Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Современные методы анализа соединений с пептидной структур ой 13
1.1.1. Спектроскопические методы анализа 13
1.1.2. Хроматографические методы анализа 17
1.2. Химические, физические и физико-химические свойства ноопепта 20
1.3. Стандартные образцы в анализе лекарственных средств 25
1.3.1. Национальные требования к стандартным образцам 25
1.3.2. Стандарты сравнения в Фармакопее США 33
Выводы из обзора литературы 36
Глава 2. Объекты и методы исследования 37
Глава 3. Анализ и стандартизация ноопепта для разработки ГСО 39
3.1. Получение исходного материала для создания ГСО ноопепта 39
3.2. Контроль качества стандартных образцов (СО) субстанции ноопепта 41
3.2.1. Результаты определения фармакопейных показателей качества 41
3.2.2. Спектральные характеристики СО ноопепта 44
3.2.2.1. Спектроскопия в инфракрасной области 44
3.2.2.2. ЯМР'Н-спектроскопия 46
3.2.2.3. УФ-спектроскопия 51
3.2.2.4. Масс-спектроскопия 54
3.3. Хроматографический анализ СО ноопепта методом ВЭЖХ 56
3.3.1. Определение посторонних примесей в субстанции СО
ноопепта 56
3.3.1.1. Определение калибровочных коэффициентов 63
3.3.1.2. Проверка пригодности хроматографической системы 67
3.3.1.3. Методика определение содержания посторонних примесей в СО ноопепта 69
3.4. Результаты анализа СО ноопепта по всем показателям и
разработанным методикам 71
3.5. Изучение стабильности субстанции ГСО ноопепта и
установление сроков годности 73
3.5.1. Изучение гигроскопичности субстанции СО ноопепта 73
3.5.2. Изучение стабильности субстанции СО ноопепта при
хранении 74
3.6. Установление норм качества СО ноопепта 77
ВЫВОДЫ 79
ГЛАВА 4. Анализ и стандартизация субстанции ноопепта для создания инъекционных лекарственных форм 80
4.1. Физико-химические свойства и спектральные характеристики субстанции ноопепта для инъекций 80
4.1.1. Спектроскопия в инфракрасной области 83
4.1.2. УФ-спектроскопия 85
4.1.3. ЯМР-спектроскопия...: 87
4.2. Определение посторонних примесей в субстанции ноопепта для инъекционных лекарственных форм методом ВЭЖХ 88
4.3. Количественное определение субстанции ноопепта для инъекционных лекарственных форм 92
4.3.1. Метод спектрофотометрии в количественном анализе ноопепта 93
4.3.1.1. Определение количественного содержания ноопепта в субстанции с использованием стандартного образца 96
4.3.1.2. Количественное определение ноопепта с использованием удельного показателя поглощения 99
4.4. Количественное определение субстанции ноопепта для инъекций методом ВЭЖХ 102
4.4.1. Определение количественного содержания ноопепта в субстанции с использованием стандартного образца 106
4.5. Результаты анализа субстанции ноопепта для инъекций по всем показателям 109
4.6. Устойчивость субстанции ноопепта для инъекционных лекарственных форм при хранении и под воздействием внешних факторов 111
4.6.1. Устойчивость субстанции в условиях повышенной влажности 111
4.6.2. Изучение влияния на субстанцию ноопепта солнечного света 112
4.6.3. Воздействие на субстанцию ноопепта окислителей 112
4.7. Установление срока хранения субстанции ноопепта для создания инъекционной лекарственной формы методом «ускоренного старения» и в естественных условиях 116
4.8. Установление норм качества субстанции ноопепта для производства инъекционной лекарственной формы 121
ВЫВОДЫ 123
ГЛАВА 5. Анализ и стандартизация ноопепта лиофилизированного для инъекций 125
5.1. Изучение физико-химических свойств и разработка методик анализа лиофилизированной ЛФ ноопепта 127
5.1.1. Внешний вид, прозрачность, цветность, рН растворов 127
5.1.2. Средняя масса и однородность по массе 127
5.1.3. Потеря в массе при высушивании лиофилизированной ЛФ ноопепта 128
5.1.4. Определение содержания посторонних примесей в лиофилизированной ЛФ ноопепта 129
5.1.5. Количественное определение лиофилизированной ЛФ ноопепта 134
5.1.6. Определение показателя «Однородность дозирования» лиофилизированной ЛФ ноопепта 136
5.2. Результаты анализа лиофилизированной ЛФ ноопепта по всем показателям 138
5.3. Изучение стабильности и установление сроков годности ноопепта лиофилизированного для инъекций.: 140
5.4. Установление норм качества ноопепта лиофилизированного для инъекций 144
Выводы 146
Общие выводы 147
Список литературы
- Хроматографические методы анализа
- Спектральные характеристики СО ноопепта
- Определение посторонних примесей в субстанции ноопепта для инъекционных лекарственных форм методом ВЭЖХ
- Потеря в массе при высушивании лиофилизированной ЛФ ноопепта
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ
Инсульт - острое нарушение мозгового кровообращения (ОНМК) с развитием стойких симптомов поражения центральной нервной системы, характер которых зависит от локализации повреждённой зоны мозга. Инсульт является второй по частоте причиной смерти на земле, ежегодно в индустриально развитых странах одна из десяти смертей связана с ОНМК.
Возникающая на фоне инсульта недостаточность когнитивных функций (внимание, память, пространственная ориентация) протекает на фоне выраженных структурных изменений мозговой ткани. Для лечения возникающих нарушений целесообразно применение препаратов, сочетающих ноотропную активность с нейропротективной. Однако применяемые в настоящее время для лечения когнитивного дефицита ноотропные препараты, имеют ряд ограничений и недостатков. Родоначальник класса ноотропов, пирацетам, в значительном числе случаев недостаточно эффективен, а большинство нейропротективных препаратов, применяемых в настоящее время (антиоксиданты, антагонисты кальциевых каналов), не обладают прямым положительным влиянием на мнестические функции. Кроме того, вводимые церебральные вазодилататоры, вызывающие «обкрадывание» мозговой ткани за счет выраженных изменений общей гемодинамики, могут даже приводить к ухудшению когнитивной активности, особенно у пожилых людей.
В НИИ Фармакологии им. В.В. Закусова РАМН была выдвинута гипотеза о пептидергическом механизме действия пирацетама [17], что послужило основой для создания серии его дипептидных аналогов [80]. Среди синтезированных дипептидов наибольшей активностью обладал этиловый эфир ТЧ-фенилацетил-Ь-пролилглицина (НООПЕПТ). У препарата было выявлено наличие ноотропного [41, 112, 113], нейропротективного [24, 34, 41, 112], а также антитромботического [42] и противовоспалительного [30] эффектов. Фармакокинетическое изучение выявило высокую специфическую биодоступность для тканей мозга [78, 79], а исследование фармакодинамики - вовлечение специфических механизмов действия [33, 42, 112,114, 125].
Инсульт относится к остро развивающимся патологическим состояниям, поэтому для быстрого достижения фармакологического эффекта наиболее эффективным оказывается применение парентеральных лекарственных форм. Кроме того, у ряда больных, в силу их состояния, применение пероральных форм препарата [60] невозможно.
Основываясь на изучении физико-химических свойств ноопепта, при подборе оптимального состава вспомогательных веществ и технологии производства в опытно-технологическом отделе НИИ Фармакологии была разработана инъекционная лекарственная форма ноопепта в виде лиофилизированного порошка [21, 23, 24].
В ходе проведенного фармакологического изучения лиофилизированного порошка ноопепта для инъекций в условиях моделирования локального ишемического повреждения и на модели геморрагического инсульта была показана способность лекарственной формы эффективно снижать расстройства ЦНС. Также было установлено положительное влияние инъекционной формы на обучение и память [58].
Выявленное сочетание у лиофилизированной инъекционной формы ноопепта нейропротективного действия с положительным мнемотропным эффектом, позволяет рассматривать препарат в качестве нейропротектора для лечения инсультов [58].
Исходя из сказанного выше, изучение физико-химических свойств, разработка методик анализа и установление норм качества инъекционной лекарственной формы ноопепта является весьма актуальным.
Цель исследования
Целью настоящей работы являлось изучение химических, физических и физико-химических свойств, разработка методик фармацевтического анализа, установление норм качества и стандартизация инъекционной лекарственной формы ноопепта в виде лиофилизированного порошка.
Задачи исследования
1. Изучить физические, химические и физико-химические свойства субстанции ноопепта, используемой в производстве инъекционной лекарственной формы (субстанция для инъекций), изучить стабильность и установить нормы качества.
2. Изучить физические, химические и физико-химические свойства, изучить стабильность и установить нормы качества ноопепта лиофилизированного для инъекций.
3. Разработать методики анализа субстанции для инъекций и ноопепта лиофилизированного для инъекций с использованием современных физико-химических методов: хроматографических и спектрофотометрических.
4. Для получения точных и воспроизводимых результатов при применении физико-химических методов в контроле качества субстанции для инъекций и лекарственной формы оценить возможность разработки и применения Государственного стандартного образца (ГСО) ноопепта.
5. Изучить химические, физические и физико-химические свойства серийных образцов субстанции ноопепта, разработать методики анализа, изучить стабильность и установить нормы качества для разработки первичной фармакопейной статьи (ФС) на ГСО ноопепта.
6. Разработать нормативные документы: проекты фармакопейных статей предприятия (ФСП) на субстанцию ноопепта для инъекций и ноопепт лиофилизированный для инъекций.
Научная новизна
Впервые был проведен полный фармацевтический анализ инъекционной лекарственной формы ноотропного препарата пептидной структуры ноопепта по всем показателям, предусмотренным для контроля качества стерильных сухих лекарственных форм.
В рамках работы по созданию инъекционной лекарственной формы был предложен аналитический контроль субстанции ноопепта, используемой в процессе производства для получения лекарственной формы надлежащего качества.
Изучено хроматографическое поведение ноопепта и его возможных примесей методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Подобраны условия, позволяющие добиться оптимального разделения ноопепта и возможных примесей, проводить их идентификацию, количественную оценку, а также идентифицировать и количественно оценивать содержание активного вещества.
Были изучены физико-химические свойства, определена стабильность и установлены нормы качества субстанции ноопепта с целью создания ГСО ноопепта, необходимого для анализа субстанции и лекарственных форм с применением физико-химических методов. В частности, впервые в оценке подлинности серийных образцов ноопепта был применен метод масс-спектрометрии.
Проведено сравнительное исследование ЯМР -спектров ноопепта, снятых в ДМСО-сІб и дейтерированном хлороформе для выбора оптимального растворителя в анализе подлинности ГСО, в результате которого было предложено использовать спектр, снятый в ДМСО-а!6, как более простой. Была изучена зависимость соотношения транс- и цис- конформеров растворов ноопепта в ДМСО-сІб от температуры и показано, что соотношение транс- и цис- конформеров ноопепта при изменении температуры исследуемых растворов практически не изменяется.
Изучено влияние различных стрессовых условий на стабильность субстанции ноопепта для инъекций (повышенная влажность, солнечный свет, действие окислителей). Показано, что субстанция устойчива к действию первых двух факторов, а при действии окислителей подвиргается как гидролизу, так и окислению.
Изучена стабильность субстанции и лекарственной формы ноопепта при хранении методом ускоренного старения и при хранении в естественных условиях. На основании полученных результатов были рекомендованы сроки годности для субстанции и лекарственной формы.
Практическая значимость На основании проведенных исследований были впервые разработаны:
- методики анализа субстанции ГСО ноопепта, установлены показатели и нормы качества. Подготовлен проект ФС(т) на ГСО субстанции ноопепта;
- методики и нормы качества субстанции для производства ноопепта лиофилизированного для инъекций. Подготовлен проект ФСП на субстанцию ноопепта для инъекций;
- проведено изучение физико-химических свойств ноопепта лиофилизированного для инъекций, разработаны методики анализа и определены нормы качества. Разработан проект ФСП на лекарственную форму.
Разработанные методики анализа внедрены в опытно-технологическом отделе ГУ НИИ Фармакологии им. В.В. Закусова РАМН для контроля субстанции и лекарственной формы ноопепта.
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы были представлены на XIII Российском Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, апрель 2006); на IV Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, март 2006).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы. Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук
Диссертационная работа выполнена в соответствии с научным планом ГУ НИИ фармакологии РАМН им. В.В. Закусова в рамках исследований, направленных на поиск и изучение новых фармакологически активных веществ, способных воздействовать на нормальные и патологически измененные функции нервной системы. Базой проведения исследований являлась аналитическая группа опытно-технологического отдела ГУ НИИ фармакологии РАМН.
Основные положения, выносимые на защиту:
- Результаты исследования по установлению норм качества для Государственного стандартного образца субстанции ноопепта.
Результаты исследований по разработке методик анализа для контроля качества субстанции ноопепта для производства ноопепта лиофилизированного для инъекций. Результаты исследований по влиянию различных факторов на качество субстанции.
- Результаты исследования ноопепта лиофилизированного для инъекций, а именно: результаты изучения физико-химических свойств лекарственной формы и исследований по разработке методик ее анализа.
- Полученные результаты экспериментальных исследований по оценке качества субстанции и лекарственной формы с применением стандартного образца ноопепта.
- Результаты по изучению стабильности при различных режимах хранения для субстанции и лекарственной формы.
Хроматографические методы анализа
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Для разделения аминокислот и пептидов используют в основном обращенно фазовый вариант ВЭЖХ [68, 71, 84, 87, 89-91, 100, 102, 105, 109, 111, 118 120, 128] с применением следующих типов детекторов: ультрафиолетовые, флуориметрические, электрохимические, масс-спектрометрические [99, 101, 117, 124, 126]. Оптимизировать процесс разделения пептидных соединений и подобрать оптимальные условия хроматографирования, можно изменяя параметры хроматографической системы (химия поверхности неподвижной фазы, рН подвижной фазы, температура, тип элюированйя, способ детектирования, добавление ион-парных реагентов и т.д.) [1, 55, 66, 77, 81, 82, 88, 90, 96, 97, 100, 105, ПО, 118, 121, 127]. Например, установлено, что удерживание и селективность разделения пептидов на ODS-фазе при применении ион-парных липофильных реагентов возрастает при переходе от трифторуксусной к перфтордекановой кислоте [120, 130]. Кроме того, установлено, что увеличение рН фонового электролита с 2,5 до 3,5 способствует изменению порядка движения дипептидов, содержащих одну аминокислоту при разделении на циклодекстриновых фазах [94]. А при разделении дипептидов, содержащих кислые, основные и нейтральные аминокислоты (серии, пролин, треонин) наиболее эффективно применение ион-парной хроматографии с применением в качестве ион-парных реагентов алифатических карбоновых кислот [83-85, 100, 104, 123]. В работе [72] описано применение метода ВЭЖХ в комбинации с масс-спектрометрией с электрораспылением для анализа пептидов, содержащих пролин на С-конце, полученных методом твердофазного синтеза. Применение обращено-фазового варианта ВЭЖХ для анализа продуктов разложения опиоидного гептапептида дерморфина было изучено в работе [119].
Газожидкостная хроматография (ГЖХ). Достоинства метода ГЖХ, к которым можно отнести высокую чувствительность, высокую скорость анализа, возможность использовать различные типы детекторов (пламенно-ионизационный, азотный или фосфорный детектор, детектор захвата электронов и масс-спектрометр), а также возможность изменять сорбционные характеристики колонки за счет подбора неподвижных фаз, определяют его высокую распространенность среди инструментальных методов, применяющихся в фармацевтических исследованиях [12, 19, 29, 31, 32,38,45,52,53,57].
Анализ пептидных соединений с применением газовой хроматографии нельзя отнести к рутинным методам инструментального анализа, что объясняется наличием в структуре различных функциональных групп (карбоксильная, сульфгидрильная, имидазольная, гуанидиновая, индольная, амино-, имино- и оксигруппа), которые затрудняют разработку универсальной методики [73, 92]. Высокая полярность и низкая летучесть пептидов требует их перевода в более летучие производные для проведения газохроматографического исследования [131], например, в метиловые эфиры N-гептафторбутилпептидов [69, 98, 134], N-трифторацетилпроизводные [74, 131-133] или бутиловые [103] эфиры. Например, в работе [116] синтетические дипептиды, содержащие смеси энантиомеров и диастереомеров переводились в эфиры N-перфторацетила при комнатной температуре (перфторацетил: трифторацетил, пентафторацетил; эфиры: метиловый, 1-пропиловый, 2-пропиловый, 2,2,2-трифторэтиловый) и анализировались на хиральных стационарных фазах Chirasil-L-Val и Lipodex-E с использованием гелия в качестве газа-носителя.
В настоящее время методом ГЖХ анализируют только ди-, три-, тетра-, и пентапептиды. Разделение пептидов проводят на колонках (преимущественно стеклянных), заполненных неполярными неподвижными фазами (1-5% SE-30, SE-52, OV-1, OV-17, OV-101) [95, 132]. Для определения первичной структуры пептидов описана методика, основанная на разделении триметилсилильных производных дипептидов на кварцевой капиллярной колонке, покрытой фазой SP-2100. При расщеплении пептидов дипептидиламинопептидазой образующие аминокислоты могут быть идентифицированы с применением масс-спектрометра [75].
Спектральные характеристики СО ноопепта
Целью исследования являлось изучение возможности применения ИК-спектроскопии при анализе подлинности и для подтверждения структуры ноопепта, а также получение стандартного ИК-спектра СО ноопепта для включения в проект ФСП. Чистота исследуемых образцов контролировалась с помощью метода ВЭЖХ. Подготовку проб осуществляли методом прессования анализируемого вещества с инертными наполнителями (бромидом калия).
ИК-спектр (КВг, см") всех образцов субстанции имеет характеристичекие полосы поглощения (см"1): 1753 (карбонил эфирной группы, -СООС2Н5 ), 1694 (карбонил пептидной группы, -CONH), 1635 (карбонил N-ацильной группы, N-CO-), 1558 - 1635 и 1442 - 1500 (С=С замещенного бензола) и 621 - 882 (пара-замещение в бензольном кольце). ИК-спектр СО ноопепта представлен на рисунке 3.2.
На основании проведенных исследований было сделано заключение о возможности использования метода ИК-спектроскопии для идентификации СО ноопепта. Полосы поглощения в ИК-спектре СО ноопепта в области от 4000 до 400 см"1 по положению и относительным интенсивностям должны совпадать с полосами поглощения на прилагаемом рисунке спектра ноопепта.
В процессе исследований спектральных характеристик СО ноопепта были сняты ЯМР1!! спектры всех образцов СО ноопепта. В качестве растворителей для пробоподготовки при получении ЯМР Н спектров ноопепта использовали диметилсульфоксид-с16 (ДМСО-сіб) и дейтерированный хлороформ (CDCb). Концентрация растворов составляла 2%. Эталоном измерений химических сдвигов служил тетраметилсилан (ТМС) 8 0,00 м.д. Отнесение сигналов ЯМР[Н определенным структурным фрагментам молекулы ноопепта проводили на основании спектральных характеристик - химических сдвигов (5 м.д.), мультиплетности, констант спин-спинового взаимодействия (J, Гц) и интегральных площадей сигналов резонанса. ЯМР Н спектр ноопепта в дейтерированном диметилсульфоксиде представлен на рисунке 3.3., ЯМР1!! спектр ноопепта в дейтерированном хлороформе представлен на рисунке 3.5.
Химические сдвиги протонов во всех образцах ноопепта были одинаковы.
В диметилсульфоксиде-dg наблюдался двойной набор сигналов, как следствие вращения вокруг амидной связи между фрагментом фенилацетилпролина и этиловым эфиром глицина, из них характерными являются следующие (м.д.): 1,17 (ЗН, т., СН3СН2О-); 1,70 - 2,25 (4Н, м., 3-СН2; 4-СН2Рго); 3,35 - 3,50 (2Н, м., 5-СН2Рго); 3,66 (2Н, с, СН2С6Н5); 3,79 (2Н, д., CH2Gly); 4,08 (2Н, кв., СН3СН20); 4,31 (Ш, д.д., 2НРго); 7,14 - 7,35 (5Н, м., СН2СбН5); 8,29 (1Н, т., NHGly) для транс-конформера.
Отдельно выделялись сигналы цис-конформера (м.д.): 1,16 (ЗН, т., СН3СН20-); 1,70 - 2,25 (4Н, м., 3-СН2; 4-СН2 Pro); 3,62 (2Н, с, СН2С6Н5); 3,85 (2H, д., CH2Gly); 4,10 (2Н, кв., СН3СН20-); 4,17 (1Н, д.д., 2НРго); 8,63 (1Н, т. NHGly).
Интегрированием интенсивности сигналов протонов NH-группы глицина в транс- цис- конформерах их соотношение оценено как 60:40.
Кроме того, была изучена зависимость соотношения транс- и цис-конформеров ноопепта в растворах в ДМСО- 16 от температуры. Были сняты спектры при температурах 20, 30, 40 и 50 С и вычислено соотношение конформеров в каждом случае. Результаты представлены в таблице 3.4. и на рисунке 3.4.
Определение посторонних примесей в субстанции ноопепта для инъекционных лекарственных форм методом ВЭЖХ
В субстанции ноопепта для создания инъекционной лекарственной формы могут содержаться те же примеси, что и в субстанции стандартного образца ноопепта: фенилуксусная кислота (ФУК), N-фенилацетил-Ь-пролин (ФАП) и N-фенилацетил-Ь-пролинглицин (ФАПГ).
Определение посторонних примесей в субстанции ноопепта для инъекций проводили при условиях, подобранных ранее для анализа стандартного образца ноопепта.
Исследования проводили на колонке Ultra Cis 5 мкм, 250 мм х 4,6 мм с предколонкой Ultra Cis 5 мкм, 30 мм X 4,6 мм; температура колонки -комнатная; подвижная фаза - ацетонитрил-вода-ледяная уксусная кислота (500:500:1); скорость потока подвижной фазы — 0,5 мл/мин; длина волны детектирования - 205 нм; масштаб регистрации - 60 inV; объем пробы - 20 мкл. Рабочая концентрация раствора ноопепта 0,4 мг/мл.
Проверку пригодности хроматографической системы проводили также, как и в случае анализа стандартного образца ноопепта.
Содержание каждой индивидуальной примеси в субстанции ноопепта для инъекций было предложено определять методом внешнего стандарта с использованием стандартного образца ноопепта.
В результате проведенных исследований была разработана следующая методика: около 0,01 г (точная навеска) препарата помещают в мерную колбу на 25 мл, растворяют в достаточном объеме подвижной фазы и доводят объем раствора подвижной фазой до метки. Колонку уравновешивают подвижной фазой до достижения стабильной базовой линии. Вводят и анализируют раздельно испытуемый раствор и раствор для проверки пригодности хроматографической системы (не менее 5 вколов). Регистрируют хроматограммы.
Количественную оценку содержания посторонних примесей в субстанции ноопепта проводили с использованием внешнего стандарта. В качестве внешнего стандарта использовались образцы субстанции для разработки ГСО ноопепта. Готовили раствор СО ноопепта, растворяя точную навеску (0,01 г) в мерной колбе вместимостью 25 мл в 10 мл подвижной фазы, доводили объем раствора до метки тем же растворителем. 1 мл полученного раствора, помещали в колбу на 10 мл и доводили объем подвижной фазой до метки. 1 мл полученного раствора помещали в мерную колбу на 10 мл и доводили объем подвижной фазой до метки.
Раствор СО (концентрация 0,004 мг/мл) хроматографировали и регистрировали хроматограммы. Время анализа составляло 15 минут.
Приготовление раствора смеси ноопепта и фенилуксусной кислоты для проверки пригодности хроматографической системы проводили по следующей методике: около 0,01 г (точная навеска) ноопепта и 0,01 г (точная навеска) фенилуксусной кислоты помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяли в достаточном объеме подвижной фазы и доводили объем раствора подвижной фазой до метки (раствор А). 1 мл раствора А помещали в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводили объем раствора смесью растворителей до метки, перемешивали (раствор В). 1 мл раствора В помещали в мерную колбу на 10 мл и доводили объем раствора смесью растворителей до метки (раствор С). 20 мкл раствора С вводили в хроматограф, регистрировали хроматограммы. Содержание каждой индивидуальной примеси в процентах (Xj) вычисляют по формуле: S;x mCTx25 х 1 х 1 SixmCT X(%)= х100%= , где 8 x1111x25x10x10 SCTxmi S; - площадь пика индивидуальной примеси; SCT — площадь пика раствора СО ноопепта; mCT — масса навески СО ноопепта; mi — масса навески ноопепта в испытуемом растворе С использованием разработанной методики были проанализированы образцы субстанции ноопепта для создания инъекционной лекарственной формы. При обработке полученных хроматограмм в расчет принимали пики, содержание которых по внутренней нормализации (процентное соотношение площадей пиков, выдаваемое хроматографом) превышало 0,1%. Результаты представлены в таблице 4.5.
Потеря в массе при высушивании лиофилизированной ЛФ ноопепта
Определение показателя «Посторонние примеси» в лиофилизированном ноопепте проводили методом ВЭЖХ в условиях, разработанных для анализа субстанции ноопепта.
Исследования проводили на жидкостном хроматографе LC-10AT (Shimadzu, Япония) с фиксированным объемом петли 20 мкл, снабженном УФ-детектором UV- VIS SPD-10A с переменной длиной волны длиной, режим элюирования изократический, температура комнатная, масштаб регистрации 60 mV.
Разделение ноопепта и его возможных примесей проводили на колонке Ultra 5 мкм Ci8 (250 х 4,6 мм) с предколонкой Ultra 5 мкм Сі8 (30 х 4,6 мм), в качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрил - вода - ледяная уксусная кислота (500:500:1), рН 3,6 ± 0,2, скорость потока подвижной фазы - 0,5 мл/мин; длина волны детектирования — 205 нм; масштаб регистрации — 60 mV; объем пробы — 20 мкл.
Испытуемые растворы лиофилизированного ноопепта готовили следующим образом: содержимое 10 ампул растворяли в подвижной фазе и количественно переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляли мл подвижной фазы и перемешивали. До метки объем раствора доводили подвижной фазой. Рабочая концентрация раствора ноопепта 0,4 мг/мл.
Оценку содержания посторонних примесей проводили методом внешнего стандарта - по раствору стандартного образца ноопепта.
Раствор стандартного образца готовили по следующей методике: около 0,01 г (точная навеска) стандартного образца ноопепта помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в достаточном объеме подвижной фазы и доводят объем раствора подвижной фазой до метки (раствор А). 1 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводят объем раствора смесью растворителей до метки, перемешивают (раствор В). 1 мл раствора В помещают в мерную колбу на 10 мл, доводят объем раствора смесью растворителей до метки (раствор С). Концентрация раствора С стандартного образца ноопепта составляет 0,004 мг/мл.
Для того чтобы исключить влияние маннита, входящего в состав лекарственной формы ноопепта, на результаты анализа, был приготовлен модельный раствор маннита в подвижной фазе в той же концентрации, что и в испытуемых растворах (4 мг/мл).
Перед хроматографированием колонку промывали подвижной фазой до установления стабильной базовой линии.
Пригодность хроматографической системы определяли так же, как и при анализе субстанции ноопепта.
Испытуемые растворы, раствор С стандартного образца ноопепта и раствор для проверки пригодности хроматографической системы анализировали, делая по пять вколов каждого раствора. Содержание каждой индивидуальной примеси в процентах (X,) оценивали по формуле: S;x mCTx 1 x 1 x 25 SiXmCT Xi (%) = x 100% = , SCTxNxmix25 x Юх 10 ScrxNxnii Sj - площадь пика индивидуальной примеси; SCT — площадь пика стандартного образца ноопепта; тет — масса навески стандартного образца ноопепта, г; nij — содержание ноопепта в одной ампуле, г; N — число ампул, взятых на анализ.
Результаты определения содержания посторонних примесей в образцах лиофилизированной лекарственной формы ноопепта представлены в таблице 5.3.
На хроматограмме раствора манита (4 мг/мл), так же, как и на хроматограммах лиофилизированного ноопепта, в условиях анализа присутствовали два слабо выраженных пика со временами удерживания около 3,97 (относительное время удерживания 0,44) и 4,47 (относительное время удерживания 0,50). Хроматограмма раствора маннита представлена на рисунке 5.1.
Ни одна из обнаруженных примесей в субстанции ноопепта, а также ни один из продуктов синтеза или гидролиза ноопепта, по времени удерживания не совпадают с пиками из раствора маннита, поэтому присутствие маннита не мешало проведению анализа (пики из раствора маннита в расчет не принимались).
Хроматографический анализ лиофилизированной лекарственной формы показал, что в лекарственной форме могут присутствовать те же примеси, что и в субстанции: примесь ФАП, а также до двух неидентифицированных примесей в содержании не более 0,5% каждой примеси. Кроме того, в лиофилизированной лекарственной форме ноопепта присутствовала примесь ФАПГ - продукта гидролиза ноопепта, ее содержание не превышало 1%. Хроматограммы субстанции, из которой был приготовлен образец лекарственной формы ноопепта и самого образца лекарственной формы ноопепта представлены на рисунках 5.2. и 5.3.
На основании полученных результатов были установлены предварительные нормы качества лиофилизированной лекарственной формы ноопепта по показателю «Посторонние примеси: - содержание индивидуальной примеси - не более 1% - суммарное содержание примесей - не более 2%
![Синтез, свойства и биологическая активность производных галоген(Н)антраниловых кислот, 3,1-бензоксазин-4(3Н)-онов, хиназолинонов и изучение взаимосвязи структура - активность [Электронный ресурс]](/i/i/4391/182559.png "Синтез, свойства и биологическая активность производных галоген(Н)антраниловых кислот, 3,1-бензоксазин-4(3Н)-онов, хиназолинонов и изучение взаимосвязи структура - активность [Электронный ресурс] Курбатов Евгений Раисович")
