Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Статистика простудных заболеваний. Основные методы лечения 10
1.2. Маркетинговые исследования фармацевтического рынка противопростудных
препаратов 12
1.3 Краткая ботаническая характеристика малины обыкновенной 15
1.3.2 Применение в медицине 17
1.3.3. Показатели качества плодов малины , 19
1.3.4. Химический состав плодов и листьев малины 20
1.4. Основные свойства, методы идентификации, анализа и выделения групп веществ,
находящихся в плодах и листьях малины обыкновенной 21
1.4.1. Методы выделения 23
1.4.2. Идентификация фенольньгх соединений 24
1.4.3. Количественное определение фенольных соединений 28
1.4.4. Количественное определение суммы флавоноидов в пересчете на рутин в растительном сырье 31
1.5. Сухие экстракты из лекарственного растительного сырья 33
1.5.1. Современные подходы к технологии получения сухих экстрактов из ЛРС 34
Выводы: 37
ГЛАВА 2 Фармакогностическое изучение малины листьев 42
2.1. Фармакогностический анализ малины листьев 42
2.1.1. Изучение морфолого-анатомических признаков целого и измельченного сырья малины листьев, выявление наиболее значимых диагностических признаков 43
2.1.2. Изучение малины листьев под бинокулярной лупой 44
2.1.3. Анатомическое изучение малины листьев
2.2. Разработка физико-химических методов контроля качества малины листьев. Установление номенклатуры и норм числовых показателей 52
2.3. Исследование качественного состава БАВ растительного сырья 56
2.3.1. Установление подлинности 56
2.4. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на
рутин спектрофотометрическим методом 60
2.4.1. Микроэлементный состав сырья малины листья 67
2.5. Изучение стабильности в процессе хранения 69
2.6. Разработка нормативной документации на сырье малины листья 69
ВЫВОДЫ: 73
ГЛАВА 3. Химическое изучение и стандартизация малины листьев экстракта сухого 74
3.1. Химическое изучение сухого экстракта 74
3.1.1. Качественные реакции для определения БАВ в экстракте сухом из малины листьев... 74
3.1.2. Выделение и идентификация фенольных соединений в экстракте сухом из малины листьев 76
3.2. Количественный анализ фенольньгх соединений в экстракте сухом из малины листьев, результаты количественного изучения различных групп БАВ: дубильных веществ, органических кислот, флавоноидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии 85
3.3. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин методом УФ - спектрофотометрии з
Выводы: 95
ГЛАВА 4. Разработка технологии получения экстракта сухого из малины листьев 96
4.1. Разработка технологии получения экстракта сухого из малины листьев, технологическая схема 96
4.2. Изучение физических свойств сухого экстракта 99
Выводы к главе 4 103
ГЛАВА 5. Разработка проектов нормативной документации 104
5.1. Разработка проекта нормативной документации (ТУ) на растительное сырье малины листья 104
5.2.1. Внешние признаки. Описание 104
5.2.2. Микроскопия 104
5.2.3. Подлинность. Качественные реакции 105
5.2.4. Числовые показатели 106
5.2.5. Количественное определение 107
5.2.6. Маркировка 109
5.2.7. Упаковка 109
5.3. Разработка проекта ФС на малины листьев экстракт сухой на основании проведенных исследований НО
5.3. Разработка лабораторного регламента на получение малины листьев экстракта сухого 113
Выводы к главе 5 114
Общие выводы 115
Список литературы
- Краткая ботаническая характеристика малины обыкновенной
- Изучение морфолого-анатомических признаков целого и измельченного сырья малины листьев, выявление наиболее значимых диагностических признаков
- Выделение и идентификация фенольных соединений в экстракте сухом из малины листьев
- Подлинность. Качественные реакции
Введение к работе
Актуальность темы.
Острые респираторные и вирусные инфекции – наиболее часто встречающаяся проблема в жизни современного человека, т.к. это самые распространенные заболевания, наносящие огромный урон здоровью населения и экономике страны. С особой частотой они поражают детей и лиц старшего возраста. Эти инфекции способствуют формированию хронических заболеваний дыхательных путей, являясь одной из причин возникновения пневмонии, отягощают течение других хронических заболеваний, способствуя их неблагоприятному исходу.
Для лечения такого рода заболеваний, актуальной является разработка лекарственных препаратов на основе лекарственного растительного сырья, которые выгодно отличаются от синтетических аналогов широким спектром терапевтического действия, малой токсичностью и связанной с этим возможностью длительного применения. Весьма эффективными при профилактическом и терапевтическом использовании являются многокомпонентные препараты, содержащие биологически активные вещества, относящиеся к различным классам химических соединений, оказывающих комплексное воздействие на основные звенья патогенетического процесса. Комплексное лечение химиотерапевтическими средствами и растительными препаратами повышает эффективность лечения и снижает проявление побочных эффектов. Применение растительных средств также возможно в педиатрии и геронтологии, они безопасны при длительном применении.
На основании вышеизложенного, а также учитывая ограниченность ассортимента подобных препаратов в Государственном Реестре лекарственных средств, можно считать целесообразным и своевременным разработку нового лекарственного средства растительного происхождения, рекомендуемого для использования при указанных заболеваниях.
Листья малины (Rubus idaeus L.) издавна используют в народной медицине разных стран. Согласно данным литературных источников, листья малины имеют богатый химический состав, что делает их ценным источником БАВ. Наибольшее значение имеют фенольные соединения, в том числе дубильные вещества и флавоноиды, обладающие противовоспалительным действием. Кроме того листья малины содержат сахара, органические кислоты, витамины.
Отвары и настои из листьев малины широко применяются при лечении бронхитов, ларингитов, при кашле. В связи с несовершенством лекарственной формы в форме настоя и сложностью дозирования и хранения, целесообразна разработка технологии получения малины листьев экстракта сухого.
Цель и задачи исследования.
Целью настоящей работы является фармакогностическое изучение малины листьев, разработка технологии получения сухого экстракта из листьев малины изучение его химического состава и внедрение современных методик стандартизации качества растительного сырья и экстракта. Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
-
Изучить морфолого-анатомические признаки целых листьев малины и измельченного сырья и выявить диагностически значимые.
-
Исследовать химический состав малины листьев и сухого экстракта на его основе.
-
Оценить влияние различных факторов на процесс экстракции и определить оптимальные параметры экстракции.
-
Разработать технологию получения экстракта сухого из листьев малины.
-
Разработать методику количественного определения суммы флавоноидов в растительном сырье и экстракте сухом листа малины.
-
Разработать и оформить проект ТУ на малины листья, лабораторный регламент (ЛР) на технологию получения экстракта сухого малины листьев, проект нормативного документа на экстракт малины листьев фармакопейную статью (ФС).
Новизна работы
-
На основании макро- и микроскопического анализа выявлены диагностические признаки в анатомическом строении целых и измельченных малины листьев, подтвержденные оригинальными микрофотографиями.
-
Проведено химическое изучение биологически активных веществ (БАВ) в малины листьях и сухом экстракте с помощью физико-химических методов: хроматография в тонком слое сорбента (ТСХ), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), спектрофотомертрия, ЯМР.
-
Изучен качественный и количественный состав фенольных соединений в экстракте малины листьев сухом.
-
Разработаны технологические параметры способа получения сухого экстракта из растительного сырья, что подтверждено последующей количественной оценкой содержания БАВ в сухом экстракте с учетом данных изучения параметров экстракции (степень измельчения, тип экстрагента, соотношение сырьё – экстрагент, температурный режим).
-
Впервые предложена методика сквозной стандартизации растительного сырья и экстракта сухого малины листьев.
-
Впервые разработана НД на малины листья и малины листьев экстракт сухой.
Практическая значимость работы.
На основании проведенных исследований разработаны:
- Проект ТУ «Малины листья»
- Проект ФС «Малины листьев экстракт сухой»
-Лабораторный регламент ЛР 33150849-43-2011 на производство экстракта из листа малины.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Результаты фармакогностического исследования цельных и измельченных малины листьев.
-
Результаты фитохимического изучения состава БАВ малины листьев и малины листьев экстракта сухого.
-
Результаты разработки технологии получения малины листьев экстракта сухого.
-
Результаты разработки методик стандартизации и контроля
качества малины листьев и получаемого из него экстракта.
Апробация работы
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ в научных журналах и сборниках международных конференций.
Объём и структура диссертации.
Диссертационная работа изложена на 124 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы (глава 1), четырех глав экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающего в себя 126 источников, в том числе 20 иностранных, 3 приложений. Работа содержит 32 рисунка и 33 таблицы.
Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, представлены научная новизна и практическая значимость работы.
В первой главе на основании данных литературы описаны этиология и патогенез простудных заболеваний, приведены сведения о наиболее часто применяемых методах лечения, проанализирован фармацевтический рынок противопростудных средств. Приведены данные о распространенности в природе малины, применении в медицине, химическом составе плодов и листьев малины, методах обнаружения и количественного определения БАВ, преимуществе использования сухих экстрактов для производства лекарственных препаратов.
Вторая глава посвящена изученю морфолого-анатомических признаков целого и измельченного сырья малины листьев, выявлены наиболее значимые диагностические признаки. С целью определения критериев подлинности растительного сырья проведено исследование анатомо-диагностических признаков и предложены качественные реакции для обнаружения основных групп БАВ. Разработана методика стандартизации растительного сырья по сумме флавоноидов спектрофотометрическим методом.
В третьей главе освещены вопросы химического изучения сухого экстракта. Приведено его качественное исследование, результаты количественного изучения различных групп БАВ: фенольных соединений, в том числе флавоноидов, дубильных веществ, а также органических кислот, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов спектрофотометрическим методом.
В четвертой главе изложены данные по разработке технологии получения сухого экстракта. Проведен подбор оптимальных условий экстракции БАВ, описана технологическая схема получения экстракта сухого из листьев малины.
Пятая глава посвящена разработке проектов нормативной документации на растительное сырье и сухой экстракт на основании проведенных исследований.
Краткая ботаническая характеристика малины обыкновенной
Ориентировочно запасы свежих плодов малины в азиатской части России оцениваются в 2750 тыс. т, в том числе в Западной Сибири — 500 тыс. т., на Дальнем Востоке — 1450 тыс. т.
В европейской части заготовку малины можно проводить в Псковской, Ярославской, Владимирской, Кировской, Пермской, Горьковской, Ивановской, Свердловской, Костромской, Вологодской, Тверской, Смоленской и Ленинградской областях, в Марий Эл, Удмуртии, Татарстане, Башкортостане и Республике Коми. В Сибири промышленные заготовки возможны но всей равнинной таежной зоне и в горах Южной Сибири. Обильные урожаи малины обычно наблюдаются в средней полосе европейской части России через 3-4 года. Такая же закономерность отмечена и для других районов страны, например для Республики Коми и Северо-Восточного Алтая. Наиболее высокая продуктивность (до 3000 - 3200 кг/га свежих плодов) наблюдается на молодых гарях и вырубках. [52, 108]
Заготовка и сушка.
Заготавливают плоды малины при полном их созревании, с середины июля до конца августа. Сбор проводят в сухую погоду, после обсыхания росы. Складывают в корзины тонкими слоями, переложив их веточками или листьями. Сушить возможно на солнце или в печах при 60 - 80 С, разложив тонким слоем и осторожно переворачивая. Выход сухого сырья 18 - 20 %. Листья и цветки заготавливают в мае - июне. Сбор производят в сухую погоду [4, 65].
В официальной медицине ягоды малины применяют как потогонное и жаропонижающее средство при простудных заболеваниях, а также для улучшения вкуса лекарств [104]. Свежие ягоды 120 - 150 г едят натощак 4 раза в день при атеросклерозе, гипертонической болезни, гастритах, колитах, малокровии [53]. Они имеют специфический приятный вкус и аромат, утоляют жажду и улучшают пищеварение. Включение в диетические рационы ягод малины или продуктов из них значительно ускоряет лечение различных заболеваний желудочно-кишечного тракта, так как они обладают противорвотными, противовоспалительными и обезболивающими свойствами. Стакан сока малины снижает жар, используется в качестве целебного напитка при лихорадках, как вкусовая добавка к горьким лекарствам и как освежающий напиток [82].
Сушеные ягоды входят в состав многих лекарственных сборов. Так при кашле малину берут в равных количествах с семенами аниса, листьями мать-и-мачехи, липовым цветом (по 2 столовые ложки), 1 чайную ложку этой смеси заливают стаканом кипятка, заваривают как чай, употребляют по 3 - 4 стакана в день [46, 92]. Сухие плоды малины, заваренные в виде чая, обладают жаропонижающими и потогонными свойствами [38]. Чай из малины традиционно назначают при различных простудных заболеваниях (лечебный эффект зависит в основном от наличия в плодах салициловой кислоты). Плоды используют при простуде и воспалении легких как дополнение к противомикробным препаратам. Они существенно ускоряют процесс выздоровления при заболевании желудочно-кишечного тракта, сопровождающемся рвотой, воспалением, болью, кровотечением [68].
Свежезамороженные плоды и сушеную малину применяют как противосклеротическое средство благодаря наличию в растении жирных кислот и (3-ситостерина) [31, 32, 105]. Ягоды малины противопоказаны при нефритах и подагре, так как в плодах содержится много пуриновых оснований [4, 8, 19, 20, 27].
В народной медицине ягоды употребляют для улучшения пищеварения, при цинге, малокровии, желудочных болях, настои и отвары - при рожистых воспалениях кожи и угрях на лице [15, 18, 35]. Помимо этого, в народной медицине ягоды малины считают «отрезвляющим» средством» [96].
Листья малины обладают вяжущим, противовоспалительным, антитоксическим, кровеостанавливающим свойствами. [37, 45, 57, 102]. Настой или отвар листьев рекомендуют при желудочных и геморроидальных кровотечениях, бронхитах, пневмонии, а также при сыпях, угрях. Листья малины действуют как легкое кровоостанавливающее и вяжущее средство и используются для лечения воспалений слизистой оболочки в полости рта, для полоскания горла при ангинах [46]. Как все средства, содержащие дубильные вещества, они используются также против поноса. Тем не менее, в современной медицине листьям малины уделяют мало внимания. Отвары и настои из листьев или стеблей малины в народной медицине широко применяют при лечении простудных заболеваний, бронхитов, ларингитов, при кашле как отхаркивающее средство. Настои из листьев и цветков - при геморрое [17]. Настои цветков применяют наружно - для промывания глаз при конъюнктивитах и блефаритах. Верхушки ветвей малины с листьями настаивают как чай («малиновый чай») при острых респираторных заболеваниях и рожистом воспалении кожи [46, 78, 81, 83]. Корни и одревесневшие ветки малины применяют при неврастении и острых хронических инфекционных заболеваниях. Имеются сообщения о лечении бронхиальной астмы отварами корней малины [75]. Р. Г. Шулейко разработаны суппозитории, содержащие масло малины, которые эффективны при лечении воспалительных заболеваний придатков матки [86, 104]. В тибетской медицине малина используется при острых простудных заболеваниях [20, 49, 50, 66, 67]. В гомеопатии используются плоды и листья малины [77]. В Англии водный настой листьев малины применяют для уменьшения менструальных болей [107]. В Британской Фармакопее описан сироп и сок плодов малины как корригирующее вкус и придающее приятный запах лекарственным средствам. Во Франции и в Германии листья малины используют в качестве противовоспалительного средства и при гинекологических заболеваниях [110].
Качество сырья плодов малины регламентируется ГОСТ 3525-75 «Плоды малины» и включает следующие числовые показатели: содержание влаги — не более 15 %; общей золы — не более 3,5 %; почерневших плодов — не более 8,0 %; плодов, слипшихся в комки, — не более 4 %; плодов с неотделенными цветоножками и цветоложами — не более 2 %; измельченных частиц плодов, проходящих сквозь сито по ГОСТ 214-70 с диаметром отверстий 2 мм, — не более 4 %; листьев и частей стеблей малины — не более 0,5 %; посторонних примесей: органической (плоды и части других неядовитых растений) — не более 0,5 %; минеральной (земля, песок, камешки) — не более 0,5% [21, 22].
Изучение морфолого-анатомических признаков целого и измельченного сырья малины листьев, выявление наиболее значимых диагностических признаков
Методы стандартизации лекарственного растительного сырья. Стандартизация - система норм качества сырья, продукции, методов испытания и т.д., установленная в общегосударственном порядке и обязательная для производителей и потребителей.
ГФ XI рекомендует следующие методы анализа растительного сырья: для листьев при макроскопическом анализе сырья отмечают форму и размеры листовой пластинки и черешка, опушение листа, характер края и жилкование, наличие эфиромасличных железок и других образований на поверхности листа или наличии вместилищ в мезофилле. Размеры длину, ширину листовой пластинки, длину черешка определяют с помощью линейки. Цвет определяют с обеих сторон при дневном освещении, запах - при растирании, вкус - водного извлечения [19, 26].
При микроскопическом анализе рекомендуется: для тонких листьев готовить препарат листа с поверхности, для кожистых - поперечные срезы. Гистохимические реакции проводят на поперечных срезах и в порошке. Качественные реакции проводят с извлечением из сырья. Числовые показатели. В сырье определяют: влажность, содержание золы общей и золы, не растворимой в хлористоводородной кислоте разбавленной 10 %, содержание примесей. 2.1.1 Изучение морфолого-анатомических признаков цельного и измельченного сырья малины листьев, выявление наиболее значимых диагностических признаков Было изучено: 1) высушенные цельные малины обыкновенной листья (Folia Rub і); 2) высушенные измельченные малины обыкновенной листья (Folia Rubi). Макроскопический анализ. Проведенный анализ позволил выявить следующие диагностические признаки: Рис. 5. Внешний вид листьев малины; а - целые листья, б измельченные листья. 1) Высушенное цельное лекарственное растительное сырье представляет собой листья, непарноперистосложные с 3 - или 5 - короткочерешковыми сидячими листочками. Прилистники нитевидные. Жилкование перистое, край неравнопильчатый. Форма листочков - яйцевидная, заостренная. Верхняя сторона гладкая, нижняя воилочно опушена, черешки покрыты редкими мелкими шипиками. Цвет листьев с верхней стороны - темно-зеленый, с нижней - серо белый; цвет черешков - светло-зеленый, красновато-фиолетовый (Рисунок 5). 2.1.2 Изучение малины листьев под бинокулярной лупой
Цельное и измельченное сырье - листья малины обыкновенной предварительно были размочены в горячей воде. Сырье изучали с помощью бинокулярной лупы МБС - 1 при увеличении х 4, х 2.
При рассмотрении верхней стороны цельного листа видны сетчато расположенные жилки. На каждом зубчике края листа располагается большое количество крупных волосков, направленных к верхушке зубчика. Каждый зубчик имеет пигментированную красно - коричневую верхушку своеобразной сосочковидной формы. Крупные волоски расположены вдоль крупных жилок на поверхности листа. Черешок покрыт мелкими волосками. При рассмотрении цельного листа с нижней стороны видно войлочное опушение. Особо крупные волоски располагаются по крупным жилкам. (Рисунок 5 а) При рассмотрении под бинокулярной лупой измельченного сырья малины также видны сетчато-расположенные мелкие светло-зеленые жилки, крупные волоски, расположенные по жилке и на зубчиках. Последние также имеют пигментированную верхушку (Рисунок 6). Нижняя сторона войлочно опушена, имеются крупные волоски по жилке (Рисунок 7).
Сведения о микроскопическом строении листьев малины в доступной литературе практически отсутствуют [36]. Имеются лишь краткие сведения о строении эпидермиса листа. В связи с этим было необходимо провести исследование анатомического строения и анатомо-диагностических признаков листьев малины.
Цельное сырье. При рассмотрении листа с поверхности видны с верхней стороны многоугольные полигональные клетки эпидермиса с прямыми, слабоизвилистыми и извилистыми стенками, длиной 20 - 62 мкм, шириной 8-33 мкм (Рисунок 8). Рис. 8. Малины листья. Верхний эпидермис. Многоугольные полигональные клетки с прямыми стенками. Просвечивающие друзы. (слева ув. х 105; справа ув. х 200) С нижней стороны - клетки со слабоизвилистыми, извилистыми стенками. Клетки эпидермиса вдоль жилок вытянуты прямоугольной, веретеновидной и комбинированной формы. Видны простые волоски, устьица. Рисунок 9. Рис. 9. Малины листья. Нижний эпидермис. Простые тонкостенные волоски, места их прикрепления, устьица. (Ув. х 450) Кутикула с обеих сторон листа ровная. Устьица аномоцитного типа обильно расположены с нижней стороны листа (длиной 75 - 92 мкм, шириной 8-21 мкм; на зубчиках листа устьица более крупные - гидотоды (Рисунок 10). Рис. 10. Малины листья. Верхний эпидермис зубчик листа. Крупные устьица - гидотоды и просвечивающие друзы. (Ув. х 300) Волоски двух типов: простые и головчатые. Простые волоски одноклеточные двух типов: 1) Тонкостенные нитевидные, сильно извивающиеся и переплетающиеся между собой, образующие войлокоподобный слой (длиной до 1150 мкм); Рисунок 11. Рис. 11. Малины листья. Простые тонкостенные, сильно извивающиеся волоски, переплетающиеся между собой, образующие войлокоподобный слой. (Ув. х 225) 2) Толстостенные одиночные, почти прямые (длиной до 500 мкм). Нередко у основания волосков образуется розетка из клеток эпидермиса. С верхней стороны листа волоски встречаются очень редко (0 - 13 на 1 мм), толстостенные волоски почти не обнаруживаются, только ближе к краю пластинки листа и по краю, где они прижаты по направлению к вершине зубчика листа. Нижняя сторона листа обильно опушена простыми волосками обоих типов (0 - 103 на 1 мм2), причем опушенность листа увеличивается от вершины к его основанию. Головчатые волоски редко встречаются с верхней стороны листа, в основном но жилкам (длиной 20 - 65 мкм). Они имеют многоклеточную ножку (длиной 37 - 42 ммкм) и многоклеточную головку (длиной 37 - 50 мкм, шириной 29 - 42 мкм). Рисунок 12.
Выделение и идентификация фенольных соединений в экстракте сухом из малины листьев
На основании проведенных исследований, было установлено наличие в малины листьях БАВ фенольного происхождения, которые обуславливают его биологическую активность. Идентификацию веществ осуществляли с помощью качественных реакций, тонкослойной хроматографии, УФ - спектрофотометрии, данных ЯМР - спектров. Для разделения веществ использовали колоночную хроматографию, метод ВЭЖХ. Подлинность. Для проведения анализа был получен сухой экстракт листа малины. Порошок от светло-коричневого до темно-коричневого цвета, со специфическим приятным запахом, вяжущим вкусом, гигроскопичный.
Дубильные вещества. Навеску сухого экстракта из малины листьев массой 0,1 г растворили в 50 мл 40 % спирта этилового. В пробирку с 5 мл полученного раствора прибавили 1 мл раствора железа окисного хлорида, наблюдали появление фиолетово-черного окрашивания раствора - дубильные вещества.
Флавоноиды. 10 мл спиртового извлечения, полученного в предыдущем опыте, поместили в колбу, вместимостью 50 мл, прибавили 2 капли уксусной кислоты разбавленной и прибавили 2 мл 5 % раствора алюминия хлорида. Наблюдали появление желтого окрашивания, характерного при наличии флавоноидов.
Фенольные соединения. На линию старта хроматографической пластинки «Силуфол» нанесли спиртовое извлечение из первого опыта и ряд свидетелей: кислота галловая, кислота кофейная, кислота эллаговая, кверцетин, гиперозид и поместили пластинку в камеру (предварительное насыщение не менее 2 ч), со смесью растворителей: хлороформ - метанол (8:2) и хроматографировали восходящим способом. Затем пластинку высушили и обработали спиртовым раствором железа окисного хлорида. Наблюдали разделение веществ в суммарном экстракте. Наличие характерных пятен, схожих по цвету и местоположению на пластинке, говорит о присутствии веществ - свидетелей в экстракте. Рисунок 23.
Разделение смеси веществ суммарном экстракте из листа малины в присутствии свидетелей. Ro - исследуемый образец Rj- кверцетин R2 - галловая кислота Яз- кофейная кислота Rj - салициловая кислота R5 - гиперозид 3.1.2 Выделение и идентификация фенольных соединений в экстракте сухом из малины листьев Экстракт сухой из листа малины (27 г) растворили в 500 мл дистиллированной воды и последовательно обрабатывали хлороформом 2 раза по 130 мл, этилацетатом 2 раза по 200 мл, н-бутанолом 2 раза по 200 мл. Органические растворители из соответствующих фракций были удалены. Высушенные образцы растворили в ацетоне для последующего хроматографического разделения. Этилацетатная фракция хроматографировалась на силикагеле 40/100ц, очищенном от следов железа путем обработки соляной кислотой (колонка № 1). Диаметр колонки 10 мм, высота 900 мм. Из этилацетатной фракции методом колоночной хроматографии на силикагеле, используя в качестве элюента во всех случаях смесь хлороформа и метанола в соотношении 8:2, с последующей рехроматографией на том же сорбенте с использованием в качестве элюента смесь хлороформа и метанола с увеличением градиента последнего от 0,5 % до 20 %, были выделены фенолкарбоновые кислоты и флавоноиды.
Фракция (колонка № 1), соответствующая 2 % раствору метанола содержала кофейную кислоту, которая была идентифицирована с помощью метода ТСХ в присутствии свидетеля и по данным УФ и Н-ЯМР спектров. УФ - спектр: Тцпах 224, 298, 326 нм, A, 264 нм. Спектр полностью идентичен спектру достоверного образца. Рисунок 24 (а, б). Формула и УФ - спектр кофейной кислоты.
УФ - спектр кофейной кислоты (1) и достоверного образца (2) Из этилацетатной фракции была выделена галловая кислота. Фракция (колонка № 1), соответствующая 4,5 % раствору метанола давала на ТСХ в системе хлороформ - метанол (8:2) при проявлении 1 % спиртовым раствором хлорида железа в присутствии свидетеля (галловой кислоты) зону адсорбции ярко-синего цвета, характерную для галловой кислоты. Фракции были рехроматографированы на таком же силикагеле (колонка № 2 диаметр 10 мм, высота 500 мм). Режим элюирования градиентный: смесь хлороформа с метанолом с увеличением градиента последнего от 1 % до 10,5 %. Из фракции соответствующей 6 % раствору метанола в хлороформе выделена чистая галловая кислота, идентифицированная по данным УФ и Н-ЯМР спектров. УФ - спектр: Хщах 274нм, Ащш 240нм. УФ - спектры исследуемого и достоверного образца полностью идентичны. Рисунок 25 (а, б). 1Н-ЯМР спектр (7,05м.д.,с, Н-2 и Н-6).
Подлинность. Качественные реакции
Для количественного определения суммы флавоноидов был применен спектрофотометрический метод на основе реакции комплексообразования с алюминия хлоридом. Для получения более воспроизводимых результатов, реакцию комплексообразования ведут в кислой среде.
В качестве стандартного вещества был выбран рутин, дифференциальный спектр поглощения с алюминием хлоридом которого в предлагаемых условиях совпадает с дифференциальным спектром поглощения суммы флавоноидов с алюминия хлоридом в листьях малины.
Методика. Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещали в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляли 30 мл 50 % спирта. Колбу присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 мин, периодически встряхивая для смывания частиц сырья со стенок. Горячее извлечение фильтровали через вату в мерную колбу вместимостью 100 мл так, чтобы частицы сырья не попадали на фильтр. Вату помещали в колбу для экстрагирования и прибавляли 30 мл 50 % спирта. Экстракцию повторяли ещё раз в описанных выше условиях, фильтруя извлечение в ту же мерную колбу. После охлаждения объем извлечения доводили 50 % спиртом до метки и перемешивали (раствор А). 5 мл раствора А помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, 50 % спиртом доводили объем раствора до метки и перемешивали (раствор Б). 5 мл раствора Б помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли 2 мл раствора алюминия хлорида, 5 мл 50 % спирта и нагревали на кипящей бане в течение 3 мин, быстро охлаждали до комнатной температуры, прибавляли 1 мл буферного раствора с рН 4,0, доводили объем раствора 50 % спиртом до метки и перемешивали.
Измеряли оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре в максимуме поглощения при длине волны 407 нм в кювете 108 с толщиной слоя 10 мм, используя в качестве раствора сравнения раствор, состоящий из: 2,5 мл раствора Б, 1 мл буферного раствора с рН 4,0, помещенный в мерную колбу вместимостью 25 мл и доведенной 50 % спиртом до метки.
Параллельно измеряли оптическую плотность раствора, содержащего 1 мл раствора СО рутина, обработанного аналогично испытуемому раствору, начиная от слов «...помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли...», и используя в качестве раствора сравнения раствор, состоящий из 1 мл раствора СО рутина и 1 мл буферного раствора с рН 4,0, помещенный в мерную колбу вместимостью 25 мл и доведенный 50 % спиртом до метки.
Приготовление раствора стандартного образца (СО) рутина. Около 0,05 г (точная навеска) рутина (ГФ X) предварительно высушенного при температуре 130 - 135 С в течение 3-х часов, помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в 50 мл 95 % спирта при нагревании на кипящей водяной бане, охлаждали до комнатной температуры, доводили объем раствора 95 % спиртом до метки и перемешивали.
Приготовление 2 % раствора алюминия хлорида. 2 г алюминия хлорида (ГОСТ 3759-75, х. ч. или ч. д. а.) растворяли в 50 мл 50 % спирта в мерной колбе вместимостью 100 мл, доводили объем раствора 50 % спиртом до метки и перемешивали. Приготовление буферного раствора с рН 4,0. 10 мл 1 М раствора натрия гидроксида помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 57 мл 1 М раствора уксусной кислоты, доводили объем раствора водой до метки и перемешивали. Срок годности раствора 1 мес. На основании полученных данных установлены пределы содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин не менее 1,8 %. Маркировка производится по ГОСТ Р 51074-97 (с дополнениями). На этикетке лист малины обыкновенной сухой указывают следующие данные: предприятие-изготовитель, его адрес и товарный знак, торговое наименование, масса нетто, кг, дату изготовления и номер серии; условия хранения, срок годности; обозначение технических условий.
Этикеточная надпись должна содержать указание «Не подлежит реализации населению, предназначено для промышленной переработки».
Маркировку транспортной тары производят по ГОСТ 14192-96 с нанесением предупредительного знака «Беречь от влаги».
Транспортная маркировка должна содержать следующие данные: предприятие-изготовитель, его адрес и товарный знак, торговое наименование, количество упаковок в транспортной таре; масса нетто и масса брутто, кг; дата изготовления и номер серии; условия хранения, срок годности; обозначение технических условий.
На основании проведенных экспериментов разработан и оформлен проект ФС «Малины листьев экстракт сухой» Проект ФС включает следующие разделы: описание, подлинность, влажность, тяжелые металлы, микробиологическая чистота, количественное определение суммы флавоноидов в пересчете на рутин, упаковка, маркировка, хранение срок годности.
