Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1 Химический состав жома плодов винограда 10
1.1.1 Характеристика липофильного комплекса жома плодов винограда 10
1.1.2 Характеристика полифенольного комплекса жома плодов винограда 13
1.2 Химический анализ полифенолов винограда 19
1.2.1 Катехины 19
1.2.2 Проантоцианидины 22
1.2.3.Феноловые кислоты 29
1.3 Механизмы фармакологического действия флавоноидов 31
1.4 Применение ЛП и БАД на основе экстрактов винограда в медицинской практике 42
Глава 2 Изучение возможности применения жома плодов винограда в качестве источника экстрактов с выраженной биологической активностью
2.1 Получение образцов сухого экстракта жома плодов винограда 54
2.2 Изучение биологической активности экстрактов жома плодов и гребней винограда с помощью ферментных биотест-систем 58
Глава 3 Скрининговый анализ полифенольных соединений в сухих экстрактах жома плодов и гребней винограда
3.1 Предварительный качественный анализ полифенольных соединений в анализируемых экстрактах 62
3.2 Спектрофотометрический анализ экстрактов жома плодов и гребней винограда в УФ-области спектра 64
3.3 ВЭЖХ-анализ полифенольных соединений в анализируемых экстрактах 72
3.4 Хроматографический анализ полифенольных соединений в экстрактах жома плодов и гребней винограда в тонких слоях сорбента 89
Глава 4 Разработка комплексного подхода к качественному и количественному анализу полифенольных соединений в сухих экстрактах жома плодов и гребней винограда
4.1 Качественный анализ полифенолов в анализируемых экстрактах 95
4.2 Количественный анализ полифенолов в анализируемых экстрактах .100 CLASS
Глава 5 Оценка полифенольного состава некоторых биологически активных добавок отечественного и зарубежного производства 118 CLASS
Выводы 145
Список литературы 140
Приложения 150
- Химический анализ полифенолов винограда
- Изучение биологической активности экстрактов жома плодов и гребней винограда с помощью ферментных биотест-систем
- Спектрофотометрический анализ экстрактов жома плодов и гребней винограда в УФ-области спектра
- Количественный анализ полифенолов в анализируемых экстрактах
Введение к работе
В настоящее время на Российском фармацевтическом рынке появляется большое количество лекарственных препаратов и биологически активных добавок (БАД) из лекарственных растений, не включенных в Государственную Фармакопею, но обладающих выраженной биологической активностью и полезными для здоровья человека эффектами. Ярким примером являются препараты на основе экстрактов Винограда культурного (Vitis vinifera L.,cqm. Vitaceae).
Большая популярность препаратов винограда обусловлена их высокой фармакологической активностью и выраженными клиническими эффектами. История появления этих препаратов связана с изучением полезных свойств красного виноградного вина и явлением, получившим название «французский парадокс». Суть которого заключается в существенном снижении уровня сердечно-сосудистой заболеваемости в популяции на фоне традиционного потребления продуктов виноделия. Экстракты винограда содержат комплекс полифенольных соединений, обладающих очень мощным антиоксидантным действием, по силе превышающем аскорбиновую кислоту в 20 раз и ос-токоферол в 50 раз, благодаря чему эти соединения названы самыми важными биологически активными добавками десятилетия [76].
Экстракты винограда получают из разных частей Винограда культурного. Так на основе семян винограда за рубежом созданы лекарственные препараты и биологически активные препараты, известные под различными торговыми названиям и представленные на российском рынке - «Эндоте-лон», «Пикногенол», «Grape seed», «Французский парадокс» и др. Основное фармакологическое действие этих препаратов — лечение и профилактика сердечно-сосудистых заболеваний.
У нас в стране начало изучения биологически активных соединений винограда связано с изучением водно-спиртового экстракта гребней винограда под названием «Каприм», разработанного около 30 лет назад в Тихоаке- анском океанологическом институте АН СССР под руководством И.И. Брех-мана. Первые промышленные партии производились из отходов винограда, выращенного в Кахетии, отсюда и произошло название «Каприм» (Кахетия — Приморье).
Основное действие Каприма — повышение сопротивляемости организма токсическому действию алкоголя и сильные антиоксидантные свойства. На его основе до настоящего времени производится ряд БАД: «Корда-Парафарм», «Биомиллениум», «Нестарин» и др.
В качестве лекарственного растительного сырья для экстрактов винограда до недавнего времени отечественные производители использовали, как правило, гребни винограда. Недавно на российском рынке парафармацевти-ческих товаров появилась БАД «Иммортель», сырьём для получения которой служит сок плодов винограда. Помимо экстрактов винограда отечественные производители БАД начали выпускать «Экстракты красного виноградного вина» (Парафарм, Эвалар).
Отходом винодельческой промышленности помимо гребней является жом плодов винограда, который может стать перспективным сырьевым источником для получения обогащенных антиоксидантными веществами экстрактов.
Полифенольные соединения винограда представлены различными классами органических соединений, поэтому стандартизация препаратов на основе экстрактов винограда по показателям качественный состав и количественное содержание действующих веществ представляет собой очень сложный и трудоёмкий процесс, требующий применения современных физико-химических методов анализа. Разработка простых и легко воспроизводимых методик качественного и количественного анализа полифенольных соединений в сухих экстрактах винограда является актуальной.
7 Цель исследования и задачи исследования
Целью настоящей работы является совершенствование стандартизации различных экстрактов винограда, а также ЛП и БАД на их основе и изучение потенциальной возможности применения жома плодов винограда в качестве сырьевого источника для получения экстрактов с выраженной биологической активностью.
В соответствии с указанной целью было предусмотрено решение следующих задач:
Подобрать оптимальные технологические условия для получения экстрактов из жома плодов винограда.
Изучить биологическую активность полученных экстрактов жома плодов винограда при помощи ферментных биотест-систем in vitro.
Провести скрининговый анализ полифенольных соединений винограда в сухих экстрактах жома плодов и гребней винограда с помощью химических и физико-химических методов анализа с целью выявления ведущей группы биологически активных веществ для каждого вида экстракта.
Обосновать основные показатели, характеризующие качественный состав и количественное содержание фармакологически значимых полифенольных соединений в сухих экстрактах гребней и жома плодов винограда.
Провести анализ количественного содержания полифенольных соединений в некоторых БАД на основе экстрактов винограда отечественного и зарубежного производства с помощью разработанных нами методик.
Научная новизна
Впервые изучен полифенольный состав водно-спиртовых экстрактов из жома плодов сортовой смеси Винограда культурного (Ркацители и Молдова), произрастающего на территории РФ. Показано, что изучаемые экстракты обладают выраженной антиоксидантной активностью.
Проведён скрининговый химический и физико-химический анализ поли-фенольных соединений в промышленных образцах сухого экстракта гребней винограда и в изучаемых образцах экстрактов жома плодов винограда, по результатам которого выявлены ведущие группы биологически активных веществ для последующей стандартизации этих экстрактов. Показано наличие взаимосвязи между биологической активностью и содержанием определённых групп полифенольных соединений в различных экстрактах винограда.
На основании проведённых исследований разработан комплексный подход к стандартизации ЛП и БАД на основе различных экстрактов винограда и виноградного вина по показателям «подлинность» и «количественное определение».
Разработаны высокоспецифичные методики качественного анализа проан-тоцианидинов, позволяющие идентифицировать эти соединения в различных экстрактах винограда и виноградного вина, а также ЛП и БАД на их основе.
Разработаны методики количественного анализа проантоцианидинов и суммы полифенольных соединений в различных экстрактах винограда и виноградного вина, а также ЛП и БАД на их основе, обеспечивающие повышение требований к контролю их качества.
Положения, выносимые на защиту
На защиту выносятся результаты по изучению полифенольного состава и биологической активности экстрактов из сортовой смеси жома плодов винограда (Ркацители и Молдова), а также промышленных образцов экстракта гребней винограда; результаты исследований по разработке и обоснованию применения комплексного подхода к качественному и количественному анализу биологически значимых полифенольных соединений винограда в различных экстрактах, ЛП и БАД.
9 Практическая значимость работы и внедрение в практику
На основе результатов проведённого исследования, при перерегистрации БАД «Корда-Парафарм» внесены изменения в разделы «подлинность» и «количественное определение» биологически активных соединений ТУ 9176-050-46865780-04, регламентирующих её качество.
Результаты исследований легли в основу разработки разделов «подлинность» и «количественное определение» биологически активных соединений нормативной документации (ТУ 9176-051-46865780-04) для БАД «Экстракт красного вина — Парафарм».
Методики количественного анализа полифенольных соединений винограда апробированы в ОАО «Красногорсклексредства».
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы доложены на: XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, апрель 2004 г.); II научной конференции «Биотехнология — охране окружающей среды». Школа для специалистов: «Биокорректоры — нелекарственные оздоровительные продукты. Фундаментальные и прикладные аспекты» (г. Москва, 25-26 мая 2004 г., МГУ им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет); Конгрессе детских кардиологов (26 мая 2004 г); Научно-практическом семинаре «Новые технологии биологической медицины (фундаментальные и клинические аспекты проблемы)» (г. Москва, 11 июня РАСХ).
Химический анализ полифенолов винограда
В классификационной цепочке флавоноидов, основанной на степени окисления пиранового кольца, катехины занимают исходное положение, являясь наиболее восстановленной формой флавоноидов [32]. Катехины чрезвычайно легко окисляются. Под действием солнечных лучей, в щелочной среде или при слабом нагревании они превращаются в окрашенные соединения - конденсированные хинонные формы. В молекуле катехина имеются два ассиметрических атома углерода: С2 и Сз- В соответствии с этим для каждого катехина возможны 4 изомера и два рацемата: (-)-катехин, (+)- катехин, (-)-эпикатехин, (+)-эпикатехин и (±)-катехин, (+)-эпикатехин. Оптические свойства и качественные реакции катехинов Катехины дают качественные реакции, свойственные фенольным соединениям. Их водные и водно-спиртовые растворы показывают максимум поглощения в УФ области спектра при 270-280 нм, что объясняется наличием в составе молекулы хроманового ядра [31]: Качественные реакции катехинов основаны, главным образом, на присутствии в их молекулах фенольных гидроксилов мета-, орто- или рядового расположения. Примеры таких реакций приведены ниже: с бромной водой, при кипячении выпадает осадок с насыщенным раствором ванадата аммония — оливковое окрашивание растворов с солями свинца (РЬ +), ртути Hg2+,cepe6pa Ag+ выпадают окрашенные осадки с 1% растворами KCN, NaCN появляется оранжево-желтое окрашивание при окислении персульфатом калия в присутствии конц. H2SO4 появляется красно-фиолетовое окрашивание соответствующего ан-тоцианидина в конц. растворе аммония хлорида с молибдатом аммония образуется желтый осадок с железа хлоридом или железоаммониевыми квасцами катехины с о-гидроксильной (пирокатехиновой) группировкой дают зелёное окрашивание с ванилином в присутствии конц. HCL образуется розовое окрашивание с сульфаниловой кислотой катехины вступают в реакцию диазотирования Наибольший интерес из вышеописанных реакций представляет реакция с ванилином. Это высокочувствительная реакция, в которую помимо катехинов вступают также флороглюцин, резорцин, тимол, эвгенол, оксигидрохи-нон, пирогаллол, а также флаванолы и дигидрохалконы, имеющие одинарную связь в 2,3-положении и свободный мета-ориентированный гидроксил в кольце В [144; 145]. Однако, интенсивность образующейся окраски различна для разных соединений - максимальна для флороглюцина (красная) и минимальна для гидрохинона (слабо розовая). Максимум поглощения для этой реакции с катехином составляет 490-508 нм. Необходимо отметить, что флавонолы, флавоны, флавононы и флавано-нолы не вступают в данную реакцию, несмотря на наличие флорглюциновых фрагментов в их молекулах, т.к. наличие карбонильной группы у С4 препятствует образованию окрашенных комплексов. Методы количественного определения катехинов Метод Левиталя Метод Левиталя представляет собой перменганатометрическое титрование в кислой среде в присутствии индигосульфокислоты [22]. Данный метод имеет весьма существенные недостатки: помимо катехинов определяются также и другие фенольные соединения, а конденсированные продукты окисляются перманганатом. Спектрофотометрическое определение катехинов по реакции с ванилиновым реактивом Высокая чувствительность и хорошая воспроизводимость реакции катехинов с ванилиновым реактивом позволяет использовать эту реакцию для спектрофотометрического определения катехинов в видимой области спектра при 490-508 нм [32]. Бумажная хроматография с последующим спектрофотометрическим определением окрашенных продуктов.
Изучение биологической активности экстрактов жома плодов и гребней винограда с помощью ферментных биотест-систем
Для определения потенциальной адаптогенной, антиоксидантнои, антимикробной и иммуномодулирующей активности исследуемых сухих экстрактов жома плодов и гребней винограда применяли глутатионредуктазную, каталазную и НАДФН-оксидазную ферментные биотест-системы in vitro, разработанные в ВИЛАР и запатентованные в РФ (патенты № 2181890, № 218191, № 218192 приоритет от 06.06.2001) [59, 60, 61,62].
Глутатионредуктаза и каталаза - коммерческие препараты высокой степени очистки. Источником НАДФН-оксидазы служили перитонеальные макрофаги крыс.
Результаты изучения влияния сухих экстрактов жома плодов и гребней винограда на скорость глутатионредуктазной (ГР) и каталазной (КАТ) реакций in vitro представлены в таблице 7.
Из таблицы 7 видно, что экстракты жома плодов винограда, полученные экстракцией 20 %, 40% и 60% спиртом, а также сухой экстракт гребней винограда повышают скорости глутатионредуктазной и каталазной реакций, что свидетельствует о наличии антиоксидантнои активности изучаемых экстрактов. При этом максимальными антиоксидантными свойствами обладают экстракт жома плодов винограда, полученный 60% этанолом.
В таблице 8 представлены результаты тестирования сухого экстракта жома плодов винограда, полученного экстракцией 60% этанолом, с помощью НАДФН-оксидазной биотест-системы in vitro, позволяющей выявлять вещества с иммуномодулирующими свойствами. Ранее было установлено, что иммуномодуляторы активируют НАДФН-оксидазу in vitro.
Из табл. 8 видно, что экстракт жома плодов винограда, полученный экстракцией 60% этанолом, при добавлении к гомогенатам «спокойных» макрофагов крыс немного, но достоверно активируют НАДФН-оксидазу. Активирующий эффект зависит от концентрации, для изучаемого сухого экстракта винограда установлена прямая зависимость активирующего эффекта от концентрации.
Таким образом, на основании проведённых исследований с помощью ферментных биотест-систем, было показано, что полученные экстракты обладают выраженной антиоксидантной активностью, что позволяет использовать жом плодов винограда в качестве сырьевого источника. При этом оптимальным экстрагентом, является 60% этанол, т.к. применение именно этой концентрации придаёт экстрактам максимальную антиоксидантную активность.
Спектрофотометрический анализ экстрактов жома плодов и гребней винограда в УФ-области спектра
Спектрофотометрия широко применяется для идентификации соединений, исследования состава, строения и количественного анализа индивидуальных веществ и многокомпонентных систем.
Спектрофотометрический анализ в УФ-области спектра путём непосредственного измерения оптической плотности может применяться в анализе полифенольных соединений, т.к. они являются ароматическими соединениями и имеют сопряжённые кратные связи.
Отдельные группы фенольных соединений заметно отличаются по своим спектральным характеристикам в УФ-свете. Для простых фенолов характерно наличие максимумы поглощения в области 265-285 нм [32,33], для флавонов — 325-350 нм (1-я полоса поглощения) и 240-270 нм (2-я полоса поглощения), для флавонолов помимо поглощения при 350-390 нм и 240-270 нм характерен дополнительный максимум при 300 нм [11, 40]. Оксикоричные кислоты имеют два максимума поглощения: при 310-325 нм и 230-240 нм [10].
Спектрофотометрическое исследование сухого экстракта жома плодов винограда, полученного 60% этанолом и сухого экстракта гребней винограда в УФ-области спектра проводилось с использованием водно-спиртовых растворов в 60% этаноле. ОД г сухого экстракта помещали в мерную колбу объёмом 50 мл, прибавляли по 35 мл 60 % этилового спирта, перемешивали, доводили тем же растворителем до метки (раствор А). 1 мл раствора А помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл доводили 60% этанолом до метки и перемешивали.
Спектр поглощения полученного раствора снимали в диапазоне длин волн 210-400 нм на саморегистрирующем спектрофотометре ГЕЛИОС (USA) в кювете с толщиной слоя жидкости 10 мм.
Параллельно снимались УФ-спектры растворов РСО рутина, кверцетина, кофейной, галловой, хлорогеновой кислот, катехина в 60 % этиловом спирте. Для приготовления рабочих стандартных образцов 0,05 г (точные массы) РСО рутина, кверцетина, кофейной, галловой, хлорогеновой кислот, катехина помещали в мерные колбы объемом 100 мл, прибавляли по 50 мл 60 % спирта этилового, перемешивали до растворения веществ сравнения и доводили до метки тем же растворителем. 1 мл полученного раствора помещали в мерную колбу объёмом 100 мл, прибавляли 50 мл 60 % этилового спирта, перемешивали и доводили тем же растворителем до метки. Результаты проведенных исследований приведены на рисунках 4-13 и в таблице 10.
Согласно полученным данным, приведенным в таблице и на рисунках, можно сделать следующие выводы: спектры поглощения водно-спиртовых растворов сухих экстрактов жома плодов винограда и гребней винограда в 60% этаноле не идентичны; спектры поглощения растворов образцов № 1 и 2 (экстракты жома плодов винограда) в 60% этаноле имеют общий максимум поглощения при длине волны 279,5 нм; спектр поглощения образца № 3 (экстракт гребней винограда) в 60% этаноле имеет максимум поглощения при длине волны 271,5 нм.
Анализируя спектры поглощения исследуемых водно-спиртовых растворов сухих экстрактов винограда и растворов РСО флавоноидов и феноловых кислот можно сделать вывод о том, что в спектрах поглощения анализируемых экстрактов нет максимума поглощения в интервале длин волн 300-370 нм, характерного для спектров поглощения флавоноидов: рутина, кверцетина и др.
В спектрах поглощения растворов сухих экстрактов винограда присутствуют максимумы поглощения в интервале длин волн 270-290 нм, что характерно для катехинов, коричной и галловой кислот.
Количественный анализ полифенолов в анализируемых экстрактах
Существуют различные методы оценки количественного содержания полифенольных соединений в экстрактах винограда, однако до сих пор нет единого метода, с помощью которого можно было бы наиболее адекватно оценить содержание этих соединений. Наиболее важными из методов являются: Кислотный гидролиз проантоцианидинов с последующим фотометрическим определением образующихся антоцианов. Определение суммы полифенольных соединений с помощью реактива Фолина-Чикальтео с последующим фотометрическим определением окрашенных в синий цвет продуктов реакции. Реакция с альдегидом (ванилином) с последующим фотометрическим окрашенных продуктов реакции. Обращенно-фазовый вариант ВЭЖХ-анализа проантоцианидинов (см. п. 3.3). Для оценки качества экстрактов из семян винограда по содержанию проантоцианидинов в США создан специальный комитет — Grape Seed Method Evaluation Committee. Согласно экспертной оценке Комитета всемирно признанным методом анализа полифенольных соединений винограда является метод Фолина-Чикальтео, позволяющий определять суммарное количество всех полифенольных соединений в анализируемых экстрактах. Однако этот метод не является специфичным, он не позволяет характеризовать экстракты по отдельным группам полифенольных соединений. Обращённо-фазовый вариант ВЭЖХ рекомендуется Комитетом для количественного анализа мономерных соединений в экстрактах винограда.
Самым главным ограничением для данного метода является отсутствие коммерчески доступных стандартов проантоцианидинов за исключением галловой кислоты, катехина, эпикатехина и их галлатов. Недостатком метода определения проантоцианидинов по реакции с ванилином является нестабильность образующихся окрашенных комплексов [105]. Реакция гидролиза проантоцианидинов, описанная в п. 4.1, согласно литературным данным может использоваться для количественного анализа этих соединений в анализируемых экстрактах, однако она также не лишена недостатков. Недостатком данного метода является зависимость количества образующегося цианидина от степени полимеризации определяемого проантоцианидина, т.е. если экстракт винограда содержит, главным образом, полимерные проантоцианидины, то количество определяемого цианидина в нём будет выше, чем в экстракте, содержащем низкомолекулярные проантоцианидины.
Однако этот метод привлекателен своей высокой специфичностью, поэтому он был выбран нами для количественного анализа проантоцианидинов в анализируемых экстрактах. С целью увеличения количественного выхода антоцианов подобраны специальные условия анализа [125]: соотношение растворителей — бутанол: соляная кислота (конц.) / 95:5 добавление в реакционную смесь точного объёма катализатора — 200 мкл 2 % раствора NH4Fe(S04)2 12 Н20 в 2 н HCL нагревание реакционной смеси на водяной бане в течение 45 мин с последующим охлаждением на ледяной бане в течение 5 мин Так как с фармакологической точки зрения проантоцианидины являются наиболее значимыми соединениями для профилактики и лечения сердечнососудистых заболеваний, было решено определить их содержание во всех полученных нами экстрактах жома плодов винограда, а также в экстрактах гребней винограда.
При анализе экстрактов были подобраны условия, согласно следующей методике. Методика. Точную навеску (около 0,0500 г) сухого экстракта помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 50 мл 60% этанола, перемешивали до полного растворения экстракта, доводили объём колбы тем же растворителем до метки (раствор А, бледно розовый). 1 мл полученного раствора переносили в пробирку для гидролиза, добавляли 6 мл смеси: бутанол: соляная кислота (конц.) / 95:5 и 200 мкл 2 % раствора NH4Fe(S04)2 12 НгО в 2 н HCL, закрывали притёртой пробкой (р-р Б). Нагревали пробирку 45 мин на кипящей водяной бане, после чего охлаждали её до комнатной температуры на ледяной бане в течение 5 мин. Анализируемый раствор имел насыщенное малиновое окрашивание. Затем снимали оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 550 нм [105, 125] относительно раствора сравнения (готовят аналогично вышеописанному только без стадии нагревания). Для расчёта содержания суммы проантоцианидинов использовали теоретическое значение удельного показателя поглощения антоциана -цианидина Е1%/1см=470 [105, 125] при аналитической длине волны 550 нм, что позволило не использовать в методике стандартный образец цианидина. Расчёт содержания количественного содержания суммы проантоцианидинов проводили по формуле
