Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ I. Обзор литературы 12
ГЛАВА 1. Современное состояние исследований в области стандартизации лекарственных средств на основе тритерпеновых гликозидов 12
1.1 Тритерпеновые гликозиды лекарственных растений, методы идентификации, анализа и выделения 12
1.1 1 Общая характеристика, классификация и химическое строение ТГ ... 12
1.1.2 Физико-химические свойства ТГ 13
1.1.3 Идентификация ТГ 15
1.1.3.1 Химические и биологические методы 15
1.1.3.2 Хроматографическое обнаружение 16
1.1.3.3 ЯМР и масс- спектроскопия 17
1.1.3.4 ИК-спектроскопия 18
1.1.3.5 УФ-спектроскопия 18
1.1.4 Количественное определение ТГ 19
1.1.4.1 ВЭЖХ-анализ в определении ТГ 20
1.1.5 Способы выделения ТГ из лекарственного растительного сырья 23
І.І.бРаспространение в природе ТГ 24
1.2 Современные подходы к технологии получения сухих экстрактов из ЛРС. 26
1.3 Ботаническая характеристика конского каштана обыкновенного 30
1.4 Химический состав семян конского каштана обыкновенного 31
1.5 Стандартизация качества сырья и препаратов из семян конского каштана обыкновенного 33
1.6 Применение препаратов на основе семян конского каштана обыкновенного в медицине 35
1.6.1 Фитотерапия ХВН. Номенклатура, состав, показатели качества венотонизирующих лекарственных средств растительного происхождения 35
1.6.1.1 Растительные препараты, содержащие тритерпеновые гликозиды и другие сапонины. Применение конского каштана в медицине 36
1.6.1.2 Номенклатура биологически активных добавок к пище (БАД) растительного происхождения, способствующие нормализации периферического (капиллярного) кровообращения и улучшению состояния сосудов нижних конечностей 39
1.6.2 Фармакологические свойства препаратов семян конского каштана
обыкновенного 39
1.7 Организационно-экономическое обоснование целесообразности создания отечественных препаратов на основе семян конского каштана обыкновенного43
Выводы к главе 1 45
ЧАСТЬ II. Экспериментальная часть
Объекты, материалы и методы исследования 46
ГЛАВА 2. Совершенствование фармакогностических и физико-химических методов контроля качества семян конского каштана обыкновенного 55
2.1 К фармакогнозии семян конского каштана обыкновенного и установление
методов определения подлинности семян 55
2.1.1 Исследование морфологических признаков семян 55
2.1.2 Исследование микроскопических признаков цельных и измельченных семян 56
2.1.3 Установление подлинности семян 61
2.2 Разработка методики количественного определения ТГ 64
в сырье 64
2.2.1 Подбор хроматографических условий разделения эсцина 64
2.2.2Подбор оптимальных условий пробоподготовки семян 67
2.2.3 Методика количественного определения эсцина в семенах 71
2.2.4 Валидация методики количественного определения эсцина с использованием метода ВЭЖХ 73
2.3 Изучение стабильности сырья в процессе хранения 77
2.4 Обоснование номенклатуры и норм числовых показателей 77
2.5 Разработка нормативной документации на сырье 81
Выводы к главе 2 82
ГЛАВА 3. Фитохимическое изучение семян конского каштана обыкновенного 83
3.1 Изучение качественного и количественного состава некоторых групп БАС семян 83
3.1.1 Тритерпеновые гликозиды 83
3.1.2Флавоноиды и кумарины 83
3.1.3 Углеводы 84
3.1.3.1 Полисахариды 84
3.1.3.2 Моно- и дисахариды 85
3.1.4 Аминокислоты 88
3.1.5Липофильные вещества 92
3.2 Макро- и микроэлементный состав 97
Выводы к главе 3 98
ГЛАВА 4. Разработка способа получения сухого экстракта из семян конского каштана обыкновенного 99
4.1 Разработка способа получения сухого экстракта 99
4.2 Изложение технологического процесса получения сухого экстракта 105
4.3 Характеристика конечного продукта производства 111
Выводы к главе 4 113
ГЛАВА 5. Разработка показателей качества конского каштана обыкновенного экстракта сухого 114
5.1 Изучение качественного состава БАС в сухом экстракте 114
5.1.1 Тритерпеновые гликозиды 114
5.1.2Флавоноиды и кумарины 114
5.1.3 Углеводы 115
5.1.4 Аминокислоты 116
5.1.5 Липофильные вещества 118
5.2 Изучение микроэлементного состава 119
5.3 Разработка методов установления подлинности 120
5.4 Разработка количественное определение ТГ 121
5.5 Разработка проекта НД на субстанцию «Конского каштана обыкновенного семян экстракт сухой» 124
Выводы к главе 5 125
Общие выводы 126
Список литературы
- Общая характеристика, классификация и химическое строение ТГ
- Исследование морфологических признаков семян
- Тритерпеновые гликозиды
- Изложение технологического процесса получения сухого экстракта
Введение к работе
Актуальность темы
В настоящее время среди населения наблюдается значительный рост сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), в том числе, хронической венозной недостаточности (ХВН). На сегодняшний день варикозная болезнь нижних конечностей является самой распространенной патологией периферических сосудов. Согласно эпидемиологическим данным различные формы этого заболевания встречаются у 26-38% женщин и у 10-20% мужчин трудоспособного возраста. Ежегодный прирост новых случаев заболевания у жителей индустриально развитых стран достигает 2,6 % среди женщин и 1,9 % среди мужчин. Специалисты связывают это с ухудшением экологии, увеличением частоты стрессовых ситуаций, употреблением спиртных напитков, курением, малоподвижным образом жизни, статическими перегрузками. По возрастным особенностям ССЗ имеют тенденцию к омоложению.
Варикозная болезнь является не только косметической проблемой: варикотромбофлебиты, трофические нарушения кожи, язвы значительно снижают трудоспособность, нарушают социальную адаптацию и качество жизни больных, а также может привести к инсульту, инфаркту миокарда и тромбоэмболии легочных артерий, которые чреваты летальным исходом. Именно поэтому лечение венозной недостаточности нужно начинать с самых ранних доклинических стадий развития заболевания. К сожалению, для большинства пациентов, да и врачей, необходимость лечения ХВН ассоциируется с осложненными формами заболевания уже на поздних его стадиях, когда реальную помощь больному может оказать только хирург. Вместе с тем, это заболевание на ранних стадиях является исключительно терапевтической проблемой, требующей только своевременного лечения.
До сих пор не создано универсальных препаратов для лечения ХВН. Спектр действия большинства из них достаточно узок (декстраны влияют на реологию крови, антиагреганты уменьшают агрегационную активность тромбоцитов, венотоники улучшают тонус венозной стенки). Для достижения
8 оптимального лечебного эффекта врачам приходится применять несколько препаратов разных фармакотерапевтических групп. Таким образом, идеальный препарат для лечения ХВН должен воздействовать на как можно большее количество патогенетических звеньев заболевания, при этом иметь минимальный перечень побочных эффектов и высокую биодоступность. Именно растительные препараты наиболее полно отвечают этим требованиям.
Номенклатура этих лекарственных средств чаще всего представлена импортными препаратами на основе сырья конского каштана обыкновенного (Анавенол, Венитан, Эскузан, Эссавен-гель, Веноплант и другие), составляющих 70 % рынка ангиопротекторных и венотонизирующих средств. В России процент таких средств ничтожно мал. В связи с этим целесообразно вести разработки новых фитопрепаратов с венотонизирующими свойствами.
Венотонизирующее и ангиопротекторное действие большинства из известных фитопрепаратов обусловлено тритерпеновыми гликозидами (ТГ) семян конского каштана обыкновенного.
В последние годы фармацевтическими субстанциями служат экстракты, полученные из растительного сырья с использованием специальной технологии и стандартизованные по основным биологически активным соединениям (БАС). Учитывая вышеприведенные факты, представляется актуальной разработка эргономичных и валидированных методик контроля качества ЛРС конского каштана обыкновенного и получаемых на его основе субстанций.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы является фармакогностическое и фитохимическое изучение семян конского каштана обыкновенного, разработка способа получения из них сухого экстракта и внедрение современных методик стандартизации качества этого сырья и субстанции.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- изучить морфолого-анатомические признаки измельченных и цельных
9 семян конского каштана обыкновенного и выявить наиболее диагностически значимые из них;
разработать методики качественного и количественного анализа ТГ (эсцина) для оценки качества семян конского каштана;
разработать и оформить проект нормативного документа на семена конского каштана - технические условия (ТУ);
исследовать химический состав некоторых групп БАС в семенах конского каштана обыкновенного;
разработать способ получения сухого экстракта из семян конского каштана, изучить его технологические свойства и оформить лабораторный регламент (ЛР) технологии его производства;
разработать показатели и их нормы для контроля качества конского каштана семян экстракта сухого;
разработать и оформить проект нормативного документа на конского каштана семян экстракт сухой - проект фармакопейной статьи (ФС).
Научная новизна работы
На основании макро- и микроскопического анализа выявлены диагностические признаки в анатомическом строении тканей измельченных семян конского каштана обыкновенного, предложены методики пробоподготовки для установления подлинности измельченных и цельных семян конского каштана методом микроскопии, что подтверждено оригинальными микрофотографиями.
Подобраны и отработаны условия проведения анализа ТГ (эсцина) в сырье и конского каштана семян экстракте сухом. Впервые разработаны унифицированные физико-химические методики как для контроля качества сырья, так и субстанции.
Впервые изучен качественный состав основных групп БАС (ТГ, флавоноидов и кумаринов, полисахаридов, моносахаридов, аминокислот, липидов и микроэлементов) в семенах конского каштана обыкновенного, произрастающего в Подмосковье.
Впервые изучено содержание ТГ, полисахаридов, моно- и дисахаридов, аминокислот, липидов и микро- и макроэлементов в сырье и сухом экстракте из него.
Подобраны параметры технологии получения сухого экстракта из семян конского каштана и разработан способ получения конского каштана обыкновенного семян экстракта сухого, который оформлен в виде ЛР.
С учетом современных требований к стандартизации ЛРС и экстрактам сухим разработаны критерии для установления подлинности и контроля качества семян и сухого экстракта из них конского каштана обыкновенного.
Практическая значимость работы
На основании проведенных исследований разработаны и утверждены:
Технические условия ТУ 9377-075-04868244-2008 «Конского каштана обыкновенного семена».
Проект ФС «Конского каштана обыкновенного семян экстракт сухой».
Лабораторный регламент ЛР 04868244-02-2008 на производство конского каштана обыкновенного семян экстракта сухого.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
Результаты фармакогностического исследования цельных и измельченных семян конского каштана обыкновенного.
Результаты разработки способа получения конского каштана обыкновенного семян экстракта сухого.
Результаты фитохимического изучения состава БАВ семян и получаемого на их основе сухого экстракта.
Результаты разработки методик для стандартизации и контроля качества семян и получаемого на их основе сухого экстракта.
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на международных научно-практических конференциях, конгрессах, съездах: 69-ой итоговой конференции СНО (Самара, 2001), 70-ой итоговой конференции СНО (Самара, 2002), XXVIII Самарской областной студенческой научной
конференции (Самара, 2002), Міжнародної конференції студентів та молодих вчених «Медицина - здоров'я XXI сторіччя» (Днепропетровск, 2002), VI Международном съезде Фитофарм-2002 «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (С.-П., 2002), Міжнародна науково-практична конференції молодих вчених «Вчені майбутнього» (Одесса, 2002), 71-ой итоговой конференции СНО (Самара, 2003), X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2003), Российской научно-практической конференции «Рациональное использование лекарств» (Пермь, 2004), VIII Международном съезде Фитофарм-2004 «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (Финляндия, Миккели, 2004), IX Международном конгрессе «Здоровье и Образование в XXI веке» (Москва, 2008). Сданы в печать три ВАК статьи.
Связь задач исследований с проблемным планом НИР
Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ВИЛАР по «Программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса РФ на 2006-2010 гг.», задание 04, шифр 04.13 «Разработка технологий производства высокоэффективных лечебных и профилактических препаратов из растительного сырья».
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ в научных журналах, сборниках международных конференций и научных трудах.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 150 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы (глава 1), четырех глав экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающего 208 источника, в том числе 78 иностранных, 9 приложений. Работа содержит 24 рисунка и 31 таблицу.
Общая характеристика, классификация и химическое строение ТГ
Впервые изучено содержание ТГ, полисахаридов, моно- и дисахаридов, аминокислот, липидов и микро- и макроэлементов в сырье и сухом экстракте из него.
Подобраны параметры технологии получения сухого экстракта из семян конского каштана и разработан способ получения конского каштана обыкновенного семян экстракта сухого, который оформлен в виде ЛР.
С учетом современных требований к стандартизации ЛРС и экстрактам сухим разработаны критерии для установления подлинности и контроля качества семян и сухого экстракта из них конского каштана обыкновенного.
Практическая значимость работы На основании проведенных исследований разработаны и утверждены: - Технические условия ТУ 9377-075-04868244-2008 «Конского каштана обыкновенного семена». - Проект ФС «Конского каштана обыкновенного семян экстракт сухой». - Лабораторный регламент ЛР 04868244-02-2008 на производство конского каштана обыкновенного семян экстракта сухого. Основные положения диссертации, выносимые на защиту: - Результаты фармакогностического исследования цельных и измельченных семян конского каштана обыкновенного. - Результаты разработки способа получения конского каштана обыкновенного семян экстракта сухого. - Результаты фитохимического изучения состава БАВ семян и получаемого на их основе сухого экстракта. - Результаты разработки методик для стандартизации и контроля качества семян и получаемого на их основе сухого экстракта. Апробация работы
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на международных научно-практических конференциях, конгрессах, съездах: 69-ой итоговой конференции СНО (Самара, 2001), 70-ой итоговой конференции СНО (Самара, 2002), XXVIII Самарской областной студенческой научной конференции (Самара, 2002), Міжнародної конференції студентів та молодих вчених «Медицина - здоров я XXI сторіччя» (Днепропетровск, 2002), VI Международном съезде Фитофарм-2002 «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (С.-П., 2002), Міжнародна науково-практична конференції молодих вчених «Вчені майбутнього» (Одесса, 2002), 71-ой итоговой конференции СНО (Самара, 2003), X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2003), Российской научно-практической конференции «Рациональное использование лекарств» (Пермь, 2004), VIII Международном съезде Фитофарм-2004 «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (Финляндия, Миккели, 2004), IX Международном конгрессе «Здоровье и Образование в XXI веке» (Москва, 2008). Сданы в печать три ВАК статьи.
Связь задач исследований с проблемным планом НИР
Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ВИЛАР по «Программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса РФ на 2006-2010 гг.», задание 04, шифр 04.13 «Разработка технологий производства высокоэффективных лечебных и профилактических препаратов из растительного сырья».
Публикации По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ в научных журналах, сборниках международных конференций и научных трудах. Объем и структура диссертации Диссертационная работа изложена на 150 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы (глава 1), четырех глав экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающего 208 источника, в том числе 78 иностранных, 9 приложений. Работа содержит 24 рисунка и 31 таблицу.
Исследование морфологических признаков семян
В литературе имеются работы, посвященные исследованию анатомического строения вегетативных органов конского каштана [1,65,116]. В соответствии с новыми требованиями к изложению раздела «Микроскопия» в НД на лекарственное растительное сырьё нами проведено экспериментальное изучение анатомических особенностей цельных семян и их тканей.
Цельные семена. Для выявления диагностических признаков в анатомическом строении проведено микроскопическое исследование цельных семян, что подтверждено микрофотографиями.
Приготовление препаратов кожуры и околоплодника с поверхности семян проводят в соответствии с техникой микроскопии ГФ XI: 2-3 семени кипятят в колбе в растворе 5% едкого натра в течение 2-3 минут и тщательно промывают водой. Затем семя помещают на предметное стекло, препаровальными иглами отделяют кожуру и ткани околоплодника и рассматривают их в растворе хлоралгидрата или глицерина [31].
Приготовление срезов цельных семян. Несколько семян аналитической пробы выдерживают в воде в течение 24 часов или водяным паром в течение 30 минут или более в зависимости от твердости семени. Поперечные срезы производят с помощью салазочного микротома или бритвой от руки, разрезая каждое семя поперек его оси. Поперечный срез рассматривают под микроскопом, используя в качестве просветляющей жидкости раствор хлоралгидрата или глицерина.
В микропрепаратах поперечного среза семян должно быть видно, что верхний эпидермис состоит из палисадоподобных клеток, стенки которых пронизаны поровыми канальцами; наружные стенки клеток утолщены сильнее боковых. Сверху эпидермис покрыт тонким слоем кутикулы. Основная часть семенной кожуры представлена паренхимной тканью из клеток с утолщенными стенками. Клетки наружных рядов ее плотносомкнутые, более глубоких -рыхлые с крупными межклетниками разнообразной формы (рыхлая паренхима). По направлению к зародышу клетки паренхимы мельчают и спадаются, образуя слой сдавленных клеток, в котором находятся проводящие пучки. Глубже располагается слой из 4-5 рядов крупных продолговатых клеток паренхимы с тонкими стенками и темно-коричневым содержимым. Самый внутренний слой семенной кожуры (остаток эндосперма) в виде тонкой пленки из деформированных клеток. Эпидермис семядолей состоит из мелких клеток, ткань семядолей - из многоугольных плотносомкнутых паренхимных клеток, содержащих капельки жирного масла и крахмальные зерна. Преобладают крупные крахмальные зерна неправильно грушевидной формы, мелкие зерна -простые и двух-трехсложные (рис. 2.1.2.6).
Измельченные семена. Сырьем для производства конского каштана обыкновенного экстракта сухого служат измельченные семена (рис. 2.1.2.7).
Рис. 2.1.2.7. Измельченные семена конского каштана обыкновенного Для установления подлинности измельченных семян конского каштана обыкновенного методом микроскопии изучены несколько способов приготовления микропрепаратов. Один из них заключается в изучении под микроскопом поперечного среза наиболее крупных кусочков семян, находящихся в измельченном сырье (аналогично методике анализа цельного 1& 4 58 сырья). При этом микропрепарат должен соответствовать описаниям, представленного выше.
Анатомическое строение семени конского каштана обыкновенного (ув. х 200): фрагмент поперечного среза семени: 1 - эпидермис кожуры; 2 - клетки паренхимы кожуры с толстыми стенками; 3 - клетки губчатой паренхимы кожуры с толстыми стенками; 4 - клетки паренхимы кожуры с тонкими стенками; 5 - проводящий пучок кожуры; 6 - эпидерма семядолей; 7 - клетки паренхимы семядолей с крахмальными зернами Второй метод, рекомендованный техникой микроскопического и микрохимического исследования ЛРС ГФ XI предусматривает исследование соскоба с наружной и внутренней части крупных кусочков семян [31]. При рассмотрении микропрепарата порошка соскоба в растворе хлоралгидрата или глицерина должны быть видны фрагменты покровных тканей, клетки паренхимы, проводящие пучки, остатки эндосперма и эпидермиса семядолей, крахмальные зерна, капли жирного масла, межклетники.
Анализ дисперсного состава измельченного сырья конского каштана показал, что фракция частиц, проходящих сквозь сито с отверстия диаметром 0,25 мм, составляет около 11%. На приготовлении микропрепарата из частиц именно этой фракции основана третья методика для установления подлинности измельчённого сырья конского каштана методом микроскопии.
Из аналитической пробы отобрать около 20 г сырья и поместить его на набор сит с отверстиями размером 0,5 мм, 0,25 мм и просеить в течение 5 минут. Порошок на сите с отверстиями размером 0,25 мм используют для приготовления микропрепаратов. Аликвоту порошка шпателем поместить в стаканчик и прилить 2,5 % раствор NaOH, кипятить в течение 2 минут, а затем промыть водой. Далее небольшое количество порошка препаровальной иглой перенести на предметное стекло в каплю хлоралгидрата, накрыть покровным стеклом и рассмотреть под микроскопом. Для установления наличия крахмальных зерен небольшую часть порошка (непросев на сите с отверстиями размером 0,25 мм) внести в каплю воды.
При просмотре нескольких микропрепаратов в воде должны быть видны: фрагменты паренхимы семядолей с плотносомкнутыми клетками, наполненными крахмальными зернами; крахмальные зерна неправильной грушевидной формы в группах и по отдельности и капли жирного масла (рис. 2.1.2.8).
Тритерпеновые гликозиды
Методом ТСХ путем сравнения со стандартными образцами пятен и Rf в семянах конского каштана идентифицированы флавоноиды (рутин) и кумарины (эскулин и фраксин) (рис. 3.1.2.14). Rf=0,91 Rr=0,86 --е- R{=0, -ее -е Рис. 3.1.2.14. Схема ТСХ-хроматограммы. 1 - извлечение семян конского каштана обыкновенного, 2 - раствор ГСО рутина, 3 - раствор ГСО эскулина, 4 - раствор ГСО фраксина Навеску 1,0 г измельченных семян конского каштана обыкновенного помещают в коническую колбу, заливают 10 мл 70 % спирта и нагревают на водяной бане в течение 45 мин. Полученное извлечение фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса) и наносят микропипеткой по 0,01 мл на пластинку Silufol UV 254, Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ. Веществами сравнения (свидетелями) служат ГСО рутина, эскулина, фраксина. Пластинку с нанесенными пробами помещают в камеру, предварительно насыщенную системой растворителей хлороформ-метанол-вода (26: 14:3), и хроматографируют восходящим способом. После того, как фронт растворителей пройдет 10-12 см, пластинку вынимают из камеры, сушат на воздухе и просматривают УФ-свете при длине волны 254 и 366 нм. Затем разделенные вещества проявляют диазобензолсульфо-кислотой в насыщенном растворе натрия карбоната, сушат на воздухе. На хроматограмме испытуемого раствора должно проявиться пятно с Rf около 0,4 желтого цвета, соответствующее аналогичному пятну стандартного образца рутина, в УФ-свете видны светящиеся голубым цветом пятна с Rf около 0,86 и 0,91 соответствующие стандартным образцам эскулина и фраксина.
Являясь биологически активными веществами полисахариды, содержащиеся в лекарственном растительном сырье, широко используются для лечения и профилактики многих заболеваний. Вещества, относящиеся к этой группе, оказывают отхаркивающее, противовоспалительное, иммунотропное, противоопухолевое и другое действие [89].
Нами определено содержание полисахаридов гравиметрическим методом [32] согласно методике: Методика анализа:
Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм. Около 10 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляют 100 мл воды очищенной, колбу взвешивают с точностью до 0,01 г, подсоединяют к обратному холодильнику и кипятят при перемешивании на электрической плитке в течение 1 часа. Затем колбу взвешивают и потерю в массе доводят до исходной растворителем. Водное извлечение центрифугируют с частотой вращения 5000 об/мин в течение 10 мин, затем декантируют в мерную колбу вместимостью 100 мл, через 5 слоев марли, вложенной в стеклянную воронку диаметром 55 мм и предварительно промытой водой. Фильтр промывают водой и доводят объем раствора до метки (раствор А).
25 мл раствора помещают в центрифужную пробирку, прибавляют 75 мл 95 % спирта, перемешивают, подогревают на водяной бане до 30 С в течение 5 мин. Через 1 ч содержимое пробирки центрифугируют с частотой вращения 5000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость фильтруют под вакуумом при остаточном давлении 13-16 кПа через высушенный до постоянной массы при 100-105 С стеклянный фильтр ПОР 16 диаметром 40 мм. Осадок количественно переносят на фильтр и последовательно промывают 15 мл раствора 95% спирта в воде (3:1), 10 мл ацетона, 10 мл этилацетата. Фильтр с осадком сушат до постоянной массы в сушильном шкафу при 100-105 С и взвешивают.
Содержание суммы полисахаридов в пересчете на абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле: „ (т7- т.) 100 100 100 V — v Li ГЛЄ т 25 (100-Ж) m - масса измельченного сырья, г; mi - масса пустого фильтрата, г; т2 - масса фильтрата с осадком, г; W - объем экстракта, мл; 100 - разбавление. Т.о. получено, семена конского каштана содержат 41,62 % полисахаридов.
Качественный и количественный анализ состава моно- и дисахаридов семян конского каштана обыкновенного проводили методом ВЭЖХ (рис. 3.1.3.2.15), который заключается в пробоподготовке путем экстракции семян дистиллированной водой до концентрации Сахаров примерно 2-10 мг/мл, , фильтрования полученного раствора через капроновый или складчатый бумажный фильтры и введении аликвоты фильтрата в хроматограф [99].
Приготовление стандартных растворов Аналитические образцы фруктозы, глюкозы, галактозы, рибозы, ксилозы и сахарозы сушат до постоянного веса согласно ГОСТ 12570-67 «Сахар-песок и сахар-рафинад. Метод определения содержания влаги».
Готовят стандартные растворы фруктозы, глюкозы и сахарозы с концентрациями от 3 до 10 мг/мл в зависимости от чувствительности рефрактометрического детектора. Для этого навески Сахаров массой 1 г± 0,001 г или 0,3 г ± 0,001 г помещают в мерные колбы вместимостью 100 л, доводят бидистиллированной или дистиллированной фильтрованной через капроновый; фильтр марки 0,45 мкм RC водой до метки и тщательно перемешивают.
Готовят стандартный раствор смеси фруктозы, глюкозы и сахарозы, с массовыми долями каждого компонента 10 мг/мл или 3 мг/мл. Для этого навески Сахаров массой 1 г± 0,00Г г или 0,3 г ± 0,001 г помещают в одну мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят бидистиллированной или дистиллированной фильтрованной через капроновый фильтр марки 0;45 мкм RC водой до метки и тщательно перемешивают.
Изложение технологического процесса получения сухого экстракта
Объединенный экстракт порциями переносят в круглодонную колбу, которую соединяют с роторным испарителем. Упаривание ведут при температуре реакционной массы (60±5) С и давлении 0,09 МПа (0,9 кгс/см2) приблизительно до 1/16 первоначального объема. Для снижения вспенивания после удаления спирта добавляют 200 мл бутанола в конце упаривания.
В результате упаривания получают водный кубовой остаток (0,3 л) и отгон спирта этилового 72 % в количестве 3,64 л, который вновь используют для приготовления экстрагента — 70 % спирта. Водный кубовой остаток, содержащий действующие вещества, сливают в делительную воронку. ТП 2.4 Очистка этилацетатом концентрированного экстракта, отгонка этилацетата.
Концентрированный экстракт подвергают очистке от балластных веществ жидкофазной экстракцией с этилацетатам в делительной воронке два раза, при соотношении объемов водной и органической фаз 1:2. Этилацетат отгоняют, масляный экстракт помещают в контейнер и отправляют в отвал. Отгон этилацетата помещают в сборник и вновь используют для очистки концентрированного экстракта для последующей загрузки. Очищенный экстракт сливают в сборник и передают на ТП 2.5.
Сугика очигценного экстракта Очищенный экстракт сушат в вакуумном сушильном шкафу при температуре (60±5)С и остаточном давлении 0,1 кгс/см2. Удаление влаги происходит с помощью вакуума при нагревании водного экстракта в мягких условиях. Получают сухой твердый остаток в количестве 0,12 кг, который передают на ТП 6.6.
Измельчение сухого экстракта
Полученный твердый остаток высушенного экстракта измельчают при помощи ступки и пестика и просеивают через капроновое сито. Получают готовый продукт — конского каштана обыкновенного экстракт сухой в количестве 0,116 кг. Выход на стадии 90,44%. Выход от начала процесса 86,98 %. УМО 3. Фасовка, упаковка, маркировка сухого экстракта Полученный готовый продукт — конского каштана обыкновенного экстракт сухой после анализа на соответствие ТУ 9377-075-04868244-2008 расфасовывают по 100 г в банки оранжевого стекла типа БВ-1000-63-ОС-1 или БВ-2000-90-ОС-1 по ОСТ 64-2-71-80 с навинчиваемыми пластмассовыми крышками типа 1.1-90 снабженными прокладками из картона с двусторонним полиэтиленовым покрытием. Крышку сверху обтягивают пергаментом, обвязывают нитками хлопчатобумажными швейными, концы которых подводят под этикетку и заливают парафином. Банки обертывают бумагой. На банку и бумагу наклеивают этикетку из бумаги этикеточной или писчей. Каждую банку помещают в пачку из картона марки АК или типа хром-эрзац.
На основании проведенных загрузок оформлен и утвержден лабораторный регламент на производство конского каштана обыкновенного экстракта сухого ЛР 04868244-02-2008 (Приложение 7).
Готовый продукт — конского каштана обыкновенного экстракт сухой очищенный представляет собой аморфный гигроскопичный порошок желто-коричневого цвета со специфическим запахом. Основным действующим веществом является эсцин - тритерпеновый гликозид, стандартизуемый по основным четырем изомерам. В состав сухого экстракта очищенного входят также сахара, аминокислоты, флавоноиды и кумарины, микроэлементы.
Конского каштана обыкновенного экстракт сухой очищенный умеренно растворим в воде. Потеря в массе при высушивании 3,15 %. Содержание действующих веществ (эсцина) - более 15%.
В результате проведенных фармакологических исследований на белых крысах установлено, что конского каштана обыкновенного экстракт сухой очищенный обладает противовоспалительной антиэкссудативной активностью. Установлен дозозависимый эффект составляющий 13,3 - 32,1 % и 11,2 - 18,8 % соответственно дозам и возрастным группам животных. Сухой экстракт конского каштана обыкновенного на модели по методу Либерман (1972) в опытах на крысах Вистар экспериментального перитонита проявлял антиэкссудативную активность. Применение экстракта в дозе 100 мг/кг подавляет степень образования экссудата в брюшной полости на 28,2% , по сравнению с контрольной группой животных. Одним из механизмов развития воспалительного отека является увеличение проницаемости сосудов. В связи с эти представляло интерес изучить влияние сухого экстракта конского каштана на сосудистую проницаемость по методу Ойвина и Монаковой (1953) на белых мышах. Анализ полученных данных показал, что сухой экстракт семян конского каштана в дозе 100 мг/кг способствует уменьшению проницаемости сосудистой стенки кожи мышей, достоверно тормозит, выход сини в очаг воспаления. Проведено изучение влияния сухого экстракта семян конского каштана на ломкость капилляров брыжейки у крыс по методы Гриффитса в модификации Мещерской - Штейнберг и Богдановой (1950). Сухой экстракт семян конского каштана в дозах 50 и 100 мг/кг достоверно снижает количество проявленных петехий, что свидетельствует об уменьшении ломкости и повышению резистентности капилляров брюшной полости крыс.
Таким образом, сухой экстракт очищенный семян конского каштана является фармакологически активным веществом. Ведущим является противовоспалительное действие, что проявляется в значительном уменьшении степени развития формалинового отека у экспериментальных животных. Одновременно с этим сухой экстракт понижает проницаемость сосудов кожи и ломкость капилляров, вызывая удлинение времени выхода трепановои сини из сосудов кожи и уменьшение количества петехий в брыжейке (Приложение 8).
С целью характеристики сухого экстракта конского каштана как технологической субстанции изучены его технологические свойства: насыпная масса при свободном падении 0,66 г/см , насыпная масса при уплотнении 0,83 г/см . Сыпучесть — 6,0 г/с. Угол естественного откоса 32.
Упаковка. По 0,1 кг и 0,5 кг в банки оранжевого стекла с навинчиваемыми пластмассовыми крышками, снабженными прокладками из картона с двусторонним полиэтиленовым покрытием. Крышку сверху обтягивают пергаментом, обвязывают нитками хлопчатобумажными швейными, концы которых подводят под этикетку и заливают парафином. Банки обертывают бумагой. На банку и бумагу наклеивают этикетку из бумаги этикеточной.
