Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ 1 Обзор литературы 10
ГЛАВА 1. Современная фармакотерапия хронической венозной недостаточности; номенклатура венотонизирующих лекарственных средств. виноград культурный – перспективный источник получения ресвератрола и фитопрепаратов венотонизирующего действия 10
1.1. Место лекарственной терапии в современной схеме профилактики и лечении хронической венозной недостаточности 10
1.2. Номенклатура венотонизирующих средств растительного происхождения 17
1.3. Ботаническое описание, химический состав и применение сырья винограда культурного в народной и научной медицине 21
1.4. Перспективность использования ресвератрола в составе лекарственных средств и методы его анализа 28
1.5. Рациональные способы получения лекарственной субстанции из растительного сырья 31
Выводы к главе 1 34
ЧАСТЬ II. Экспериментальная часть 36
Объекты и методы исследования 36
ГЛАВА 2. Фармакогностическое изучение сырья винограда культурного и разработка методовконтроля его качества 41
2.1.Обоснование выбора исследуемого сырья 41
2.2. Исследование морфологических признаков сырья 43
2.3 Исследование микроскопических признаков сырья 44
2.3.1. Анатомическое строение жилки листа 44
2.3.2. Анатомическое строение эпидермиса листа 45
2.4. Установление номенклатуры и норм числовых показателей 51
2.5. Установление подлинности 52
2.6. Разработка методики количественного определения суммы фенольных соединений в сырье 54
2.7. Валидация методики количественного определения суммы фенольных соединений 59
2.8. Содержание фенольных соединений в зависимости от места сбора сырья 63
2.9. Изучение стабильности в процессе хранения 64
2.10. Разработка нормативной документации на сырье 64
Выводы к главе 2 67
ГЛАВА 3. Фитохимическое изучение красных листьев винограда культурного 69
3.1. Определение фенольных соединений 69
3.2. Определение ресвератрола 71
3.3. Изучение липофильной фракции 74
3.4. Определение моносахаридов 75
3.5. Определение аминокислот 78
3.6. Определение макро- и микроэлементов 80
Выводы к главе 3 82
ГЛАВА 4. Разработка способа получения сухого экстракта винограда культурного 84
4.1. Определение оптимальных параметров экстракции 84
4.2. Изложение технологического процесса получения сухого экстракта винограда культурного 87
4.3. Изучение физических свойств сухого экстракта 93
Выводы к главе 4 93
ГЛАВА 5. Изучение химического состава сухого экстракта и разработка показателей его качества 95
5.1. Изучение качественного и количественного состава биологически активных веществ сухого экстракта 95
5.1.1. Определение фенольных соединений 95
5.1.2.Определение ресвератрола 96
5.1.3. Определение моносахаридов 98
5.1.4. Определение аминокислот 101
5.1.5. Определение микро- и макроэлементов 102
5.2. Разработка методик стандартизации сухого экстракта винограда культурного 103
5.2.1. Определение подлинности 103
5.2.2.Количественное определение суммы фенольных соединений 105
5.2.3. Валидация методики количественного определения суммы фенольных соединений 106
5.3. Разработка нормативной документации на сухой экстракт 111
Выводы к главе 5 112
Общие выводы 113
Список литературы 114
- Номенклатура венотонизирующих средств растительного происхождения
- Исследование микроскопических признаков сырья
- Изучение липофильной фракции
- Изложение технологического процесса получения сухого экстракта винограда культурного
Введение к работе
Актуальность темы
На протяжении многих лет лекарственные средства растительного происхождения широко используются в медицинской практике для профилактики и лечения различных заболеваний. Эффективность применения фитопрепаратов обусловлена комплексным действием биологически активных веществ (БАВ) на различные звенья патогенетического процесса. Помимо этого, растительные средства в сравнении с синтетическими препаратами обладают меньшей токсичностью и минимальными побочными эффектами, что особенно важно при их длительном применении в терапии хронических патологий.
К числу таких заболеваний относится хроническая венозная недостаточность (ХВН), характеризующаяся уменьшением пропускной способности венозного русла, перегрузкой венозной системы и нарушением лимфатического оттока.
Данная патология характеризуется широкой распространенностью и достигает среди трудоспособного населения 40–50 %. При этом наблюдаются тяжелое хроническое течение болезни и ранняя инвалидация больных, что свидетельствует о медико-социальной значимости ХВН для современного общества. В связи с этим, совершенствование методов профилактики и лечения на ранних стадиях заболевания по средствам внедрения в практику новых эффективных венотропных лекарственных средств является актуальной проблемой фармацевтической науки.
В настоящее время фармакологическая терапия ХВН базируется на использовании преимущественно зарубежных препаратов растительного происхождения на основе тритерпеновых и стероидных сапонинов, флавоноидов, стильбенов. Одним из таких лекарственных средств является препарат Антистакс, выпускаемый швейцарской компанией Берингер Ингельхайм, содержащий комплекс БАВ красных листьев винограда культурного. Высокая эффективность Антистакса проявляется уменьшением выраженности симптомов ХВН и способствует улучшению качества жизни пациентов.
В этой связи, в рамках выполнения требований федеральной целевой программы развития фармацевтической промышленности Российский Федерации, направленной на поэтапное замещение импортируемых лекарственных средств препаратами отечественного производства, актуальным и перспективным направлением является углубленное изучение и стандартизация красных листьев винограда культурного (Vitis vinifera L.) как лекарственного растительного сырья для разработки в нашей стране на его основе венотонизирующих лекарственных средств.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы является фармакогностическое изучение винограда культурного листьев красных (ВКЛК), разработка сухого экстракта и их стандартизация.
Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие основные задачи:
- провести фармакогностическое изучение ВКЛК, установить диагностически значимые макроскопические и микроскопические признаки данного сырья;
- определить качественный состав и оценить содержание основных групп биологически активных веществ в ВКЛК;
- разработать методики стандартизации ВКЛК; оформить технические условия (ТУ) на лекарственное растительное сырье (ЛРС);
- установить оптимальные параметры экстракции биологически активных веществ из ЛРС; разработать технологическую схему получения сухого экстракта, позволяющую проводить максимальное извлечение БАВ, оформить лабораторный регламент;
- исследовать химический состав, технологические свойства и разработать показатели качества для ВКЛК экстракта сухого, разработать проект фармакопейной статьи (ФС).
Научная новизна работы
В результате информационно-аналитического анализа установлена целесообразность разработки отечественного лекарственного средства венотонизирующего действия.
На основании макро- и микроскопического анализа выявлены диагностически значимые признаки ВКЛК.
С помощью адаптированной методики высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием аутентичных образцов охарактеризован качественный состав фенольных соединений.
Установлено наличие и оценено содержание ресвератрола методом ВЭЖХ в сырье и экстракте винограда культурного.
Изучен состав липофильной фракции, определен аминокислотный и микроэлементный состав, установлено содержание моносахаридов ВКЛК и сухого экстракта.
Установлены закономерности извлечения экстрактивных веществ и фенольных соединений из растительного сырья в зависимости от степени измельченности сырья, температурного режима, типа экстрагента, соотношения сырье – экстрагент, гидродинамических условий, позволяющих разработать способ получения ВКЛК экстракта сухого.
Подобраны условия анализа фенольных соединений в растительном сырье и сухом экстракте и разработаны методики их стандартизации. Проведена валидация методик количественного определения фенольных соединений по показателям линейности, воспроизводимости, правильности и повторяемости.
Практическая значимость работы
На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:
- технические условия ТУ 9374-176-04868244-2012 «Винограда культурного листья красные»;
- лабораторный регламент ЛР 04868244-02-2013 на производство винограда культурного листьев красных экстракта сухого;
- проект ФС «Винограда культурного листьев красных экстракт сухой» (Акт внедрения методики количественного определения суммы фенольных соединений в сухом экстракте винограда культурного в ГБУЗ «ЦЛО и КК ДЗ»).
Личный вклад автора
Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, постановке цели и задач, выборе объектов исследования, проведении экспериментальных исследований, обобщению полученных данных и их статистической обработке.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности Научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенных исследований соответствуют пунктам 3 и 6 паспорта специальности.
Основные положения, выносимые на защиту
- результаты исследований качественного состава и количественной оценки БАВ ВКЛК и получаемого из него сухого экстракта;
- результаты исследований по подбору условий и разработке технологии получения сухого экстракта из ВКЛК;
- результаты разработки методик контроля качества сырья и экстракта сухого ВКЛК, обеспечивающих сквозную стандартизацию от источника к лекарственному средству.
Апробация работы
Основные положения диссертации представлены и доложены на 76-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученных с международным участием «Молодежная наука и современность» (Курск, 2011); XVIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2011); XXI Московской международной гомеопатической конференции «Развитие гомеопатического метода в современной медицине» (Москва, 2011); XI Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке. Научные и прикладные аспекты концепции здоровья и здорового образа жизни» (Москва, 2010); Международном конгрессе «Физическое и духовное здоровье: традиции и инновации» (Москва, 2011); XVI Международной научно-практической конференции по актуальным вопросам виноделия» (Москва, 2012); Первой научно-практической конференции аспирантов и молодых ученных «Молодые ученные и фармация XXI века» (Москва, 2013); Всероссийская конференция с международным участием: «От растения к препарату: традиции и современность» (Москва 2014).
Связь задач исследований с проблемным планом НИР. Диссертационная работа выполнена в соответствии с «Программой фундаментальных и приоритетных прикладных исследований Всероссийского научно-исследовательского института лекарственных и ароматических растений по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса (АПК) Российской Федерации на 2011 – 2015 годы».
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 8 статей, входящих в перечень периодических изданий рецензируемых ВАК.
Объем и структура диссертации
Номенклатура венотонизирующих средств растительного происхождения
Хроническая венозная недостаточность, согласно общепринятой номенклатуре – это патологическое состояние, обусловленное нарушением венозного оттока, проявляющееся умеренным или выраженным отеком, изменениями кожи и подкожной клетчатки, трофическими язвами (классы C3 – C6 по CEAP) [45]. В настоящее время терапию ХВН проводят по двум основным направлениям: оперативная и консервативная терапия (компрессионная, фармакотерапия, физиотерапия и лечебная физкультура). Российская флебологическая школа, основанная акад. B.C. Савельевым, базируется на принципах рационального сочетания компрессионного, хирургического и медикаментозного лечения. При этом оптимальная программа последнего подбирается с учетом стадии ХВН, превалирующего синдрома и наличия осложнений [11].
Основным показанием к применению флеботропных препаратов служат симптомы, связанные с ХВН, такие как тяжесть в ногах, дискомфорт, зуд, болезненность по ходу варикозных вен, парестезии, ночные судороги и другие веноспецифичные жалобы, хронический венозный отек, а также трофические нарушения кожи, включая венозные язвы [37, 87]. Эффективность применения данных лекарственных средств достигается средствами венотонизирующего, анальгетического, противоотечного, лимфотропного и др. терапевтических эффектов (Таблица 2).
Одним из наиболее известных и изученных флавоноидов с высокой флеботропной активностью является диосмин, препараты на его основе в течение 30 лет применяются для лечения ХВН, лимфедемы и геморроя.
Диосмин (3 ,5,7-тригидрокси-4 -метоксифлавон-7-рамноглюкозид) экстрагируют из цедры цитрусовых, цветов мелкозернистой со форы и др. растений сем. Бобовые или получают полусинтетическим способом, путем расщепления гесперидина. Диосмин плохо растворим в воде, и имеет низкую биодоступность. В связи с этим в настоящее время диосмин подвергают ультразвуковой микронизиции, получая при этом вещество с размером частиц 1,75 мкм, что позволяет повысить адсорбцию диосмина в желудочно-кишечном тракте с 32 % (для немикронизированного) до 58 %. Препараты на основе диосмина (флебодиа 600, вазокети др.) оказывают венотонизирующее и ангиопротекторное действие, уменьшают растяжимость вен, повышают их тонус, улучшают микроциркуляцию и лимфодренаж, оказывают противоотечное действие [40, 48, 56, 57]. Таблица 2 – Терапевтические эффекты и механизмы действия флеботропных
МОФФ на 90 % состоит из микронизированного диосмина и на 10 % из комбинации других флавоноидов (диосмин, гесперидин, изороифолин, линарин и диосметин). В результате клинических испытаний МОФФ как дополнение к компрессионной терапии ускоряет заживление венозных трофических язв, и подавляет веноспецифический болевой синдром, как на ранних, так и на более поздних стадиях ХВН. Клиническая эффективность данной лекарственной субстанции, связанная с уникальностью некоторых механизмов действия, отражена в Российских и Европейских рекомендациях, а также в руководстве Американского венозного форума. Микронизированная очищенная флавоноидная фракция благодаря плейотропности служит универсальным фармакологическим средством, демонстрирующим высокую клиническую эффективность у больных со всеми формами и стадиями хронических заболеваний вен. Выраженность симптомов заболевания определяет продолжительность приема препарата (от 2 месяцев и более) при его стандартной суточной дозировке (500 мг 2 раза в день) [9].
Одними из первых флеботоников стали применяться производные эсцина (экстракты конского каштана) и рутозиды.
Эсцин получают из семян конского каштана обыкновенного. В качестве субстанции используется также и суммарный экстракт конского каштана (репарил, венитан, эскузан). Данные препараты нормализуют проницаемость капилляров, нейтрализуют свободные радикалы, снижают активность эластазы и гиалуронидазы, однако, эффективны лишь в начальной стадии ХВН. После отмены препарата симптомы заболевания обычно быстро возвращаются [23, 114, 120].
Рутозиды отличает низкая биодоступность (10–15 %), которую, несмотря на все технологические совершенствования (гидроксилирование, изготовление препарата в виде быстрорастворимого порошка и т.д.), преодолеть не удается. В связи с этим их терапевтическая доза составляет 1500–3000 мг в сутки. В результате более чем у 30 % больных, получающих рутозиды в течение 2–3 месяцев, развивается медикаментозный гастрит.
Экстракт иглицы шиповатой в сочетании с гесперидином, метилхалконом и аскорбиновой кислотой в составе препаратов (цикло 3 форт) воздействуют на основные звенья патогенеза ХВН лимфо-венозной недостаточности. Препараты выпускаются в таблетках и в виде крема.
Экстракт листьев гинкго двулопастного (Ginkgo biloba L.) (гинкор форт), в состав которого входят терпены (гинкголиды) и флавоноиды, а также антоцианы и проантоцианидины (олигомеры), выпускается в капсулах. В одной капсуле содержится 14 мг экстракта Гинкго двудольного и по 300 мг гептаминола гидрохлорида и троксерутина. Благодаря этим трем компонентам препарат улучшает гемодинамику (повышается тонус вен и внутримышечных вен, устраняется артериальный спазм, уменьшается объем венозного русла нижних конечностей), снижает гиперпроницаемость сосудистой стенки, обеспечивая тем самым противоотечный эффект. Помимо этого он оказывает прямое воздействие на лимфатические сосуды (улучшает лимфодренаж), а также подавляет действие факторов воспаления и восстанавливает оксигенацию ишемизированных тканей [24, 41].
Очищенный экстракт виноградных косточек (Эндотелон), активным компонентом которого являются проантоцианидиновые олигомеры, оказывает венотонизирующий эффект, обладает защитным действием в отношении эндотелия сосудов, уменьшает проницаемость капилляров и увеличивает их резистентность. Препарат уменьшает симптомы, связанные с нарушением венозной и лимфатической циркуляции [29, 86].
Экстракт красных листьев винограда (Антистакс) в дозе 380 мг/сут приводит к достоверному улучшению субъективных симптомов ХВН. В результате лечения значительно снижается отек нижних конечностей, улучшаются тонико-эластические свойства венозной стенки, нормализуется флебогемодинамика путем коррекции начальных форм глубокого венозного рефлюкса. В сочетании с другими методами лечения Антистакс способствует нормализации тканевого кровотока, положительной динамики цитологических показателей, существенно снижает выраженность болевого, отечного синдромов, увеличивает скорость заживления трофических язв [26, 65, 68].
В клинических исследованиях доказано, что терапия препаратом Антистакс в дозе 360 мг в сутки общим курсом 75 дней (3 курсовых приемы по 25 дней в течение квартала) приводит к достоверному улучшению субъективных симптомов ХВН у пациенток с дисгормональной флебопатией, возникающей в период пери- и постменопаузы на фоне приема эстроген-гестаген содержащих гормональных препаратов [13, 25].
Исследование микроскопических признаков сырья
В стеблях винограда культурного сорта Шардоне в метил-трет-бутиловом экстракте установлено присутствие пяти стильбеноидов таких как Е-ресвератрол, Е-пицеатеннол, (+) Е-(эпсилон)-виниферин, (+)-ампелопсин А и витисин С. Выявлена антиамилоидогенная активность Е-ресвератрола и (+)-ампелопсина [116].
В культуре клеток винограда сорта Каберне Совиньон идентифицированы с помощью спектральных методов мономерные стильбеноидные глюкозиды – (Z)-и (E)-ресвератрол 3,5-O--диглюкозиды, (Z)-ресвератрол-3,5,4 -O--триглюкозид, (E)- и (Z)-пицеиды и (E)- и (Z)-ресвератрол 3,4 - O--диглюкозиды [108].
Фармакологические свойства.
Биологически активные вещества красного виноградного вина являются причиной появления в конце прошлого века такого понятия как «французский парадокс». Термин возник в результате анализа данных эпидемических исследований, который показал, что встречаемость сердечно-сосудистой патологии и смертность французов вдвое ниже, чем жителей соседних стран при одинаковом образе жизни и характере потребляемой пищи с высоким содержанием жиров. Как показали дальнейшие исследования, причина такого явления заключается в присутствии флавоноидов и стильбенов (ресвератрола и его гликозидов), содержащихся в красном вине, систематически употребляемом жителями Франции [7, 60, 122].
Сок красного винограда является потенциальным средством при физиологическом, а также индуцированном, оксидативном стрессе при сердечной недостаточности [90, 93]. Его лиофолизированные экстракты могут использоваться в виде БАД к пище кардиопротективного действия и потенциально предотвращающих старение клеток [70, 101, 131, 132].
Выявлено положительное влияние сушеных ягод (изюма) винограда культурного на клетки рака толстой кишки вследствие антиоксидантного, противовоспалительного и антипролиферативного действия фенольных соединений при изучении на культуре клеток аденокарциномы толстого кишечника человека НТ 29 метанольных экстрактов [76].
Экстракты кожицы плодов и семян винограда обладают антиоксидантными и антитромбоцитарными свойствами, антиатеросклеротическим, антигипертензивным, вазодилаторным эффектом, а также, активируя инсулин-сигнальный каскад в скелетных мышцах мышей в опытах in vivo, оказывает гипогликемический и антигипергликемический эффект [71, 82, 134].
Установлен гепатопротекторный эффект этанольного экстракта из листьев винограда культурного и его четырх фракций (CHCl3, EtOAc, n-BuOH, водная) против острого повреждения печени крыс, индуцированного тетрахлоридом углерода [98]. Проантоцианидины семян винограда обладают антимутагенной активностью, что подтверждено их протективным действием на повреждение ДНК, вызванного доксорубицином в соматических клетках дрозофилы, а также оказывает защитное действие на сердце и поджелудочную железу при окислительном поражении, вызванном ионизирующей радиацией, сопутствующей дисфункции органов и нарушении обмена веществ у крыс при гамма облучении [96, 118]. Кардиопротекторный и флеботонический эффект лейкоцианидинов из семян винограда подтвержден клиническими экспериментами в терапии пациентов с хронической венозной недостаточностью [117]. Мирицетин, выделенный из плодов винограда, оказывает положительное действие при кардиотоксических эффектах изопротеренола в опытах на крысах и может иметь значение при разработке средств для лечения инфаркта миокарда [74]. Наряду с листьями, плодами, стеблями перспективно использование в качестве ЛРС корней и усиков винограда. Экстракт корней винограда культурного проявляет гепатопротективную активность, сравнимую с таковой
Силимарина, в эксперименте на крысах в опыте с повреждением печени, обусловленным интоксикацией тетрахлоридом углерода. Водное извлечение из усиков винограда обладает антиоксидантным действием, способно понижать концентрацию глютатиона и активность транс–мембранной оксидоредуктазы [72, 125]. ВКЛК официально внесены в девятое издание Французской фармакопеи под названием «Vignerouge, Vitis vinifera» [111].
Препараты из ВКЛК применяются в гомеопатии и описаны в фармакопеях БГФ, США. В РФ зарегистрирован венотонизирующий препарат Антистакс (Antistax), Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, Ingelheim, Germany, основным компонентом которого является экстракт ВКЛК и Эндотелон (ENDOTELON, Sanofi-Aventis France) содержащий экстракт виноградных косточек, основным действующим веществом которого являются олигомеры процианидоловые семян винограда культурного [19, 67].
Кроме того, виноград культурный имеет длительную историю применения в гомеопатии. В изданиях Materia Medica начала ХХ века упоминается вино – как красное (Vinum Rubrum), так и белое (Vinum Album). Вино применяется в производстве таких гомеопатических лекарственных средств (ЛС), как Bach Flower Essences, разработанных в 30-х годах XX в. Е. Bach (Flower Essence Vitis vinifera и др.) Используются также настойки цветков (Vitis vinifera, Flos) и листьев винограда (Vitis vinifera, Folium), гомеопатические разведения, которых входят в состав как монопрепаратов (фирмы Dolisios, Boiron и др.), так и комплексных лекарственных средств, например, Гепатодорон (Weleda) и Vine Flower Essence Homaccord (Naturfarm) [95, 112].
Испытания и реперторизация гомеопатических лекарств на основе Vitis vinifera продолжаются и в настоящее время. В 2002 г на 56 всемирном Конгрессе Liga Medicorum Homoeopathica Internatinalis (LMHI) в Sibiu, Румыния, представлены результаты исследования гомеопатического действия ЛС Folium Vitis vinifera – Vinum album Vitis vinifera cum fructibus – Vinum Rubrum. При этом авторы указывают, что лечебное действие связано не только с содержащимся в этих гомеопатических средствах алкоголем, но и с наличием фенольных веществ.
Изучение липофильной фракции
Объектами исследования служили образцы опытных партий ВКЛК сорта Каберне, Саперави, Голубок, Красностоп Золотовский, заготовленные в фазу интенсивного покраснения (конец вегетации), собранные в сентябре–октябре в Ростовской обл. (Константиновский р-н, х. Ведерников) и Молдова (Комратский р-он, с. Конгаз) в 2009–2012 гг.
Отбор проб и анализ ЛРС проводили по методикам ГФ XI [18] и разработанными нами методиками качественного и количественного определения суммы фенольных соединений.
Исследование морфологических признаков сырья осуществляли в соответствии с требованиями статьи «Листья» (ГФ ХI, том 1, с. 282) [18].
Изучение анатомических признаков цельного сырья проводили в соответствии с указаниями статьи «Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья» (ГФ ХI, том 1, с. 277) [18]. Микроскопические исследования проводили с помощью микроскопа MINIMЕD 501 с бинокуляром АУ-12 1,5х (окуляр 10х и объективы: 3,7х, 10х, 20х, 40х) и микровизора Visor (ЛОМО). Полученное на микровизоре изображение редактировали в Microsoft Photo Editor. Поперечные срезы жилок листьев сделаны на салазочном микротоме.
Для хроматографических систем и экстракции БАВ использовали растворители марки «ч» и «хч». Используемые реактивы для экспериментальной части готовили согласно ГФ XI том 1 и 2, ГФ ХII часть 1. Отгонку растворителей и концентрирование извлечений осуществляли в вакуум-выпарном ротационном испарителе марки IKA RV10 (Германия).
Для проведения ТСХ использовали пластинки Kieselgel 40 F254; фирмы Е. Мегк, Darmstadt (Германия) размером 1020 см. Выполняли хроматографирование при температуре (19–22) oС в вертикальных стеклянных камерах герметически закрытых. При помощи шприца Hamilton (10 мкл) осуществляли нанесение исследуемых растворов на хроматографические пластинки.
Для тонкослойной хроматографии использовалась система растворителей: хлороформ – этилацетат – муравьиная кисота (25 : 10 : 1).
Приготовление раствора стандартного образца (СО) ресвератрола для ТСХ-анализа: около 0,01 г (точная навеска) ресвератрола количественно переносили в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяли в небольшом количестве спирта этилового 96 % и доводили до метки этим же растворителем. Срок годности раствора 1 мес.
Обнаружение зон адсорбции ресвератрола производили после высушивания и просматривания хроматограмм в УФ-свете при длине волны 365 нм.
Соотношение растворителей учитывали в объемных частях. Все значения Rf обнаруженных соединений были рассчитаны как среднее из пяти измерений.
УФ-спектры снимали на спектрофотометре Cary 100 Scan (Varian, США) в кюветах с толщиной поглощающего слоя жидкости 10 мм.
Условия хроматографирования ВЭЖХ. Изучение фенольных соединений осуществляли на хроматографе «Gilston», модель 305 (Франция). Ручной инжектор, модель Rheodyne 7125 USA с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы Мультихром для «Windows». В качестве неподвижной фазы использована металлическая колонка Kromasil C 18 (4,6250 мм), размер частиц 5 мкм. Подвижной фазой служила смесь метанол – вода – фосфорная кислота концентрированная, в соотношении 400 : 600 : 5. Анализ проводили при комнатной температуре. Скорость подачи элюента 0,8 мл/мин. Продолжительность анализа 70 мин. Детектирование проводили с помощью УФ-детектора «Gilston», UV/VIS модель 151, при длине волны 254 нм. Сравнение времн удерживания проводили с 0,05 % растворами аутентичных веществ в 70 % спирте этиловом: рутина (ФС 42-2508-87), кверцетина (ФС 42-1290-79), лютеолина (ФС 42-3130-95), лютеолин-7-глюкозида (ФС 42-3130-95), галловой кислоты (Fluka, кат. №48930), кофейной кислоты (Sigma, кат. №0625), хлорогеновой кислоты (Sigma, кат. №3378), цикориевой кислоты (ТУ), коричной кислоты (Sigma, кат. №С80857), о-кумаровой (Sigma, кат. №Н22809), эпигалокатехингаллата (Sigma, кат. №Е4143), гиперозида (ФС 42-0106-03), апигенина (Sigma, кат. №А3145), феруловой кислоты (Sigma, кат. №12870), эпикатехина (Sigma кат. №Е1753), кумарина, дигидрокверцетина (ФС 42-0162-06), кемпферола (Fluka, кат. №60010), ресвератрола (Sigma кат. № R5010), кверцетина глюкуронида (Sigma, кат. №00310590), витексина (Fluka кат. №QC1073) .
Исследование ресвератрола проводили на хроматографе Shimadzu LC 20 prominence с диодноматричным детектором SPD – M20A. Размер колонки 250х4,6 мм, сорбент – Кромасил 100 С 18,5 мкм, температура – комнатная, длина волны детектирования – 306 нм, подвижная фаза: ацетонитрил – вода (30 : 70).
Исследования липофильной фракции проводили в системе: хроматограф-масс-спектрометр-ЭВМ, состоящей из газового хроматографа Нewlett-Paccаrd 5890, масс-селективного детектора НР5973А – ЭВМ Vectra и программой обработки данных «HP Chem Station», входящей в состав системы и содержащей библиотеку на 250000 масс-спектров. Разделение компонентов смеси проводили в соответствии с рекомендациями каталога «Chemical Analysis на кварцевой капиллярной колонке HP – 5MS30 м х 0,25 мм х 0,33 ммкc привитой фазой 5 % метилфенилсиликона, 95 % диметилсилоксана, при программировании температуры от 50 оС до 280 оС со скоростью 10 оС в мин. Температура инжектора 280 оС, температура интерфейса 290 оС, температура масс-селективного детектора 250 оС. Скорость газа носителя (гелия) 1 мл/мин. Объем вводимой пробы с помощью автосамплера 1 мкл. Сброс отсутствует. Давление в инжекторе программируется с 8,8 до 22,0 psi. Масс-спектры получали при ионизации электронным ударом 70 eV сканирование спектров от 33 до 450 а.е.м. При интерпретации масс-спектров пользовались системой автоматического поиска из Chem Station, контроль интерпретации проводили на основании спектро-структурных корреляций. Идентификацию компонентов осуществляли по масс 39 спектрам электронного удара, фиксируя следующие показатели: названия соединений; времена удерживания; величины количественного вклада в смесь; индекс сходства (Match qulity) библиотечного и полученного спектров. При этом, если индекс сходства (Match qulity) составлял более 90 %, это свидетельствовало об очень хорошем совпадении спектров и, в принципе, последующий анализ спектров был не нужен.
Изучение аминокислотного состава проводили на аминокислотном анализаторе Amino Acid Analyzer AAA 339 (Чехия). Интенсивности аналитических линий элементов Na, Mg, Al, Si, P, S, Cl, K, Ca, Ti, Cr, Mn, Fe, Ni, Cu, Zn, Br, Rb, Sr, Zr, Ba, Pb и фона рядом с линией измеряли на волновом рентгеновском спектрометре S4 Pioner (Bruker AXS, Germany). Градуированные графики строили с помощью государственных стандартных образцов состава листа березы ЛБ-1 (ГСО 8923-2007), луговой травосмеси Тр-1 (ГСО 8922-2007), элодеи канадской ЕК-1 (ГСО 8921-2007), стандартных образцов (КНР) веток кустарника (GBW 07605), веток и листьев тополя (GBW 07603, GBW 07604), листьев чая (GBW 07605). Концентрации элементов Na, Mg, Al, Si, P, S, Cl, K, Ti и Ва оценили способом внешнего стандарта; Cr, Mn, Fe, Ni, Cu, Zn, Br, Rb, Sr, Zr и Pb – стандартом фоном. При расчете содержания Ti и Ва измеренную интенсивность корректировали на эффект частичного перекрытия линий. Правильность результатов рентгенофлуоресцентного анализа (РФА) контролировали с помощью польского стандартного образца состава травосмеси INCT-MPH-2, при этом получено хорошее согласие данных РФА с аттестованными значениями содержания.
Изложение технологического процесса получения сухого экстракта винограда культурного
Липофильные вещества представляют собой группу органических соединений, объединенных общим свойством хорошей растворимостью в органических растворителях – хлороформе, гексане, этиловом и петролейном эфире, и др. низкокипящих растворителях. Липиды разделяют условно на истинные жиры – глицериды жирных кислот и жироподобные вещества – фосфолипиды, воски и др.
Фармакологическое применение жиров зависит от содержания эссенциальных жирных кислот и сопутствующих веществ. Непосредственно эссенциальные жирные кислоты служат субстратами для синтеза эйкозаноидов, относятся к незаменимым факторам питания, входят в состав большинства липидов организма человека, а также наряду с глюкозой являются важнейшим источником энергии. Для анализа липофильных веществ широко используется метод ГЖХ в сочетании с масс-спектрометрией [32, 50, 69, 92].
Методика проведения анализа: около 5,0 г измельченного сырья экстрагируют в аппарате Сокслета при температуре (40±5 С), используя в качестве экстрагента н-гексан. Полученное извлечение упаривают под вакуумомом, полученный остаток анализируют методом ГЖХ. Около 20 мг полученного осадка растворяют в смеси диэтиловый эфир – гексан (3 : 1), добавляют 100 мкл метанола и 1,5 мл раствора диазометана и оставляют на 15 мин в темном месте. Затем отгоняют, и полученный остаток смешивают с раствором Фолча (2 ч хлороформа и 1 ч метанола), затем 1 мкл раствора вводят в хроматограф.
Полученная хроматограмма липофильного комплекса представлена на рисунке 21. Идентификацию компонентов осуществляли по масс-спектрам электронного удара. Анализируя полученные данные можно отметить, что в липофильной фракции идентифицировано 20 соединений, относящиеся к различным химическим группам: 1) жирные кислоты и их производные (миристиновая, пальмитиновая, линоленовая, пальмитолеиновая кислоты); 2) соединения терпеновой природы, являющиеся составной частью эфиромасличной фракции (d-лимонен, геранил фенилацетат, сквален и др.); 3) дитерпеновый спирт фитол; 4) жирорастворимые витамины – - и -токоферолы; 5) производное пиразола; 6) высшие алифатические углеводороды и другие органические вещества.
Рисунок 21 – Хроматограмма компонентного состава жирорастворимого комплекса, выделенного из красных листьев винограда культурного
Таким образом, изучен качественный состав жирорастворимой фракции, выделенной из ВКЛК и установлено присутствие как ненасыщенных, так и насыщенных жирных кислот, жирорастворимых витаминов, которые в комплексе принимают участие в выраженности наиболее важных фармакологических эффектов, свойственных для листьев винограда.
3.4. Определение моносахаридов
Согласно данным литературы сахара обнаружены в плодах винограда культурного (до 30 %) и зеленых листьях, в связи с этим, нами проведено определение данной группы веществ в красных листьях винограда культурного. Анализ осуществляли по методике, основанной на измерении оптической плотности окрашенного комплекса моносахаридов с пикриновой кислотой. В ходе исследования установлены оптимальные условия экстракции (соотношение сырье - экстрагент 1 : 25, время экстракции 1 ч), время гидролиза (1 ч) и время образования окрашенного комплекса (10 мин). Расчет содержания суммы моносахаридов проводили в пересчете на глюкозу, поскольку спектры комплекса моносахаридов ВКЛК и глюкозы совпадают и имеют максимум поглощения при 464 нм (Рисунок 22).
Методика проведения анализа: аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 0,5 мм.
Около 2 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в коническую колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл воды, закрывают пробкой и взвешивают с погрешностью +0,01 г. Колбу соединяют с обратным холодильником и нагревают на кипящей водяной бане в течение 1 часа. По истечение времени колбу охлаждают и доводят водой массу колбы до первоначальной. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр белая лента (исследуемый раствор А).
Около 10 мл раствора А помещают в плоскодонную колбу со шлифом на 50 мл, прибавляют 10 мл 10 % раствора кислоты серной, перемешивают в течение 5 мин и кипятят на водяной бане с обратным холодильником в течение одного часа при температуре 90-95 С. Раствор в колбе охлаждают и количественно переносят в стакан вместимостью 50 мл. Колбу промывают 5 мл 30 % раствора натрия гидроксида и 4 раза по 5 мл водой очищенной, присоединяя их к основному раствору, затем нейтрализуют потенциометрически до рН 6,5-7,0 30 % раствором натрия гидроксида и 10 % раствором серной кислоты. Раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора до метки водой очищенной, перемешивают и фильтруют через бумажный складчатый фильтр (белая лента), отбрасывая первые 15-20 мл фильтрата (раствор Б).
В три мерные колбы (1, 2, 3) вместимостью 50 мл отмеривают по 2 мл 1 % раствора кислоты пикриновой, и по 5 мл 20 % раствора натрия карбоната и перемешивают в течение 5 мин, в первую колбу прибавляют 4 мл раствора Б, во вторую 2 мл раствора СО глюкозы, а в третью 2 мл воды очищенной и перемешивают в течение 1-2 мин. Все три колбы с содержимым погружают в кипящую водяную баню на 10 мин, охлаждают до комнатной температуры и доводят объмы растворов водой очищенной и перемешивают. Оптическую плотность полученных растворов первой и второй колбы измеряют на спектрофотометре при длине волны 464 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, в качестве раствора сравнения используют
Примечание: Приготовление раствора СО глюкозы 0,1400 г (точная навеска) глюкозы помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора до метки, перемешивают. Около 10 мл полученного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и объем раствора доводят водой до метки, перемешивают. В 1 мл раствора содержится 0,00056 г глюкозы.
Отсутствие систематической ошибки методики подтверждено в «опытах с добавками» глюкозы. Полученные результаты приведены в таблице 20.
Аминокислоты, синтезируемые растениями, являясь биологически активными веществами, при поступлении в организм человека участвуют в биосинтезе различных азотсодержащих компонентов (специфических тканевых белков, ферментов, пептидных гормонов, эндорфинов и энкефалинов, катехоламинов), вазо- и нейроактивных эндогенных субстанций, пуринов и пиримидинов, витаминов и т. д. [31, 34]. В связи со значимостью влияния аминокислот на фармакологический эффект растительного сырья и отсутствием в литературе данных об аминокислотном составе ВКЛК, нами исследован качественный и количественный состав аминокислот в изучаемом лекарственном растительном сырье. Учитывая, что аминокислоты являются гидрофильными соединениями, мало растворимыми в органических растворителях, то объектом исследования стали водные извлечения из растительного сырья [16, 44, 50].
Методика проведения анализа: Около 5 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 200 мл и заливают 50 мл воды, нагретой до 80–85 оС, помещают на водяную баню и нагревают с обратным холодильником в течение 30 мин при температуре 80 оС. Далее извлечение охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный складчатый фильтр в мерную колбу вместимостью 50 мл. Объем полученного извлечения доводят водой до метки и перемешивают. Затем извлечение упаривают под вакуумом досуха и сухой остаток растворяют в натриево-цитратном буфере (рН 2,2), а не растворившуюся часть отделяют на центрифуге в течение 30 мин при 20 тыс. об/мин. Анализ аминокислот проводят в Li+ - цикле. Для количественной оценки определяют площади пиков идентифицированных аминокислот.
Результаты проведенного исследования представлены в таблице 21. Полученные данные свидетельствуют о наличии в изучаемом объекте 18 аминокислот и 3 соединения, содержащих аминогруппу (таурин, фосфоэтаноламин и этаноламин), причем 9 веществ (аргинин, валин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, треонин, фенилаланин) являются незаменимыми аминокислотами для организма человека.
