамбуцила, циклофосфана и ифосфамида 114
Выводы 118
Список сокращений и условных обозначений 120
Список литературы
- Токсикологическая характеристика
- Идентификация методом колебательной спектрофотометрии
- Очистка методом жидкостной колоночной хроматографии
- Изучение зависимости степени извлечения анализируемых веществ ацетоном от объема изолирующего агента и кратности изолирования
Токсикологическая характеристика
ХБ получают несколькими способами. Исходным сырьем синтеза может служить метиловый эфир -(п-аминофенил)-масляной кислоты, который реагирует с окисью этилена, охлажденной до 00С, образуя метиловый эфир -[п-ди-(2-оксиэтил)-аминофенил]-масляной кислоты. Последний обрабатывают хлорокисью фосфора в бензоле, получая метиловый эфир -[п-ди-(2-хлорэтил)-аминофенил]-масляной кислоты, который кипячением в соляной кислоте переводят в конечный продукт. Выход ХБ составляет до 46,5% [54].
Другим способом ХБ получают из ацетанилида и янтарного ангидрида. На первой стадии синтеза ацетанилид ацилируют ангидридом янтарной кислоты с получением 4-(4-ацетаминофенил)-4-кетомасляной кислоты, кетогруппу в которой восстанавливают водородом в растворе метанола в присутствии палладия – получают метиловый эфир 4-(4-ацетаминофенил)-масляной кислоты. Обработка последнего щелочью (с целью гидролиза амидной и эфирной связей в молекуле) ведет к образованию 4-(4-аминофенил)-масляной кислоты, взаимодействие которой с окисью этилена приводит к получению 4-[п-[бис-(2-гидроксиэтил)амино]фенил]масляной кислоты. Замещением всех гидроксильных групп в последнем соединении на атомы хлора при взаимодействии с хлорокисью фосфора получают ХБ [7, 211].
ХБ широко применяется в медицинской практике при хроническом лимфолейкозе, лимфо- и ретикулосаркоме, лимфогранулематозе, миеломной болезни, а также для лечения рака яичников и молочной железы. Может применяться в качестве иммуносупрессанта [35, 162].
Исходным веществом в синтезе ЦФ является диэтаноламин. При взаимодействии его с тионилхлоридом в среде хлороформа получают гидрохлорид ди-(2-хлорэтил)-амина, который при взаимодействии с хлорокисью фосфора образует дихлорид N,N-ди-(2-хлорэтил)-фосфамида. Последний при взаимодействии с 3-аминопропанолом-1 образует N,N-ди-(2-хлорэтил)-N,O 15 пропиленовый эфир диамида фосфорной кислоты, который перемешивают с водой для получения моногидрата. Выход конечного продукта – 34,4% [54].
Существует модификация данной методики. Целевой продукт получают в три стадии: диэтаноламин и хлористый тионил (в соотношении 1:2,53,0) кипятят в хлороформе, а продукт реакции выделяют при добавлении ацетона; затем выделенный продукт реакции кипятят в хлорокиси фосфора и выделяют образующееся вещество при добавлении четыреххлористого углерода; вновь выделенный продукт взаимодействует с 3-аминопропанолом-1 при 15-200С. Промежуточный продукт этой стадии обрабатывают водой и полученное вещество кристаллизуют из этилацетата при температуре (–5)-(–10)0C. Данная технология увеличивает выход ЦФ до 49,4% [45].
ЦФ – первое фосфорорганическое соединение, внедренное в медицинскую практику [65]. В связи с широким спектром цитостатического действия и низкой (в сравнении с аналогами) токсичностью, он используется в химиотерапии многих онкологических заболеваний: рака легкого, яичников, молочной железы, шейки матки, носоглотки; острого лимфобластного лейкоза, хронического лимфолейкоза, опухоли Вильямса, костной ретикулосаркомы, саркомы Юинга, ангиосаркомы, саркомы мягких тканей, лимфом, нейробластом, ретинобластом, опухолей яичка [35, 55, 140]. В составе BEACOPP схемы в комбинации с блеомицином, этопозидом, адриамицином, винкристином, прокарбазином и преднизолоном успешно применяется для лечения болезни Ходжкина [71].
Также ЦФ оказывает иммуносупрессивное действие, подавляя пролиферацию участвующих в иммунном ответе лимфоцитарных клонов. В большей степени он угнетает функцию переваривания перитонеальных макрофагов, в меньшей – поглощения [35, 46]. Это позволяет использовать его в схемах лечения таких заболеваний, как диффузный пролиферативный гломерулонефрит, ревматоидные артриты, системные некротические васкулиты и другие [3, 37]. ЦФ – одно из лучших средств для лечения больных с прогрессирующим волчаночным нефритом в течение длительного времени [58, 64]. Также может использоваться при трансплантации органов и тканей [46]. ИФ получают взаимодействием N-(2-хлорэтил)-N-(3-гидроксипропил)-амина с хлорокисью фосфора. В результате образуется 3-(2-хлорэтил)-2-хлортетрагидро-2Н-1,3,2-оксазофосфорин-2-оксид, который реагирует с N-(2-хлорэтил)-амином, образуя конечный продукт [7, 211]. ИФ применяют при саркомах мягких тканей, саркоме Юинга, раке легкого, молочной железы, шейки матки, яичников, опухолях яичка, лимфомах, лимфогранулематозе, остром лимфобластном лейкозе, хроническом лимфолейкозе. Возможно применение ИФ для лечения опухолей у детей [35].
В механизме противоопухолевого действия производных бис-(-хлорэтил)-амина существенную роль играют их алкилирующие свойства. Они вызывают образование сшивок и разрывов в молекуле ДНК, алкилируют гистоновые белки, нарушая процессы репликации ДНК и транскрипции [43]. Помимо клеток гиперплазированных (опухолевых) тканей, хлорэтиламины воздействуют на клетки здоровых тканей, нарушая их функции.
ХБ – один из самых токсичных представителей производных бис-(-хлорэтил)-амина. LD50 для крыс при однократном внутрибрюшинном и пероральном введении составляет 21-23 [121] и 40 мг/кг [208] соответственно. В литературе описаны случаи отравления ХБ. В основном, пострадавшими являлись дети, а отравления носили случайный характер [95, 132].
ЦФ характеризуется относительно невысокой токсичностью. LD50 для крыс при однократном внутрибрюшинном и внутривенном введении составляет 200 и 100-160 мг/кг соответственно, для мышей при пероральном и внутривенном введении – 158 и 100 мг/кг соответственно [37], для хомяков – 200 мг/кг [21, 50]. Гибель животных от дозы LD50 наступает в течение трех недель [6]. Для ЦФ характерна кумуляция токсического действия [37].
Идентификация методом колебательной спектрофотометрии
Как свидетельствуют данные рисунка 7 и таблицы 4 (приложение), в масс-спектре ХБ присутствуют сигналы характерных достаточно интенсивных осколков 63, 90, 118, 132, 146, 181, 232, 268, 286 и 317 m/Z, наиболее интенсивный из которых 268 m/Z. Его интенсивность принята за 100%. Он входит в состав кластера осколков с массами 268, 269, 270 и 271 m/Z.
Как свидетельствуют данные рисунка 8 и таблицы 5 (приложение), в масс-спектре ЦФ присутствуют сигналы характерных достаточно интенсивных осколков 42, 56, 83, 111, 133, 147, 175 и 224 m/Z, наиболее интенсивный из которых 175 m/Z. Его интенсивность принята за 100%. Он входит в состав кластера осколков с массами 175, 176 и 177 m/Z.
Как свидетельствуют данные рисунка 9 и таблицы 6 (приложение), в масс-спектре ИФ присутствуют сигналы характерных достаточно интенсивных осколков 42, 70, 92, 118, 134, 154, 183 и 211 m/Z, наиболее интенсивный из которых 211 m/Z. Его интенсивность принята за 100%. Он входит в состав кластера осколков с массами 211, 212, 213 и 214 m/Z.
Таким образом, сочетание времени удерживания в хроматографической колонке и сигналов характерных осколков масс-спектра обеспечивает высокую селективность идентификации рассматриваемых соединений методом ХМС.
Нормальнофазовая ТСХ. Для изучения хроматографического поведения ХБ, ЦФ и ИФ методом ТСХ использовались хроматографические пластины «Сорбфил» марки ПТСХ-АФ-А-УФ со слоем гидроксилированного сорбента (силикагель СТХ-1А с размером частиц 5-17 мкм) толщиной 90-120 мкм.
По 5-10 мкл 0,04% этанольных растворов исследуемых веществ наносили на линию старта хроматографической пластины «Сорбфил» размером 10 5 см. Внутренним стандартом являлся ХБ. Хроматографировали в цилиндрических стеклянных камерах с внутренним объемом около 600 см3. Камеры предварительно насыщались парами подвижной фазы в течение 30 минут. Температура воздуха и атмосферное давление при хроматографировании соответствовали нормальным условиям.
Полученные хроматограммы высушивали и проявляли в УФ-свете. Исследуемые вещества обнаруживались в виде темных пятен на более светлом общем фоне пластины. Рассчитывали значения абсолютной (Rf) и относительной (относительно ХБ) хроматографической подвижности (Rs) [1]. Хроматографическая подвижность ХБ, ЦФ и ИФ определяется их способностью к образованию водородных связей между отдельными фрагментами молекул, а также взаимодействием с сорбентом и компонентами подвижных фаз.
В первую очередь было изучено хроматографическое поведение рассматриваемых веществ в индивидуальных растворителях с различным значением диэлектрической проницаемости: ацетонитрил, бензол, толуол, гексан, диоксан-1,4, хлороформ, дихлорэтан-1,2, ДМФА, этанол, пропанол-2, бутанол-1, бутанол-2, амиловый и изоамиловый спирты, диэтиловый эфир. Результаты хроматографирования ХБ, ЦФ и ИФ в монокомпонентных подвижных фазах представлены в таблице 2.
Наименьшая хроматографическая подвижность рассматриваемых веществ наблюдается при использовании в качестве элюента малополярных растворителей (гексан, бензол), обладающих наименьшей диэлектрической проницаемостью. Отмечено увеличение хроматографической активности анализируемых соединений (сорбатов) с ростом диэлектрической проницаемости подвижной фазы (за исключением диоксана-1,4, который, обладая относительно низким значением диэлектрической проницаемости, обусловливал высокую хроматографическую активность исследуемых соединений). Наиболее высокая хроматографическая подвижность объектов исследования отмечена при использовании подвижных фаз с высокими значениями диэлектрической проницаемости: спиртов, эфиров, нитрилов и т.д.
Растворители (однокомпонентные подвижные фазы), обладающие высокими значениями диэлектрической проницаемости (ацетонитрил, ДМФА, этанол) характеризуются достаточным сродством к сорбатам. Они конкурируют с исследуемыми соединениями за образование водородных связей с силанольными группами сорбента. При этом взаимодействие хлорэтиламинов с поверхностью сорбента ослабевает, и сорбаты продвигаются по пластине вместе с подвижной фазой достаточно быстро. На хроматограммах пятна исследуемых соединений обнаруживаются ближе к линии финиша.
Очистка методом жидкостной колоночной хроматографии
Для извлечения отравляющих веществ из биоматериала и объектов небиологического происхождения в судебно-химической практике применяют методы настаивании с растворителями различной химической природы. Данный метод отличается простотой выполнения, не требует сложной аппаратуры и особых условий проведения процесса и в случае правильного подбора изолирующего агента позволяет достичь высокой степени извлечения.
Первостепенной задачей исследования явился поиск оптимального изолирующего агента. К такому изолирующему агенту предъявляется ряд требований: он должен хорошо растворять исследуемые вещества, быть летучим и не токсичным, легко проникать через клеточные мембраны и смешиваться с цитоплазматическим матриксом и межклеточной жидкостью.
В качестве потенциальных изолирующих агентов для ХБ, ЦФ и ИФ рассматривали следующие группы растворителей: воду и водные растворы кислот и щелочей (8% раствор уксусной кислоты, 0,1 н. раствор гидроксида натрия), карбоновые кислоты (ледяная уксусная кислота) и их ангидриды (уксусный ангидрид), кетоны (ацетон), алифатические спирты (этанол, пропанол–1, пропанол–2, бутанол–1, бутанол-2), циклические простые эфиры (диоксан), алканы (гексан), галогеналканы (дихлорметан, трихлорметан, тетрахлорметан), арены (бензол, толуол, о-ксилол), сложные эфиры низкомолекулярных алифатических спиртов и уксусной кислоты (метилацетат, этилацетат, пропилацетат), простые эфиры (диэтиловый эфир), нитрилы (ацетонитрил).
Готовили модельные смеси изучаемых веществ и мелкоизмельченной трупной печени из расчета 0,1 г ХБ или 0,2 г ЦФ и ИФ на 100 г биоматериала, которые выдерживали при 18-220С 1,5 часа. В аналогичных условиях выдерживали контрольные образцы печени, не содержащие анализируемые вещества. Затем осуществляли двукратное изолирование из модельных смесей. Продолжительность каждого настаивания – 45 минут, массовое соотношение «изолирующий агент : биоматериал» – 2:1. Отдельные извлечения из каждой модельной смеси объединяли и фильтровали через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия толщиной 1,5-2,0 см.
Очистку извлечений проводили методом нормальнофазовой ТСХ. Элюент – гексан–диоксан–пропанол-2 (12,5:5:1) для ХБ и (10:5:1) для ЦФ и ИФ. Хроматографировали в присутствии веществ-свидетелей по схеме, описанной в разделе 2.6.4. Хроматограммы проявляли в УФ-свете, исследуемые вещества идентифицировали по величине абсолютной хроматографической подвижности (RfХБ=0,32; RfЦФ=0,53; RfИФ=0,58). Участок пластины с веществом вырезали, вещество элюировали из сорбента этилацетатом (ХБ) или этанолом (ЦФ и ИФ). Элюат испаряли в токе воздуха при комнатной температуре, а анализируемое вещество в сухом остатке, переводили в нитропроизводное путем обработки 10% раствором нитрата калия в концентрированной серной кислоте в течение 5 минут. Оптическую плотность полученных растворов измеряли в среде 10% раствора гидроксида натрия на спектрофотометре СФ-56 в кюветах с толщиной рабочего слоя 10 мм при аналитических длинах волн 325 нм (для ХБ), 253,3 нм (для ЦФ) и 255,2 нм (для ИФ) на фоне раствора, полученного в контрольном опыте. По уравнениям градуировочных графиков рассчитывали степень извлечения того или иного вещества, изолированного из биообъекта тем или иным изолирубщиа агентом, по отношению к навеске данного вещества в модельной смеси.
Результаты определений (n=5) представлены на рисунках 19-21. Рисунок 19 – Зависимость степени извлечения хлорамбуцила (R, %) из ткани печени от природы изолирующего агента
Зависимость степени извлечения циклофосфана (R, %) из ткани печени от природы изолирующего агента Рисунок 21 – Зависимость степени извлечения ифосфамида (R, %) из ткани печени от природы изолирующего агента
Как показывают результаты эксперимента, наименьшие значения степени извлечения ХБ, ЦФ и ИФ наблюдаются при изолировании алифатическими углеводородами (гексан) и водой дистиллированной.
52,17-84,06% ХБ извлекается из биоматериала рядом гидрофильных (ледяная уксусная кислота, ацетонитрил, ацетон, диоксан) и гидрофобных (метилацетат, этилацетат, пропилацетат) растворителей. Максимальное значение степени извлечения было достигнуто при изолировании ацетоном (84,06%).
Дихлорметан, трихлорметан, ацетон, диоксан, ДМФА, ацетонитрил, ледяная уксусная кислота извлекют из биоматериала 54,43-75,77% ЦФ. Лучшим изолирующим агентом является ацетон (степень извлечения 75,77%).
52,22-72,57% ИФ извлекается дихлорметаном, ацетонитрилом, ацетоном, метилацетатом, этилацетатом, пропилацетатом, диоксаном. Наибольшее количество вещества (72,57%) извлекается при настаивании с ацетоном.
Затем проводились исследования по поиску оптимальных условий изолирования изучаемых соединений ацетоном методом настаивания. 5.1.2 Изучение зависимости степени извлечения анализируемых веществ ацетоном от продолжительности настаивания
Готовили модельные смеси исследуемых веществ и мелкоизмельченной трупной печени из расчета 0,1 г ХБ и 0,2 г ЦФ и ИФ на 100 г биоматериала, которые выдерживали 1,5 часа при 18-220С. Параллельно готовили контрольные образцы печени, не содержащие анализируемые вещества.
Анализировали по 25 г каждой модельной смеси или контрольного образца. Каждый образец модельной или контрольной смеси двукратно настаивали с 50 г ацетона в течение 15, 30, 45, 60 или 75 минут. Oтдельные извлeчeния, получeнные из одной модельной смеси, объединяли.
0,5 мл каждого из объединенных извлечений наносили на линию старта хроматографической пластины «Сорбфил» марки ПТСХ-АФ-А-УФ в виде полосы и хроматографировали в системе растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 12,5:5:1 (ХБ) или 10:5:1 (ЦФ, ИФ) по схеме, описанной в разделе 2.6.4 настоящей диссертации. Анализируемые вещества идентифицировали по величине Rf. Изучаемые соединения элюировали из сорбента этилацетатом (ХБ) или этанолом (ЦФ и ИФ).
Элюаты упаривали в токе воздуха при комнатной температуре. Исследуемые вещества в сухом остатке переводили в соответствующие нитропроизводные, обрабатывая их 10% раствором нитрата калия в концентрированной серной кислоте. Затeм в реакционную смесь добавляли 1 мл воды и 8,5 мл 10% раствора гидроксида натрия.
Оптическую плотность полученных растворов аци-нитропроизводных исследуемых соединений измеряли при аналитических длинах волн на спектрофотометре СФ-56 в кюветах с длиной оптического пути 10 мм на фоне элюата, полученного в контрольном опыте.
Изучение зависимости степени извлечения анализируемых веществ ацетоном от объема изолирующего агента и кратности изолирования
Параллельно исследовали органы и биожидкости животных контрольной группы, включающей 5 особей, которым в желудок вводили дистиллированную воду, не содержащую исследуемых веществ.
Изолирование отравляющих веществ из трупных органов и биожидкостей проводили методом двукратного настаивания. Для этого определенное количество биожидкости или измельченной биологической ткани заливали двукратным по массе количеством ацетона. Смесь выдерживали 30 (исследование ХБ) или 45 минут (исследование ЦФ и ИФ), периодически перемешивая. Изолирующий агент сливали с твердого остатка, а процесс настаивания повторяли. Извлечения объединяли и испаряли в токе воздуха при комнатной температуре до сухого остатка.
Очистку извлечений проволили методом нормальнофазовой колоночной хроматографии. Методика совпадает с таковой, используемой для очистки извлечений при изучении распределения в органах здоровых животных (раздел 6.1). Сухой остаток, получаемый после испарения объединенных фракций элюата, содержащих то или иное анализируемое вещество, растворяли в 10 мл ацетона – «исходный раствор».
Идентификация методом ТСХ. Методика совпадает с таковой, используемой для идентификции объектов исследования в извлечениях из биоматериала при изучении распределения в органах здоровых животных (раздел 6.1).
Идентификация методом ИК-спектрофотометрии. Методика совпадает с таковой, используемой для идентификции объектов исследования в извлечениях из биоматериала при изучении распределения в органах здоровых животных (раздел 6.1).
Идентификация и количественное определение методом электронной спектрофотометрии. Методика совпадает с таковой, используемой для идентификции объектов исследования в извлечениях из биоматериала при изучении распределения в органах здоровых животных (раздел 6.1).
Результаты определения изучаемых производных бис-(-хлрэтил)-амина в тканях и органах отравленных животных с нарушением выделительной функции почек представлены в таблицах 25-27 (приложение).
Установлено, что сопутствующее нарушение выделительной функции почек влияет на картину распределения анализируемых веществ в организме теплокровных животных. Исследуемые соединения в наибольших количествах присутствуют в органах ЖКТ, а также в почках, печени, крови (ХБ), почках, селезенке, крови, сердце (ЦФ), печени, селезенке, сердце (ИФ). Отмечается увеличение общего количества находящихся в организме изучаемых веществ в сравнении со здоровыми животными при прочих равных условиях.
Знaния о соxраняемости отравляющих веществ в биологическом материале используются для оценки сроков наступления смерти и определения промежутка времени с момента гибели организма, в течение которого целесообразно проведение судебно-химических исследований.
Изучали сохраняемость ХБ, ЦФ и ИФ при температурах -12оС, 1,5-2оС, 8-10оС, 18-22оС и 36оС. Готовили модельные смеси трупной печени и исследуемых веществ из расчета 0,1 г ХБ и 0,2 г ЦФ и ИФ на 100 г биоматериала. Модельные смеси хранили при одном из указанных температурных режимов. В тех же условиях выдерживали контрольные образцы печени.
Выдерживаемые при разных температурах модельные смеси исследовали на содержание изучаемых веществ через 24 часа, на 3, 7, 14 сутки после их приготовления и далее через определенные промежутки времени. В каждом случае на анализ отбирали по 25 г модельной смеси, содержащей исследуемые вещества, или контрольного образца печени.
Изолирование. ХБ, ЦФ и ИФ изолировали из биоматериала методом двукратного настаивания ацетоном по схеме, представленной в разделе 5.2.1.
Отдельные извлечения объединяли, фильтровали и упаривали при комнатной температуре в токе воздуха до сухого остатка. Сухой остаток растворяли в 10 мл ацетона – «исходный раствор».
Идентификация методом ТСХ. В выпарительную чашку вносили 0,2-2,5 мл «исходного раствора» и испаряли растворитель в токе воздуха. Полученный остаток растворяли в небольшом объеме этанола и количественно переносили на линию старта хроматографической пластины «Сорбфил» марки ПТСХ-АФ-А-УФ в виде полосы. Хроматографировали в системе гексан-диоксан-пропанол-2 в объемных соотношениях 12,5:5:1 (исследование ХБ) или 10:5:1 (исследование ЦФ и ИФ). Анализируемые вещества идентифицировали по совпадению значений Rf с таковым веществ-свидетелей.
Идентификация и количественное определение методом электронной спектрофотометрии. После хроматографирования методом ТСХ анализируемые вещества двукратно элюировали из сорбента этилацетатом (ХБ) или этанолом (ЦФ и ИФ). Элюаты объединяли и упаривали до сухого остатка. Вещества в сухом остатке нитровали 10% раствором нитрата калия в концентрированной серной кислоте. Исследовали светопоглощение полученных растворов в среде 10% раствора натрия гидроксида в интервале длин волн 200-400 нм на спектрофотометре СФ-56 в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 10 мм на фоне контрольного раствора. Исследуемые вещества идентифицировали по форме спектральной кривой и положению максимумов поглощения. По величине оптической плотности, измеренной при длинах волн 325 нм (продукт нитрования ХБ), 253,3 нм (продукт нитрования ЦФ) или 255,2 нм (продукт нитрования ИФ), рассчитывали количественное содержание исследуемых соединений, используя уравнения градуировочных графиков.
