Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 14
1.1 Получение и применение отдельных производных 4-нитроанилина 14
1.2 Физические свойства и установление химической структуры объектов исследования 15
1.3 Метаболизм и токсикологическая характеристика 17
1.4 Идентификация объектов исследования 22
1.5 Количественное определение 28
1.6 Изолирование, концентрирование и очистка нимесулида и близких по структуре соединений 34
1.7 Распределение в теплокровных организмах и сохраняемость в трупном материале объектов исследования 38
ГЛАВА 2 Объекты исследования, материалы, оборудование, реактивы. синтез рабочих стандартов и подтверждение их структуры 40
2.1 Объекты исследования 40
2.1.1 Очистка и определение содержания нимесулида 40
2.1.2 Синтез, очистка и определение содержания 4-Н-2-ФА 41
2.1.3 Синтез, очистка и определение содержания 4-А-2-ФФМСА 42
2.1.4 Синтез, очистка и определение содержания 4-МСА-3-ФФА 44
2.1.5 Синтез, очистка и определение содержания 4-Г-2-ФФМСА 45
2.2 Приборы и оборудование 47
2.2 Реактивы 48
2.3 Материалы 49
2.4 Посуда 50
2.5 Подтверждение структуры рабочих образцов 50
2.5.1 Ядерный магнитный резонанс 1Н 50
2.5.2 Колебательная ИК-спектрофотометрия 51
2.5.3 Хроматография в тонком слое сорбента 52
2.6 Идентификация фотометрическими методами 53
2.6.1 Колебательная ИК-спектрофотометрия 53
2.6.2 Электронная УФ- и видимая спектрофотометрия 54
2.7 Идентификация хроматографическими методами 55
2.7.1 Нормальнофазовая ТСХ 55
2.7.2 Обращеннофазовая ТСХ 58
2.7.3 Нормальнофазовая ВЭЖХ 59
2.7.4 Обращеннофазовая ВЭЖХ 62
2.7.5 Капиллярная газовая хроматография с масс-спектрометрическим детектированием 66
ГЛАВА 3 Количественный анализ нимесулида и близких по структуре соединений 68
3.1 Определение спектрофотометрическим методом 68
3.1.1 Анализ нимесулида, 4-нитроанилина, 4-Н-2-ФА в ДМФА 68
3.1.2 Анализ 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА, 4-Г-2-ФФМСА в этаноле 71
3.2 Определение нормальнофазовой ВЭЖХ 76
3.2.1 Анализ нимесулида, 4-НА, 4-Н-2-ФА 77
3.2.2 Анализ нимесулида, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА, 4-Г-2-ФФМСА79
3.3 Определение обращеннофазовой ВЭЖХ в градиентном режиме элюирования 81
ГЛАВА 4 Концентрирование и очистка объектов исследования 86
4.1 Экстракционные методы очистки и концентрирования 86
4.1.1 Жидкость-жидкостная экстракция гидрофобными экстрагентами 86
4.1.2 Жидкость-жидкостная экстракция гидрофобными экстрагентами в присутствии электролитов 89
4.2 Хроматографические методы очистки и концентрирования 90
4.2.1 Хроматография в тонком слое нормальнофазового сорбента 90
4.2.2 Хроматография в тонком слое обращеннофазового сорбента 92
4.2.3 Макроколоночная нормальнофазовая хроматография 93
4.2.4 Макроколоночная обращеннофазовая хроматография 95
4.3 Моделирование очистки извлечений из биоматериала в контрольных
опытах 96
4.3.1 Модель очистки в тонком слое нормальнофазового сорбента 97
4.3.2 Модель очистки в тонком слое обращеннофазового сорбента 98
4.3.3 Модель очистки с применением жидкость-жидкостной экстракции 98
4.3.4 Модель очистки на макроколонке с нормальнофазовым сорбентом 101
4.3.5 Модель очистки на макроколонке с обращеннофазовым силикагелем101
4.3.6 Модель очистки комбинацией жидкость-жидкостной экстракции и макроколоночной нормальнофазовой хроматографии 103
4.3.7 Модель очистки комбинацией жидкость-жидкостной экстракции и макроколоночной обращеннофазовой хроматографии 103
ГЛАВА 5 Определение нимесулида и близких по структуре соединений в биологическом материале 104
5.1 Изолирование из биологической ткани настаиванием. Поиск оптимальных
условий изолирования 104
5.1.1 Выбор изолирующего агента 104
5.1.2 Выбор времени настаивания с оптимальным изолирующим агентом113
5.1.3 Выбор кратности настаивания и количества изолирующего агента при оптимальном времени изолирования 113
5.2 Методики изолирования из трупных органов и биожидкостей 115
5.2.1 Методика изолирования из ткани трупного органа (печени) 121
5.2.2 Методика изолирования из крови 122
5.2.3 Методика изолирования из плазмы крови 122
5.2.4 Методика изолирования из мочи 123
5.3 Определение на основе разработанных специальных схем очистки извлечений. Установление определяемого минимума в биоматериале 123
5.3.1 Определение с использованием очистки комбинацией жидкость-жидкостной экстракции и макроколоночной нормальнофазовой хроматографии 124
5.3.2 Определение с использованием очистки комбинацией жидкость-жидкостной экстракции и макроколоночной обращеннофазовой хроматографии 126
ГЛАВА 6 Сохраняемость в трупном материале и распределение в организме теплокровных животных исследуемых соединений 130
6.1 Распределение в организме теплокровных животных (крысы) 130
6.1.1 Характер распределения нимесулида и его метаболитов 131
6.1.2 Характер распределения близких к нимесулиду структур 133
6.2 Сохраняемость анализируемых соединений в трупном материале 134
6.2.1 Сохраняемость нимесулида и продуктов его трансформации в трупном материале 135
6.2.2 Сохраняемость 4-нитроанилина, 4-Н-2-ФА и 4-Г-2-ФФМСА 137
Выводы 142
Список сокращений и условных обозначений 145
Список литературы 146
Приложение 174
- Изолирование, концентрирование и очистка нимесулида и близких по структуре соединений
- Подтверждение структуры рабочих образцов
- Определение обращеннофазовой ВЭЖХ в градиентном режиме элюирования
- Выбор кратности настаивания и количества изолирующего агента при оптимальном времени изолирования
Введение к работе
Актуальность темы. Нимесулид (N-(4-нитро-2-феноксифенил)-
метансульфонанилид) применяется в медицине как нестероидное противовоспали
тельное лекарственное средство. Близкими по структуре к нимесулиду являются 4-
нитроанилин (базовая структура), N-(4-амино-2-феноксифенил)-
метансульфонанилид и N-(4-метансульфониламино-3 -феноксифенил)-ацетамид (метаболиты нимесулида), 4-нитро-2-феноксианилин (фармакопейная примесь нимесулида), N-(4-гидрокси-2-феноксифенил)-метансульфонанилид (вновь синтезированное вещество).
Рассматриваемые соединения токсичны для теплокровных и человека. LD50 нимесулида для крыс при внутрижелудочном введении, например, составляет 200 мг/кг, LD100 4-нитроанилина - 600 мг/кг. Токсичность данной группы веществ чаще всего сопряжена с нарушением функций печени и почек.
Зарегистрированы частые случаи летального отравления человека нимесулидом и 4-нитроанилином. Отравления ими могут происходить в процессе производства веществ, при попадании их в атмосферу и сточные воды предприятий, при приёме завышенных доз или суицидальных попытках.
Широкое применение нимесулида и 4-нитроанилина, их токсические свойства, наличие случаев отравлений с летальным исходом обуславливают необходимость изучения этих соединений в химико-токсикологическом отношении. Для более надежного доказательства отравлений нимесулидом необходимо изучение его близких структур, в том числе и его метаболитов, как потенциальных объектов химико-токсикологического анализа.
Степень разработанности темы исследования. До настоящего времени недостаточно разработаны вопросы изолирования рассматриваемых веществ из биоматериала, их очистки, обнаружения, идентификации и количественного определения. Недостаточно изучены закономерности их распределения в теплокровных организмах. В доступной литературе отсутствуют данные по сохраняемости рассматриваемых веществ в трупном материале.
Исходя из вышеизложенного, разработка методик химико-токсикологического исследования нимесулида и близких по структуре соединений является актуальной.
Цель исследования. Целью настоящего исследования является разработка методик химико-токсикологического анализа нимесулида и близких по структуре соединений.
Задачи исследования. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
провести подбор условий синтеза из нимесулида рабочих стандартных образцов 4-Н-2-ФА, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА, 4-Г-2-ФФМСА и определить условия их очистки;
установить структуру и содержание основного вещества в полученных субстанциях;
изучить особенности электронных, колебательных и ЯМР 1Н спектров объектов исследования;
определить характер хроматографической активности исследуемых веществ в тонких слоях и колонках различных сорбентов при использовании методов ТСХ, макроколоночной хроматографии низкого давления, ВЭЖХ и ГХ-МС;
изучить распределение исследуемых веществ в системах из несмешивающихся жидкостей;
исследовать особенности изолирования объектов изучения из биологического материала настаиванием с изолирующими агентами различной химической природы и различного состава, разработать схемы очистки извлечений;
изучить распределение исследуемых веществ в органах и биожидкостях теплокровных животных;
определить сроки сохранения рассматриваемых веществ в гнилостно-разлагающемся трупном материале.
Научная новизна. Определены оптимальные условия синтеза из нимесулида рабочих стандартных образцов 4-Н-2-ФА, 4-МСА-3-ФФА, 4-Г-2-ФФМСА и предложены схемы их очистки. Изучены особенности поглощения анализируемыми веществами УФ-, видимого и ИК-излучения. Исследованы ЯМР 1Н-спектры данных структур.
Изучены особенности масс-спектров изучаемых веществ, полученных методом электронного удара. Показана возможность селективного и высокочувствительного определения данных соединений по совокупности характеристических сигналов осколков молекулы в масс-спектре и времени удерживания в капиллярной колонке при идентификации методом ГХ-МС.
Определены оптимальные условия и рассчитаны параметры хроматографирования исследуемых веществ методами ТСХ, ВЭЖХ и макроколоночной хроматографии низкого давления в условиях применения нормальнофазовых и обращеннофазовых сорбентов.
Разработаны методики идентификации и количественного определения объектов исследования спектральными и хроматографическими методами.
Выявлены основные параметры и условия очистки нимесулида и близких по структуре соединений от соэкстрактивных веществ биоматериала методами жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии.
Впервые обосновано применение ацетона в качестве универсального изолирующего агента для извлечения нимесулида и близких по структуре соединений из биоматериала. На основе использования ацетона как изолирующего агента и очистки методами жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии в тонких слоях и колонках сорбентов разработаны оригинальные методики определения рассматриваемых соединений в ткани трупных органов и биожидкостях, приемлемые как для исследования свежего, так и гнилостно-измененного трупного материала.
В эксперименте на животных (крысы) исследованы особенности распределения рассматриваемых веществ в организме теплокровных.
Изучена сохраняемость рассматриваемых отравляющих агентов и их трансформация в гнилостно-разлагающемся трупном материале в зависимости от температурного режима и продолжительности сохранения.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты химико-токсикологического исследования нимесулида и близких по структуре соединений позволяют расширить знания о химических и физико-химических свойствах анализируемых веществ. Полученные данные составляют основу для разработки и внедрения в практику методик химико-токсикологического анализа изучаемых веществ.
На основании проведенных исследований разработаны два варианта практических рекомендаций к проведению химико-токсикологических исследований при отравлении отдельными производными 4-нитроанилина и нимесулидом.
Внедрены и апробированы результаты работы:
методика идентификации нимесулида и его метаболитов (4-амино-2-феноксифенилметансульфонамида и 4-ацетиламино-2-феноксифенилметан-сульфонамида) методами ТСХ и УФ-спектрофотометрии внедрена в учебную и научную работу кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного национального исследовательского университета (акт внедрения № 32 от 21.09.12 г.); методика очистки нимесулида и его метаболитов (4-амино-2-феноксифенилметансульфонамида и 4-ацетиламино-2-феноксифенилметан-сульфонамида) методами жидкость-жидкостной экстракции и нормальнофазовой колоночной хроматографии внедрена в учебную и научную работу кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного национального исследовательского университета (акт внедрения № 31 от 21.09.12 г.); методика изолирования 4-нитроанилина и нимесулида из ткани печени и определения методами ТСХ и УФ-спектрофотометрией внедрена в учебную и научную работу кафедры фармацевтической химии и фармацевтической технологии Воронежской государственной медицинской академии им. Н.Н. Бурденко (акт внедрения № 62 от 17.04.12 г.); методика изолирования 4-нитроанилина и нимесулида из крови, плазмы крови и определения методами ТСХ и УФ-спектрофотометрией внедрена в учебную и научную работу кафедры фармацевтической химии и фармацевтической технологии Воронежской государственной медицинской академии им. Н.Н. Бурденко (акт внедрения № 63 от 17.04.12 г.); методика концентрирования и выделения в чистом виде нимесулида и 4-нитро-2-феноксианилина из растворов методом колоночной хроматографии низкого давления внедрена в учебную и научную работу кафедры биологической и химической технологии Курского государственного медицинского университета (акт внедрения № 48 от 25.05.12 г.); методика концентрирования и количественного определения нимесулида и 4-нитро-2-феноксианилина методом хроматоспектрофотометрии внедрена в учебную и научную работу кафедры биологической и химической технологии Курского государственного медицинского университета (акт внедрения № 49 от 25.05.12 г.); методика изолирования нимесулида, 4-нитроанилина и 4-нитро-2-феноксианилина из ткани печени и определения методами ТСХ и УФ-спектрофотометрией апробирована в экспертно-криминалистическом центре УМВД по Орловской области (акт апробации № 3 от 01.06.12 г.); методика изолирования нимесулида, 4-нитроанилина и 4-нитро-2-феноксианилина из мочи и определения методами ТСХ и УФ-спектрофотометрией апробирована в экспертно-криминалистическом центре УМВД по Орловской области (акт апробации № 4 от 01.06.12 г.).
Методология и методы исследования. Методологической составляющей диссертационного исследования стали фармакопейные статьи предприятия, а также труды отечественных ученых [В.К. Шорманова, 2004; А.С. Зайцевой, 2012].
В диссертационной работе использованы химические (титриметрия), физико-химические (ядерно-магнитный резонанс 1Н, спектрофотометрия, высокоэффективная жидкостная хроматография и газовая хроматография,
жидкостная колоночная хроматография низкого давления, жидкость-жидкостная экстракция).
Основные положения, выносимые на защиту:
условия синтеза из нимесулида 4-Н-2-ФА, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА, 4-Г-2-ФФМСА и особенности очистки указанных соединений;
особенности поглощения анализируемыми веществами электромагнитного излучения в УФ-, видимой, ИК-областях спектра и резонансного поглощения радиочастотной электромагнитной энергии (ЯМР 1Н);
результаты исследования хроматографического поведения рассматриваемых соединений в тонких слоях и колонках сорбентов с гидроксилированной и привитой поверхностями;
методики идентификации и количественного определения рассматриваемых веществ методами хроматографии, фотометрии и хромато-масс-спектрометрии;
результаты исследования особенностей очистки исследуемых веществ методами жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии;
методики изолирования объектов исследования из тканей органов и биожидкостей на основе настаивания с ацетоном и очистки от соэкстрактивных веществ биоматериала;
распределение анализируемых соединений в организме теплокровных животных и сохраняемость исследуемых соединений в трупном материале.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность полученных результатов обусловлена использованием современных и высокотехнологичных методов исследования. Значительный объем проведенных исследований отражен в виде таблиц, графиков и рисунков. Достоверность разработанных методик количественного определения изучаемых веществ подтверждается путем их валидации и статистической обработки по требованиям ГФ XI с использованием пакета прикладных программ «Microsoft Excel 2013».
Основные положения работы представлены и доложены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Традиции и инновации фармацевтической науки и практики» (Курск, 2011 г.), на Итоговых научных конференциях сотрудников КГМУ «Университетская наука: Взгляд в будущее» (Курск, 2011 г., 2013 г.), на IV, V и VI Всероссийских научно-практических конференциях с международным участием: «Биомедицинская инженерия и биотехнология» (Курск, 2011 г., 2012 г., 2013 г.), на Четвертой международной дистанционной научной конференции «Инновации в медицине» (Курск, 2011 г.), на Всероссийской научно-практической интернет-конференции с международным участием «Современные аспекты разработки и совершенствования состава и технологии лекарственных форм» (Курск, 2011 г.), на XVIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2011 г.), на Научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы судебно-медицинской экспертизы» (Москва, 2012 г.), на 77-ой Всероссийской научной конференции с международным участием «Молодежная наука и современность» (Курск, 2012 г.), на V Международной научно-методической конференции «Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных веществ» (Воронеж, 2013 г.), на IX Всероссийской конференции «Химия и медицина» с Молодежной научной школой (Уфа-Абзаково, 2013 г.). 6
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена по плану научно-исследовательских работ кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета и соответствует проблеме «Фармация» межведомственного научного совета № 36 РАМН и научной проблеме 35.04 «Научные проблемы судебно-медицинской токсикологии, токсикологической и судебной химии» по специальности «Судебная медицина» при РАМН. Номер госрегистрации 01201157804.
Публикации. Содержание работы отражено в 36 публикациях, 6 из них в журналах, рекомендуемых ВАК к опубликованию материалов диссертационных исследований. Имеется 1 положительное решение о выдаче патента.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), экспериментальной части (главы 2, 3, 4, 5 и 6), выводов, списка литературы, приложения, изложенного на 154 страницах. Диссертационная работа изложена на 144 страницах машинописного текста, содержит 21 таблицу и 17 рисунков. Библиографический список состоит из 246 источников, в том числе 151 – на иностранном языке.
Изолирование, концентрирование и очистка нимесулида и близких по структуре соединений
При изолировании ароматических аминопроизводных из биоматериала перегонкой с водяным паром может быть найдено до 73,5-93,5% токсиканта. Однако, этот метод применим для соединений с высокой летучестью [24].
Н.Ф. Казаринова, И.С. Духовная, Л.Э. Мянник [42] изолировали производные анилина из водных объектов с использованием трехкратной экстракции дихлорметаном и трихлорметаном из сильнощелочной среды.
Разделение и очистка ароматических нитросоединений проводилась в тонком слое силикагеля в системе петролейный эфир-диэтиловый эфир-уксусная кислота ледяная (90:10:1). Слой силикагеля с веществом счищали, и элюировали исследуемое вещество диэтиловым эфиром [95].
Для очистки производных 4-нитроанилина от соэкстрактивных веществ биоматериала на колонке с силикагелем КСК-1 применялся ступенчатый режим элюирования подвижными фазами: гексан, тетрахлорметан, тетрахлорметан-хлороформ (1:4), гексан-ацетон (4:1), хлороформ-ацетон (4:1) [69].
И.А. Фурсова, В.К. Шорманов [77] для очистки ароматических амино- и нитропроизводных от соэкстрактивных веществ биоматериала рекомендуют экстрагенты этилацетат и диэтиловый эфир насыщенный водой.
Изолировали лекарственные средства производные 4-нитроанилина из мочи крыс и кроликов экстракцией хлороформом, диэтиловый эфиром, дихлорметаном, дихлорэтаном, этилбензоатом, бензолом, смесью диэтилового эфира и этилацетата в соотношении 2:1 и 1:2. Заслуживает внимания изолирование ацетоном. Очистку от соэкстрактивных веществ основного характера проводили экстракцией 3н. раствором кислоты хлороводородной и хроматографированием на колонке с силикагелем КСК-1, предварительно промытой гексаном. Дополнительную очистку проводили на пластинах ТСХ. Хроматографировали сначала в гексане, а затем в системе толуол-ацетон-25% раствор аммиака в соотношении 50:50:1 [23].
Для изолирования из мочи лекарственных средств производных 4-нитроанилина и их метаболитов применяли картриджи для твердофазной экстракции марки Sep-Pak C18. Пробу в щелочи вводили в картридж, затем элюировали смесью гексан-пропанол-2 в соотношении 9:1 [225].
Для предварительного разрушения глюкуронидов производных 4-нитроанилина к моче добавляли -глюкуронидазу и 0,6 M боратный буфер с pH 9,5 и вносили в картридж Bond Elut C2. Элюировали метанолом [171].
Имеются данные об экстракции производных 4-нитроанилина из мочи с использованием твердофазной колоночной хроматографии в слое обращеннофазового силикагеля С18. Пробы в колонке промывали смесью вода-метанол (1:1) и элюировали исследуемые соединения метанолом [176]. M. Carini, G. Aldini, R. Stefani, et al. [175] предлагают две схемы изолирования для нимесулида и его несвязанных метаболитов, а также для глюкуронидов метаболитов. В случае с глюкуронидами, к образцу мочи добавляется 0.1M раствор буфера натрия ацетата с pH 4,5 и смесь -глюкуронидазы и арилсульфатазы, образец выдерживается при 37 С в течение 36 часов. Образец доводят до рН 7,0 и вносят в картридж Extrelut SPE. Элюируют смесью дихлорметан-пропанол-2 с содержанием 2,5% пропанола-2.
P. Sarkar, J.M. McIntosh, R. Leavitt, H. Gouthro [102] проводили изолирование 4-А-2-ФФМСА из мочи лошадей прибавления к 100 мл 3 г. смолы XAD-2, пробу перемешивали, отфильтровывали смолу и вносили е в колонку. Затем промывали колонку водой и элюировали 4-А-2-ФФМСА смесью дихлорметан-этилацетат (7:3). Дополнительную очистку проводили на ТСХ, в системах дихлорметан-этилацетат (90:10) и хлороформ-метанол (92:8), элюировали исследуемые соединения диэтиловым эфиром в присутствии небольшого количества 1% раствора аммония гидроксида. Изолировали нимесулид и 4 -гидроксинимесулид из мочи и плазмы крови человека экстракцией бензолом, толуолом, дихлорметаном или смесью диэтиловый эфир-дихлорметан (7:3). Известен вариант изолирования нимесулида толуолом из плазмы крови человека после ее подкисления 1М раствором ортофосфорной кислоты [119, 160, 166, 209, 210].
P. Ptacek, J. Macek, J. Klima [207] проводили пробоподготовку плазмы крови человека осаждением белков метанолом, с последующим прямым анализом пробы содержащей нимесулид без изолирования.
Лекарственные средства производные 4-нитроанилина изолировали из крови человека двумя способами используя картриджи для твердофазной экстракции. В первом в картридж вносили раствор образца крови в фосфатном буфере с рН 6,0. Затем промывали фосфатным буфером с рН 6,0, содержащим 5% ацетонитрила. Элюирование проводили этилацетатом. Во втором способе использовали картриджи Samplex C-18. Пробу в картридже промывали дистиллированной водой, затем раствором калия дигидрофосфата с рН 8,5. Элюировали исследуемые вещества хлороформом [148, 151].
Изолировали лекарственные средства производные 4-нитроанилина из крови человека бутилхлоридом после подщелачивания 0,2М раствором карбонатного буфера с рН 11,5. Из мочи и плазмы крови человека – экстракцией смесью бензол-изоамиловый спирт (98,5:1,5) с карбонатным буфером до рН 10,8. Из плазмы крови изолирование проводили экстракцией хлороформом, диэтиловым эфиром или смесью толуол-дихлорметан (9:1) [127, 130, 217, 236].
После смертельного отравления человека 4-нитроанилин изолировали из крови смесью 0,1М раствора трис буфера и экстрагента этилацетат-хлороформ в соотношении 1:1 [170]. Изолирование нимесулида из крови крыс проводили экстракцией диэтиловым эфиром с 1н. раствором кислоты хлороводородной [100]. А.М. Доброриз [29] изолировал нимесулид из крови человека толуолом в присутствии 10% кислоты хлороводородной при рН 1,0. Из трупных органов – настаиванием в течение 30 минут с 1% раствором гидроксида натрия. Затем проба подкислялась кислоты хлороводородной до рН 1,0-2,0. Очистка извлечения проводилась экстракцией хлороформом. Дополнительная очистка проводилась на колонке с оксидом алюминия. Колонка промывалась хлороформом. Элюенты: этанол или 0,1н. раствор гидроксида натрия. В случае элюирования гидроксидом натрия, элюат подкислялся кислотой хлороводородной до рН 1-2 и экстрагировался толуолом. В крови было найдено 86% нимесулида, а в печени – 36%. Некоторые лекарственные средства производные 4-нитроанилина изолировали из биоматериала непосредственно диэтиловым эфиром или диэтиловым эфиром в щелочной среде и хроматографировали на пластине с тонким слоем силикагеля, в системе гексан-ацетон (3:2) [164, 199]. Из трупного материала месячной давности лекарственные средства производные 4-нитроанилина изолировали водой с 6н. раствором хлороводородной кислоты, экстрагировали хлороформом и хроматографировали метанолом в тонком слое забуференного силикагеля 0,1М раствором калия гидросульфата, элюент – метанол [1]. Нимесулид и лекарственные средства производные 4-нитроанилина изолировали из трупного материала по методу Стаса-Отто, этанолом подкисленным щавелевой кислотой, и по методу Васильевой – водой подкисленной щавелевой кислотой. Очистку проводили экстракцией хлороформом в широком интервале рН (для нимесулида – диэтиловым эфиром из кислой среды). Очищали хлороформные извлечения в тонком слое силикагеля КСК, элюент – хлороформ-ацетон (9:1). Количество извлеченного нимесулида по методу Стаса-Отто составило 23,9%, а по методу Васильевой – 5,2% [12, 33]. Больший процент извлечения лекарственных средств производных 4-нитроанилина из биоматериала (до 71,59%) наблюдается при изолировании этанолом 96% в присутствии аммония сульфата или натрия хлорида [84].
Подтверждение структуры рабочих образцов
Для установления химической структуры исследуемых соединений, содержащих в составе своих молекул протоны, применяли метод ЯМР 1Н.
Средой анализа явился апротонный растворитель дейтерированный диметилсульфоксид (ДМСО-d6), внутренним стандартом – тетраметилсилан.
Исследуемое вещество растворяли в ДМСО-d6, содержащем ТМС, и помещали в кювету ЯМР-спектрометра Bruker-AM 300. Рабочая частота прибора – 300,13 Мгц. Регистрировали ЯМР 1Н спектры и определяли величины сдвигов милионных долей, соответствующие сигналам протонам определенных функциональных групп в молекуле. Интегрируя площади пиков, производили количественную оценку протонов атомов, входящих в состав молекулы. Полученные спектры ЯМР 1Н изображены в соответствии с рисунками 1-6 (приложение). Характеристики ЯМР 1Н спектров и соответствия химических сдвигов определенным фрагментам молекул исследуемых соединений приведены в таблице 3 (приложение). Анализ полученных результатов позволил подтвердить соответствие структур синтезированных соединений теоретически предполагаемым структурам веществ.
Химическую структуру синтезированных образцов нимесулида и близких к нему структур исследовали методом ИК-спектрофотометрии, основанным на поглощении химическими связями данных соединений электромагнитного излучения в инфракрасном диапазоне. Полосы поглощения на спектрах данных соединений характеризуют колебания химических связей различных функциональных групп входящих в состав молекул. Таким образом, в результате расшифровки полученных данных возможно получение информации о химическом составе молекул и характере расположения групп атомов относительно друг друга. Для получения ИК-спектров несколько миллиграмм каждого из веществ запрессовывали в диск с калия бромидом и проводили измерение пропускания на ИК – Фурье спектрометре «Shimadzu» IR Prestige-21 в интервале 4000-400 см-1 через 1 см-1.
На ИК-спектрах исследуемых веществ в соответствии с рисунками 7-12 (приложение) отмечали максимумы характеристических полос пропускания и находили соответствие полос определенным колебаниям атомов и групп атомов в молекуле. Результаты представлены в таблицах 4-9 (приложение).
Общими для 4-нитроанилина, нимесулида, 4-Н-2-ФА, 4-А-2-ФФМСА и 4-МСА-3-ФФА, 4-Г-2-ФФМСА являются колебания –С=С– связей бензольных ядер в интервалах частот 1624-1446 см-1, а также валентные (3072-3010 см-1) и деформационные колебания –С–Н связей (1182-690 см-1).
В ИК-спектрах нимесулида, 4-А-2-ФФМСА и 4-МСА-3-ФФА, 4-Г-2-ФФМСА наблюдаются колебания –С–О– связей бифенилового простого эфира в интервале частот 1274-1068 см-1, валентные колебания –С–Н метильной группы (1463-1433 см-1; 2939-2837 см-1) и –S=О связей (698-594 см-1; 1328-1157 см-1), а также валентные колебания –N–Н связей (3574-3269 см-1) вторичной ароматической аминогруппы метансульфонамидного фрагмента молекул.
Характерными для нимесулида, 4-Н-2-ФА и 4-нитроанилина являются асимметрические (1521-1504 см-1) и симметрические (1340-1327 см-1) валентные колебания ароматической нитрогруппы.
Колебательные спектры 4-нитроанилина, 4-Н-2-ФА и 4-А-2-ФФМСА имеют характеристические полосы, соответствующие валентным колебаниям – N–Н связей свободной (3481 и 3361 см-1) и ассоциированной (3237 и 3198 см-1) первичной ароматической аминогруппы, а также полосы асимметрических (3473-3398 см-1) и симметрических (3350-3329 см-1) валентных колебаний первичной ароматической аминогруппы.
Несмотря на схожесть структур 4-нитроанилина, 4-Н-2-ФА, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА и 4-Г-2-ФФМСА с нимесулидом, в их ИК-спектрах имеются характерные отличия. У 4-Г-2-ФФМСА присутствуют колебания, связанные с группой –O–H (1388 и 1317 см-1). В ИК-спектре 4-МСА-3-ФФА выявлены валентные колебания –N–Н связей свободной (3574 см-1) и ассоциированной (3354 и 3269 см-1) вторичной ароматической аминогруппы, а также колебания связей –С=О (1672 см-1) ацетиламиногруппы (полоса «Амид 1»).
Исследование чистоты синтезированных образцов нимесулида и близких по структуре соединений проводили методом нормальнофазовой тонкослойной хроматографии на пластинах «Сорбфил» с УФ-индикатором 254 нм (неподвижная фаза – силикагель марки СТХ-1 ВЭ, размер частиц 8-10 мкм, связующее вещество – силиказоль).
Чистоту 4-Г-2-ФФМСА дополнительно исследовали на пластинах Silufol UV-254 (неподвижная фаза – широкопористый силикагель по Питри марки Silpearl, связующее вещество – крахмал, фирма «Kavalier», Чехия). На линию старта хроматографической пластины размером 107,5 см наносили по 5-10 мкл 0,04% этанольных растворов исследуемых веществ. Хроматографировали в камерах с внутренним объемом около 600 см3.
Пластины по окончании хроматографирования высушивали в токе воздуха при комнатной температуре и проявляли в УФ-свете. 4-Г-2-ФФМСА на пластинах Silufol UV-254 проявляли в УФ-свете, а также реактивом на фенольный гидроксил. Состав реактива: 0,5 мл смеси 10 объемных частей 0,1% раствора натрия сульфатиазола в 0,1 М растворе кислоты хлороводородной и 4% водного раствора нитрия нитрита; 0,5 мл аммония гидроксида 25%; 1 мл этанола и 8 мл воды очищенной. Пятно 4-Г-2-ФФМСА после опрыскивания пластины указанным реактивом окрашивалось в розовое с коричневатым оттенком, через несколько часов переходило в коричневое. Результаты хроматографирования представлены в таблице 19 (приложение).
Образцы 4-Н-2-ФА хроматографировали на пластинах «Сорбфил» в системах гексан-пропанол-2 (8:2) и гексан-этилацетат (8:2), 4-А-2-ФФМСА – толуол-ацетонитрил (8:2) и гексан-ацетон (6:4), 4-МСА-3-ФФА – гексан-диоксан (5:5) и гексан-этилацетат (5:5) и 4-Г-2-ФФМСА – гексан-пропанол-2 (8:2) и толуол-этилацетат (8:2). Образцы 4-Г-2-ФФМСА дополнительно анализировали на пластинах Silufol UV-254 в элюенте гексан-этилацетат (6:4). Результаты анализа выявили присутствие только одного пятна на хроматографических пластинах при анализе синтезированных рабочих образцов.
Идентификацию методом спектрофотометрии в инфракрасной области спектра по схеме указанной в разделе 2.1.2. В ходе исследования устанавливали максимумы характеристических полос пропускания и их интенсивность. Вещество идентифицировали по совпадению значений максимумов спектра исследуемого вещества со спектром стандарта, а также формы кривых анализируемых спектров.
Результаты представлены в соответствии с рисунками 7-12 и в таблицах 4-9 (приложение).
Определение обращеннофазовой ВЭЖХ в градиентном режиме элюирования
Жидкость-жидкостную экстракцию применяли для очистки, разделения и концентрирования исследуемых веществ, находящихся в извлечениях из биологического материала.
Изучали особенности экстрагирования нимесулида и близких по структуре соединений из водных растворов, варьируя условия экстракции (тип экстрагента, наличие или отсутствие электролита, тип электролита, значения рН водной фазы).
При изучении характера экстрагирования рассматриваемых соединений из водных растворов было выбрано по одному гидрофобному экстрагенту из различных химических групп. Из группы алифатических углеводородов выбран н-гексан, ароматических углеводородов – бензол, галогеналканов – хлороформ, алифатических спиртов – н-бутанол, простых эфиров – диэтиловый эфир, сложных эфиров – этилацетат. Дополнительно изучали экстракцию диэтиловым эфиром и этилацетатом насыщенными водой.
Для этого в ряд делительных воронок вносили по 25 мл 1 М раствора серной кислоты, по 0,1 М раствора кислоты хлороводородной, по 25 мл буферного раствора с различным значением рН (0,3-11,98) по 25 мл 5%, 15%, 25% раствора натрия гидроксида. В качестве буферного раствора использовали универсальную буферную смесь кислот (ортофосфорной – 3,92 г, борной – 2,48 г, уксусной – 2,4 г до 1 л) и 0,2 М раствор натрия гидроксида, взятых в различных соотношениях. Затем вносили 25 мл водного раствора одного из исследуемых соединений
(4-нитроанилин, 4-Н-2-ФА и нимесулид – 5 мкг/мл, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3 ФФА и 4-Г-2-ФФМСА – 6 мкг/мл) и 10 мл экстрагента. После 100 равномерных аккуратных покачиваний воронок (в течение 3,5 мин) содержимое воронок отстаивали в течение пяти мин. Затем контактирующие фазы отделяли друг от друга. Экстракты органического слоя помещали в выпарительные чашки и удаляли растворитель в токе воздуха при комнатной температуре. Каждый из остатков 4-нитроанилина, 4-Н-2-ФА и нимесулида растворяли в 10 мл ДМФА, остатки 4-А-2-ФФМСА, 4-Г-2-ФФМСА и 4-МСА-3-ФФА в чашках растворяли в 10 мл этанола. Оптическую плотность каждого раствора измеряли на спектрофотометре СФ-2000 при соответствующих длинах волн (4-нитроанилин – 384,9 нм; 4-Н-2-ФА – 390,3 нм; нимесулид – 439,4 нм; 4-А-2-ФФМСА – 249,7 нм; 4-МСА-3-ФФА – 254,3 нм; 4-Г-2-ФФМСА – 241,5 нм) в кюветах 10 мм на фоне растворов контрольного эксперимента. Используя уравнения калибровочных графиков (см. 3.1.1 и 3.1.2) и значения полученных оптических плотностей определяли количество анализируемого вещества, перешедшего в слой экстрагента (R%, r=n). Используя полученные данные по известным формулам рассчитывали значения степени однократного экстрагирования в условиях соотношения водной и органической фаз 1:1 (R%, r=1) [50]. Результаты представлены в соответствии с рисунками 33-38.
Анализ полученных результатов позволил оценить влияние рН среды в условиях равенства контактирующих фаз на характер извлечения исследуемых соединений гидрофобными экстрагентами из водных растворов. Кривые экстракции 4-нитроанилина и 4-Н-2-ФА показали, что данные соединения достаточно хорошо экстрагируются в широком интервале рН практически всеми экстрагентами, кроме гексана. Лучшим экстрагентом для 4-нитроанилина явился этилацетат насыщенный водой (при r=1 степень экстрагирования составляет 77,89-87,41%). Худшим – гексан (1,21-6,47%). Лучшим экстрагентом для 4-Н-2-ФА явился бензол (при r=1 степень экстрагирования составляет 95,96-99,51%). Худшим – гексан (87,06-95,37%). Кривые экстракции нимесулида, 4-МСА-3-ФФА и 4-Г-2-ФФМСА выявили их способность, как соединений кислого характера, экстрагироваться из кислых сред. Наилучшая экстрагируемость нимесулида большинством гидрофобных экстрагентов достигается в интервале рН 0,3-5,02. В качестве лучшего экстрагента был выбран этилацетат (при r=1 степень экстрагирования составляет 43,49-96,75%). Следует отметить, что при сдвиге рН от 5,02 до 0,3 в кислую сторону эстрагируемость нимесулида гексаном возрастает от 4,98 до 67,25%.
Интервалы экстрагируемости многими гидрофобными экстрагентами 4 МСА-3-ФФА и 4-Г-2-ФФМСА по сравнению с нимесулидом еще больше уширены и находятся в диапазоне рН 0,3-10,88. 4-МСА-3-ФФА и 4-Г-2-ФФМСА лучше экстрагируются этилацетатом (при r=1 степень экстрагирования составляет соответственно 94,21-99,98 и 94,72-99,99%). Низкие значения экстрагируемости 4-МСА-3-ФФА и 4-Г-2-ФФМСА гексаном (0,23-3,41% и 0,01-10,13% соответственно, r=1) по сравнению с нимесулидом, позволяют использовать данные условия для отделения 4-МСА-3-ФФА от нимесулида в водных средах при их совместном присутствии (например, биожидкости людей, принимавших нимесулид). Наилучший характер экстрагируемости 4-А-2-ФФМСА гидрофобными экстрагентами наблюдается в интервале рН 2,87-8,95. Данный факт подтверждает слабую основность 4-А-2-ФФМСА. В интервалах рН 2,87-0,3; 8,95-11,98; а также в 5, 15 и 25% растворах гидроксида натрия наблюдается снижение величины экстрагируемости данного соединения. Лучшим экстрагентом явился этилацетат насыщенный водой (при r=1 степень экстрагирования составляет 63,91-99,06%). Худшие значения показал гексан (4,05-4,2%). Комплексный анализ данных экстрагирования 4-нитроанилина, 4-Н-2-ФА, нимесулида, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА и 4-Г-2-ФФМСА позволил выявить условия экстракции, при которых возможно селективно экстрагировать нимесулид, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА из диэтилового эфира в водную фазу. Так, при извлечении нимесулида буферным раствором с рН 7-8 из эфирной фазы 4-А-2-ФФМСА и 4-МСА-3-ФФА практически полностью остаются в диэтиловом эфире. При экстрагировании 4-А-2-ФФМСА буферным раствором с рН 0,3-0,5 4-МСА-3-ФФА практически полностью остается в эфирном слое и не переходит в водную фазу. Дальнейшее экстрагирование 4-МСА-3-ФФА из эфирного слоя буферным раствором с рН 11-12 позволяет практически полностью извлечь 4-МСА-3-ФФА из эфирного слоя.
Для улучшения условий экстрагирования каждого из анализируемых соединений был проведен дальнейший подбор оптимального высаливающего электролита в сочетании с выбранным лучшим гидрофобным экстрагентом.
Выбор кратности настаивания и количества изолирующего агента при оптимальном времени изолирования
На третьем этапе поиска оптимальных условий проводили выбор количества изолирующего агента и кратности настаивания, используя лучший изолирующий агент – ацетон и лучшее время настаивания – 45 минут.
Модельные смеси исследуемых веществ с мелкоизмельченной тканью трупной печени (0,05 г анализируемого вещества в 100 г биоматериала) выдерживали 1,5 часа при температуре 18-20 С при периодическом перемешивании. Параллельно готовили контрольные образцы без веществ.
По 25 г каждой модельной смеси исследуемого вещества и контрольного образца настаивали с различными количествами ацетона (25; 50; 62,5; 75 и 100 г) при регулярном перемешивании в течение 45 минут. Процесс настаивания с различными количествами ацетона проводили на одних и тех же анализируемых образцах биоматериала четырехкратно. При этом каждый раз собирали извлечения по отдельности [87]. Извлечения полученные из каждого опыта анализировали как указано в п. 5.1.1. По результатам измерений определяли количество анализируемого вещества по калибровочному графику, учитывая аликвоту наносимую на пластину ТСХ и объем изолирующего агента. Затем определяли процент изолирования вещества из биологического материала, по отношению к количеству, внесенному в модельную смесь. Результаты определения (n=5) представлены в таблицах 16-21.
Анализ полученных данных показал, что масса изолирующего агента для изолирования нимесулида и близких по структуре соединений должна превышать массу биоматериала как минимум в два раза. Оптимальные количества анализируемых соединений извлекаются при этом в условиях как минимум двукратного настаивания.
Оптимальные условия изолирования (настаивание ацетоном двукратно по 45 минут) применяли для анализа ралзичных видов биологического материала (трупная печень, кровь, плазма крови и моча) [88, 89].
В химические стаканы вносили в интервале от 0,02 до 1,0 мл различные аликвоты ацетоновых растворов исследуемых веществ с определенными концентрациями, и отгоняли ацетон в потоке теплого воздуха с температурой 35-40 С. Затем в стаканы, остывшие до температуры 18-20 С вносили по 25 г биологического материала (ткани трупной печени, крови, плазмы крови или мочи) и тщательно перемешивали. Приготовленные таким образом различные количества каждого из анализируемых соединений в 25 г биоматерила выдерживали 1,5 часа (температура 18-20 С) при периодическом перемешивании, данные представлены в таблицах 33-55 (приложение). Параллельно готовили контрольные образцы биоматериала без веществ по вышеуказанной схеме.
25 г искуственной смеси мелкоизмельченной трупной печени с анализируемым веществом и такое же количество контрольного образца настаивали с 50 г ацетона двукратно по 45 минут при регулярном перемешивании. Сухой бумажный фильтр промывали ацетоном. Объединенные извлечения, полученные после настаивания, фильтровали, и промывали фильтр 15-20 мл ацетона. Собранный фильтрат и промывной раствор объединяли в выпарительной чашке и упаривали до сухого остатка в токе воздуха при комнатной температуре. Остаток растворяли в 10-15 мл ацетона, фильтровали, промывали фильтр ацетоном, и снова упаривали до сухого остатка. Параллельно проводили вышеуказанные операции с образцом контрольного извлечения.
25 г искуственной смеси крови с анализируемым веществом и такое же количество контрольного образца настаивали с 50 г ацетона двукратно по 45 минут при регулярном перемешивании. Сухой бумажный фильтр промывали ацетоном. Объединенные извлечения, полученные после настаивания, фильтровали, и промывали фильтр 15-20 мл ацетона. Собранный фильтрат и промывной раствор объединяли в выпарительной чашке и упаривали до сухого остатка в токе воздуха при комнатной температуре. Остаток растворяли в 10-15 мл ацетона, фильтровали, промывали фильтр ацетоном, и снова упаривали до сухого остатка. Параллельно проводили вышеуказанные операции с образцом контрольного извлечения.
5.2.3 Методика изолирования из плазмы крови 25 г искуственной смеси плазмы крови с анализируемым веществом и такое же количество контрольного образца настаивали с 50 г ацетона двукратно по 45 минут при регулярном перемешивании. Сухой бумажный фильтр промывали ацетоном. Объединенные извлечения, полученные после настаивания, фильтровали, и промывали фильтр 15-20 мл ацетона. Собранный фильтрат и промывной раствор объединяли в выпарительной чашке и упаривали до сухого остатка в токе воздуха при комнатной температуре. Остаток растворяли в 10-15 мл ацетона, фильтровали, промывали фильтр ацетоном, и снова упаривали до сухого остатка. Параллельно проводили вышеуказанные операции с образцом контрольного извлечения. 25 г искуственной смеси мочи с анализируемым веществом и такое же количество контрольного образца настаивали с 50 г ацетона. 45 минут при регулярном перемешивании. Затем в образцы добавляли еще 50 г ацетона и процесс настаивания повторяли. Сухой бумажный фильтр промывали ацетоном. Извлечение, полученное после настаивания, фильтровали, и промывали фильтр 15-20 мл ацетона. Собранный фильтрат и промывной раствор объединяли в выпарительной чашке и упаривали до сухого остатка в токе воздуха при комнатной температуре. Остаток растворяли в 10-15 мл ацетона, фильтровали, промывали фильтр ацетоном, и снова упаривали до сухого остатка. Параллельно проводили вышеуказанные операции с образцом контрольного извлечения.
Остатки в чашках, после испарения извлечений из ткани трупного органа или биожидкости исследовали, применяя различные схемы очистки.
Использовали очистку двумя способами: комбинацию экстракции и нормальнофазовой колоночной хроматографии низкого давления, а также комбинацию экстракции и обращеннофазовой колоночной хроматографии низкого давления.
Определение с использованием очистки комбинацией жидкость-жидкостной экстракции и макроколоночной нормальнофазовой хроматографии
Очистка извлечений методом жидкость-жидкостной экстракции.
Каждый из полученных остатков в п. 5.2.1-5.2.4 растворяли в 10 мл ацетонитрила (анализ 4-нитроанилина и 4-Н-2-ФА) или 10 мл диэтилового эфира (анализ нимесулида, 4-А-2-ФФМСА и 4-МСА-3-ФФА) или 10 мл хлороформа (анализ 4-Г-2-ФФМСА). Дальнейший процесс экстракции проводили согласно схемам в п. 4.3.3. При экстрагировании каждого из соединений первый и второй экстракты упаривали в токе воздуха при комнатной температуре до сухого остатка.
Очистка извлечений методом нормальнофазовой жидкостной колоночной хроматографии низкого давления. Полученный остаток в чашке после экстракционной очистки растворяли в 2-3 мл ацетона и присыпали к полученному раствору 1,5 г силикагеля L 40/100 мкм. Дальнейшие операции проводили по схеме, указанной в п. 4.3.4. В качестве элюента для 4-нитроанилина, 4-Н-2-ФА и нимесулида использовали смесь гексан-ацетон (8:2), для 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА и 4-Г-2-ФФМСА – гексан-ацетон (6:4). Фракции элюата, содержащие анализируемые вещества (п. 4.2.3 настоящей диссертации), объединяли, элюент упаривали в токе воздуха при комнатной температуре до сухого остатка. Остаток растворяли в 10 мл ацетона – «исходный раствор».
