Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Изучение эволюционной истории видов растений с помощью генетических маркеров 10
1.1. Послеледниковая реколонизация Северной Евразии лесными видами и её генетические эффекты 10
1.2. Популяционные эффекты гибридизации у растений и их изучение. 17
1.3. Молекулярные маркеры, используемые в популяционно- генетических и филогенетических исследованиях растений 20
Глава 2. Виды larix и изучение их изменчивости 41
2.1. Ареалы и систематика лиственниц 41
2.2. Геологическая история лиственниц 44
2.3. Фенотипическая изменчивость лиственниц 49
2.4. Изучение генетической изменчивости лиственниц с применением молекулярных и кариологических методов 50
Глава 3. Материалы и методы 55
3.1. Материалы и методы, использованные при изучении генетической изменчивости видов Larix с помощью аллозимного анализа 55
3.2. Материалы и методы, использованные при изучении генетической изменчивости видов Larix на видовом уровне с помощью анализа ДНК 62
3.2.1. Материалы и методы, использованные в анализе генетической изменчивости с помощью AFLP 65
3.2.2. Материалы и методы, использованные в анализе изменчивости хлоропластной ДНК с помощью микросателлитных локусов 66
3.2.3. Методы, использованные в анализе изменчивости митохондриальной ДНК с помощью методик Саузерн-блот и ПЦР-
ПДРФ 69
3.2.4. Материалы и методы, использованные при изучении структуры популяций лиственницы сибирской с помощью анализа изменчивости митохондриальной ДНК (посредством вновь разработанных маркеров) 72
3.3 Материалы и методы, использованные в анализе филогении видов Larix 81
Глава 4. Внутри - и межвидовая структура генетической изменчивости ядерного, хлоропластного и митохондриального геномов лиственниц северной евразии и северной америки, её связь с прошлой и современной динамикой популяций 90
4.1. Структура изменчивости ядерных ко доминантных маркеров (аллозимные локусы) видов Larix 91
4.2. Анализ генетической изменчивости видов Larix с помощью маркеров AFLP 111
4.3. Результаты изучения изменчивости хлоропластной ДНК с помощью микросателлитных локусов 120
4.4. Результаты анализа изменчивости митохондриальной ДНК в популяциях североевроазиатских видов Larix, проведенного с использованием методик Саузерн-блот и ГЩР-ПДРФ. Сравнение с данными по хлоропластному и ядерному геномам 129
Глава 5. Структура изменчивости митохондриальной днк и послеледниковая история лиственницы сибирской (larixsibiricaledeb.) 155
5.1. Генетическая изменчивость 155
5.2. Изменчивость в маргинальных популяциях 161
5.3. Пространственное распределение гаплотипов внутри популяции... 162
5.4. Географическое распределение гаплотипов и историко-
географические интерпретации 162
Глава 6. Реконструкция филогении видов larix на основе изменчивости хлоропластной и ядерной ДНК . 177
6.1. Результаты 180
6.1.1. Изменчивость хлоропластной ДНК 180
6.1.2. Реконструкция филогении на основании изменчивости фрагментов AFLP 183
6.2. Обсуждение 184
Заключение и основные выводы 193
Литература 198
Приложение 237
- Послеледниковая реколонизация Северной Евразии лесными видами и её генетические эффекты
- Изучение генетической изменчивости лиственниц с применением молекулярных и кариологических методов
- Материалы и методы, использованные при изучении генетической изменчивости видов Larix на видовом уровне с помощью анализа ДНК
- Структура изменчивости ядерных ко доминантных маркеров (аллозимные локусы) видов Larix
Введение к работе
Величина и структура генетической изменчивости видового уровня является результатом взаимодействия ряда факторов. В случае селективно нейтральной изменчивости, к которой, в большинстве случаев, можно отнести изменчивость, выявляемую молекулярными методами, важнейшим из этих факторов является история данного вида: возникновение и исчезновение в прошлом барьеров, дифференцирующих вид на отдельные популяции, взаимодействие этих популяций между собой и с популяциями других видов, флуктуации их численностей.
Очевидно, что главной движущей силой подобных изменений является динамика климата и ландшафтов. Прогресс в развитии молекулярно-генетических методов позволяет анализировать существенную долю генетической изменчивости тех или иных организмов и, соответственно, выявлять в ней «импринт», сигнал исторических процессов. Такой подход к анализу генетической изменчивости, учитывающий географию и историю популяций объекта исследования, известен как филогеография (Avise, 2000). Среди ярких примеров использования этого метода находятся исследования митохон-дриальной ДНК, Y-хромосомы и микросателлитных локусов в популяциях Homo sapiens, доказавшие африканское происхождение современного человека и его недавний популяционный рост (Avise, 2000).
Около 2 млн. лет биота умеренных широт находится под жестким давлением климатических циклов оледенений и межледниковий. Эти флуктуации сильнейшим образом влияют на расположение ареалов и демографию видов животных и растений. Филогеографические исследования многих представителей европейской и североамериканской биот выявили «патгэрны» структуры генетической изменчивости, указывающие на расположение ледниковых рефугиумов (убежищ, где теплолюбивые виды скрывались в холодные эпохи), и на пути их расселения из этих рефугиумов в послеледниковое время (Comparative phylogeography..., 1998; Hewitt, 2000). Результаты этих исследо-
5 ваний дополняют данные палеогеографии, полученные с помощью стратиграфии, палинологии, палеозоологии и т.д., что важно в связи с присущими последним методам ограничениями, главное из которых - неполнота наблюдений.
В отличие от Западной Европы и Северной Америки, палеогеография и филогеография видов животных и растений востока Северной Евразии изучена недостаточно.
В настоящей работе я представляю результаты изучения структуры генетической изменчивости представителей рода Larix - важных элементов боре-альных лесов Северной Евразии и Северной Америки. При этом анализируются два уровня организации популяций - видовой уровень, и надвидовой. На первом уровне я рассматриваю главным образом генетическую структуру популяций внутри видов и предлагаю естественно-исторические объяснения полученных данных. Второй уровень соответствует систематике рода Larix, и здесь я представляю результаты филогенетических реконструкций и их возможные биогеографические интерпретации.
Цели исследования.
Перед исследованием были поставлены следующие задачи:
Оценить величину и структуру изменчивости маркеров ядерного генома (аллозимы и AFLP), хлоропластного генома (хлоропластные микроса-теллитные локусы, cpSSRs) и митохондриального генома (Саузерн-блот и PCR-RPLP) у наиболее распространенных видов Larix.
Проверить гипотезу о подразделенности сибирской лиственницы на две географические расы - западную (L. sukaczewii) и восточную (L. sibirica).
Определить возможные области расположения ледниковых рефугиу-мов лиственницы сибирской и пути её расселения по современному ареалу.
Исследовать характер генетического взаимодействия лиственниц сибирской и даурской и особенности генетических потоков, связанных с переносом пыльцы и семян в зоне интрогрессивной гибридизации этих видов.
Исследовать генетическую структуру восточно-сибирских и дальневосточных лиственниц, определить генетические взаимоотношения отдельных видов, проверить гипотезу о гибридном происхождении некоторых дальневосточных популяций.
Изучить филогению видов Larix, подтвердить или опровергнуть гипотезу о конфликте филогенетических реконструкций, основанных на хлоропластнои и ядерной ДНК.
Научная новизна. В работе впервые получены сравнимые данные по аллозимной изменчивости у большинства видов лиственниц. Впервые изучена структура изменчивости хлоропластнои, митохондриальнои и ядерной ДНК видов Larix. Впервые для популяционных исследований лиственниц применены такие молекулярные маркеры, как RFLP (полиморфизм длин ре-стриктных фрагментов) с использованием метода Саузерн-блот, PCR-RFLP (рестриктный анализ ПЦР-продукта), анализ хлоропластных микросателлит-ных локусов, AFLP (полиморфизм длин амплифицированных фрагментов). Впервые найдено генетическое подтверждение существования западной расы сибирской лиственницы - лиственницы Сукачева (L. sukaczewii). Впервые с помощью генетических маркеров трёх геномов - ядерного, хлоропластного и митохондриального - изучены популяции в зоне интрогрессивной гибридизации лиственниц сибирской и даурской. Впервые получено генетическое подтверждение интрогрессивной гибридизации между лиственницами Дальнего Востока и Восточной Сибири и гибридного происхождения некоторых ранее выделенных таксонов. Впервые для хлоропластного и ядерного геномов получены филогенетические реконструкции рода Larix, имеющие высокое разрешение. Впервые для филогенетических реконструкции лиственниц использованы маркеры AFLP и PCR-RFLP.
7 Практическое значение
Результаты исследований имеют важное значение для разработки программ по сохранению генетического разнообразия лесообразующих видов, поскольку выявляют исторически обособленные, уникальные группы популяций, нуждающиеся в сохранении их генетической самобытности.
Результаты исследований могут быть использованы в ВУЗах для преподавания ботаники, популяционной генетики, экологии, биогеографии и лесоведения.
На защиту выносятся следующие положения:
Подобно многим ветроопыляемым видам растений, имеющим большие размеры популяций и протяженные ареалы, лиственницы характеризуются значительной внутрипопуляционнои изменчивостью и невысокой долей межпопуляционного внутривидового разнообразия по ядерным генетическим маркерам. В то же время по цитоплазматическим маркерам внутрипопуляци-онная изменчивость может быть снижена, а доля межпопуляционного разнообразия - увеличена, по сравнению с ядерными маркерами.
Характер дифференциации популяций лиственницы сибирской по ядерным, хлоропластным и митохондриальным генетическим маркерам подтверждает самостоятельность её западной расы - лиственницы Сукачева, а генетические отношения митохондриальных гаплотипов лиственниц сибирской и Сукачева указывают на происхождение последней от сибирской лиственницы.
3. Географическое распределение митохондриальных гаплотипов у лист
венницы сибирской позволяет делать выводы о расположении рефугиумов
лесной растительности во время последнего оледенения. Выделяются облас
ти, населенные популяциями, имеющими относительно однородные частоты
митохондриальных гаплотипов:
Урал и прилегающие территории Западной Сибири,
Алтай и Тянь-Шань,
район, примыкающий к южной оконечности Байкала,
8 оставшаяся часть ареала сибирской лиственницы. Наличие этих группировок популяций, вероятно, обусловлено их индивидуальным происхождением из отдельных популяций - рефугиумов. В частности, единство пула митохондриальных гаплотипов севера Сибири и саянских популяций может быть объяснено расселением лиственницы в послеледниковое время из горных рефугиумов юга Сибири, а сходство популяций Алтая и Тянь-Шаня позволяет предполагать их общее послеледниковое происхождение.
Асимметрия в пространственном распределении ядерных видоспеци-фичных маркеров, митохондриальных и хлоропластных гаплотипов в зоне интрогрессивной гибридизации лиственниц сибирской и даурской подтверждает вывод о вытеснении первого вида вторым.
В гибридной популяции обнаружены гаплотипы, возникшие путем рекомбинации митохондриальных гаплотипов сибирской и даурской лиственниц.
Структура изменчивости митохондриальной и ядерной ДНК проливает свет на взаимоотношения сибирских и дальневосточных лиственниц: ми-тохондриальные гаплотипы ольгинскои лиственницы являются предковыми по отношению к гаплотипам сибирской, даурской и камчатской лиственниц. На Дальнем Востоке имеется зона интрогрессивной гибридизации лиственниц даурской и ольгинскои. Гибридные популяции имеют промежуточные, по отношению к родительским видам, значения частот аллозимных локусов, у них были специфичные митохондриальные гаплотипы, предположительно являющиеся продуктами рекомбинации гаплотипов родительских видов. В то же время подтверждается генетическая самостоятельность популяций юга Сахалина (L. kamtschatica) и популяция окрестностей г. Магадана (L. ochoten-sis).
Филогенетические реконструкции рода Larix, основанные на изменчивости ядерной ДНК и хлоропластной ДНК, были не конгруэнтны в отношении позиции лиственницы сибирской. В остальном обе реконструкции COOT-
9 ветствуют друг другу и позволяют сделать выводы об истории происхождения современных таксонов.
Благодарности: Автор выражает сердечную благодарность профессору М.Ласко и доктору У. Лагеркранцу за сотрудничество в проведении исследований и поддержку, а также д.б.н. Н.В.Глотову, д.б.н. А.И.Ирошникову, д.б.н. Ю.Н.Исакову, к.б.н. П.В.Куликову, д.б.н. С.Н.Санникову, к.б.н. В.Б.Федорову, к.б.н. Филиппову, д.б.н. С.Г.Шиятову за помощь в сборе материала и плодотворное обсуждение полученных результатов. Исследование поддержано грантами РФФИ№ 04-04-48604, № 94-04-12282-а, INTAS (проект № 2001-0358) и грантом Шведской академии наук.
Послеледниковая реколонизация Северной Евразии лесными видами и её генетические эффекты
Последний ледниковый максимум
Климату Земли характерны значительные циклические колебания с периодами порядка 100 000 лет, обусловленные особенностями орбитального движения планеты (Bennett, 1997). Эти циклы, выражающиеся в периодическом расширении площадей континентальных покровных оледенений, являлись главной силой, изменяющей животный и растительный мир Земли на протяжении всего четвертичного периода.
В ходе последнего ледникового цикла наибольшее понижение глобальных температур имело место около 18 00014С лет тому назад, в период, обозначаемый как LGM (last glacial maximum). В это время значительная часть Северной Америки, Скандинавия и часть шельфа северных морей были заняты покровными ледниками. Горное оледенение охватывало Альпы, Пиренеи, Таймыр, Верхоянский хребет и некоторые другие горные массивы. В то же время Восточная Европа, Сибирь и Дальний Восток были в основном свободны ото льда (Развитие ландшафтов..., 1993; Bennett, 1997; Velichko et al., 1997). Однако в это время даже территории, удаленные от края ледника, имели суровые условия, не пригодные для существования растительности современного облика (Mid-Holocene..., 2000). Южная и часть центральной Европы была покрыта травянистыми и кустарниковыми растительными сообществами (Pollen-based boime..., 2000), сменяющимися к северу на тундру (Huntley et al., 1983). Восточная Европа, Урал и Сибирь также были заняты тундрово-степной растительностью, и только вокруг Средиземного моря, в Карпатах, на северном побережье Черного моря, на Кавказе, на Южном Урале, в Монголии, на юге Дальнего Востока климатические условия позволяли сохра 11 няться рефугиумам древесной растительности (Last glacial maximum..., 2000). На основе анализа палинологических данных по 22 видам Huntley et al. (1983) отмечают для Европы по крайней мере семнадцать возможных рефу-гиальных областей.
Несмотря на то, что доминирующая растительность там были степь или тундра, древесные виды могли сохраняться локально, возможно, в горах на умеренных высотах (Pollen-based biome..., 2000). Молекулярные и палеонтологические данные доказывают, что Иберийский, Апеннинский и Балканский п-ова были основными рефугиумами древесных видов в Европе, хотя для некоторых видов были важны также и более восточные рефугиальные области (Hewitt, 1999; Comparativephylogeography..., 1998).
В частности, рефугиумы лесной растительности могли находиться на Южном Урале, на что указывает присутствие в пещерных отложениях того возраста фоссилиев лесных видов животных (Кузьмина, 2006). Также есть основания допускать сохранение лесных рефугиумов в LGM в южной части Сибири, Урала, Дальнего Востока и в Монголии (Боярская, 1989; Малаева, 1987,1989; Last glacial maximum..., 2000).
Помимо относительно южных районов, рефугиумы бореальных видов деревьев и кустарников могли сохраняться также и в более северных широтах, иногда даже вблизи края ледника: в Скандинавии, на севере Сибири и в Берингии (Кременецкий, 1994; Kullman, 2002; Beringia as..., 2005). Однако, поскольку выводы о наличии высокоширотных рефугиумов часто вступают в противоречие с множеством палеогеографических фактов (Birks et al., 2005), необходимо иметь дополнительные палеонтологические и молекулярные данные для более определенных выводов относительно реальности лесных рефугиумов в высоких широтах.
Пути послеледниковых миграций элементов лесной биоты Повторяющиеся в течение четвертичного периода циклы оледенений и межледниковий оказывали серьёзнейшее воздействие на эволюцию и распре 12 деление видов растений и животных Северного Полушария. В ходе межлед-никовий (таких, как голоцен), многие лесные виды имели огромные ареалы и размеры популяций, в то время как в ходе оледенений их ареалы и популяции были ограничены размерами рефугиумов. Арктические виды имели противоположный характер популяционной динамики (Molecular analysis..., 2000).
В начале каждого межледниковья лесные виды расселялись из своих рефугиумов, формируя новые популяции. При начале следующего оледенения эти новые популяции, как правило, исчезали без каких-либо эволюционных последствий для популяций рефугиумов (Bennett, 1991), хотя для некоторых видов (Pinus sp., Betula sp.) по палинологическим данным отмечаются обратные волны миграций - из северных популяций в южные районы (Bennett, 1991).
Изучение генетической изменчивости лиственниц с применением молекулярных и кариологических методов
Решение популяционно-генетических задач, включая вопросы систематики, экологической генетики, биогеографии и систем репродукции требует наличия инструмента исследования - маркеров генетической изменчивости.
Отсутствие или недостаток маркеров, имеющих простое генетическое наследование, вызывает необходимость использования изменчивых морфологических признаков. Несмотря на значительные трудности их использования - необходимость вычленения средовой и эндогенной компонент в проявлении признака, наличие взаимодействия генотип-среда, полигенный характер проявления большинства признаков и их эпигенетическое взаимодействие - применение анализа морфологической изменчивости позволяло решать задачи популяционных исследований видов растений и животных и формулировать гипотезы, направляющие дальнейшие исследования с использованием молекулярно-генетических маркеров (Мамаев, 1972; Махнев, 1987; Семериков, 1986; Путенихин и др., 2004).
Изучение фенотипической изменчивости сибирских и дальневосточных видов лиственниц (Колесников, 1946; Дылис, 1947, 1959,1961; Круклис, Милютин, 1977; Путехинин и др., 2004) выявило некоторые черты географической структуры популяций этих видов и позволило сформулировать ряд гипотез, касающихся истории, систематики, эволюции этих видов, гибридных процессов, происходящих в зонах контактов ареалов видов и долговременных трендов в их фитоценотических позициях.
Опираясь на огромный массив данных по изменчивости морфометриче-ских признаков генеративных и вегетативных органов образцов лиственницы сибирской, собранных практически со всего ареала, Н.В. Дылис (1947) исследовал географические закономерности этой изменчивости. Была показана дифференциация сибирской лиственницы на западную (L. sukaczewii) и восточную (L. sibirica) географические расы и очерчены их границы (Дылис, 1947). Также на основе изучения пространственного распределения видо-специфических морфологических признаков была подробно исследована зо 50 на интрогрессивной гибридизации между даурской и сибирской лиственницами, и изучен характер изменчивости признаков внутри неё (Дылис, 1959; Круклис, Милютин, 1977).
Было изучено многообразие морфологических форм лиственниц Восточной Сибири и Дальнего Востока (Колесников, 1946; Дылис, 1961). Показано, что наибольшей величины оно достигает на юге Дальнего Востока и вдоль побережья Японского и Охотского морей. Эти работы, благодаря большому фактическому материалу, дали возможность описать границы распространения бесспорных видов - лиственниц даурской, ольгинской и камчатской, выявить внутривидовую структуру отдельных видов, высказать предположение о генетической самостоятельности лиственницы охотского побережья (Колесников, 1946), сформулировать гипотезу о роли интрогрессивной гибридизации в формировании структуры изменчивости дальневосточных лиственниц.
В то же время неизвестный характер генетического контроля морфологических признаков и возможная селективная значимость некоторых из них (Дылис, 1961) делают неопределенным надежность основанных на этих признаках выводов.
Использование морфологии хромосом лиственниц, с целью выявления видоспецифичных признаков, изучения естественной гибридизации, изучения реакции генома на экологический фон и анализа филогенетических взаимоотношений видов поводилось на протяжении около 30 лет в нашей стране и за рубежом (Круклис, Милютин, 1977; Nkongolo, 1995; Путенихин и др. 2004; Кариологический..., 2006; Molecular cytogenetic analysis..., 2006). Внутривидовая изменчивость и видовые особенности изучались у многих Larix (см. обзор Путенихин и др., 2004). На фоне относительного однообразия рода по кариотипам, выявляются некоторые отличия видов по морфоло 51 гии хромосом: лиственниц сибирской и даурской (Круклис, Милютин, 1977), сибирской и Сукачева (Муратова, Чубукина, 1985; Муратова и др, 1988; Муратова, 1991, 1995). Обнаружена также внутривидовая межпопуляционная изменчивость по кариологическим признакам у лиственницы Сукачева (Муратова, Чубукина, 1985; Путенихин и др., 2004), у лиственницы сибирской (Муратова, 1991, 1995), у лиственницы даурской (Круклис, Милютин, 1977; Муратова, 1994), у лиственниц Приморья (Ильченко, 1973, 1975, 1978). Изучение морфологии хромосом лиственницы на Камчатке (Муратова, 1995) выявило определенные кариотипические отличия её от лиственниц Гмелина и Каяндера.
Молекулярные исследования видов лиственниц с целью оценки генетической изменчивости, изучения популяционной структуры, гибридогенных процессов и филогенетических реконструкций проводились с конца 80-х годов в России и за рубежом.
Наиболее многочисленны исследования аллозимного полиморфизма (Cheliak et al., 1988; Аллозимный полиморфизм..., 1989; Lewandowski, Mejnartowicz, 1990, 1991а, 1991b, 1991с, 1997; Liu, Knowles, 1991; Ying, Morgenstern, 1991; Majer, 1992; Farmer, 1993; Семериков, Матвеев, 1995; Study of natural..., 1995; Потенко, Разумов, 1996; Timerjanov, 1997; Генетическая структура уральских..., 1998; Semerikov et al., 1999; Semerikov, Lascoux, 1999; Zhao et al., 2001; Путенихин и др., 2004; Ларионова и др., 2004; Ореш-кова, Ларионова, 2006).
Материалы и методы, использованные при изучении генетической изменчивости видов Larix на видовом уровне с помощью анализа ДНК
Использованный материал 29 популяции видов Larix: L. decidua, L. sukaczewii, L. sibirica, L. gmelinii, L. olgensis, L. kamtschatica, L. leptolepis и L. laricina были представлены образцами хвои и семян (Табл. 3.2., Рис. 4.10.). Собранная хвоя первоначально хранилась в жидком азоте, а затем при -70С. Данный материал был использован в анализах изменчивости ядерного, хлоропластного и митохондриального геномов с применением AFLP, хлоропластных микросателлитов, Саузерн-блот и ПЦР-ПДРФ методов. Изоляция ДНК
ДНК выделялась из 0.2-0.5g хвои в соответствии с протоколом (A genetic linkage map..., 1996, цит. Optimizing conditions..., 1998) с небольшими модификациями: растертую в жидком азоте хвою (0.1 - 0.5 г) смешивали с 5 мл экстрагирующего буфера (ЮОтМ TrisHCl 8.0, 5тМ EDTA, 0.35М сорбитол, 0.1% бычий альбумин, 0.1% меркаптоэтанол, 0.1% аскорбиновая кислота, 10% полиэтиленгликоль (mt 8000), 1% N-лаурилсаркоцин) и инкубировали при комнатной температуре 10 минут. Затем в смесь добавляли 5М NaCl и 10% СТАВ (цетилтриметил-аммониум бромид) для получения финальной концентрации 1.4М и 2% соответственно и инкубировали 60 мин при 65, периодически перемешивая. Далее гомогенат дважды экстрагировали смесью хлороформа и изоамилового спирта (24:1) с примерно равным соотношением гомогената и смеси. После преципитации нуклеиновых кислот с помощью 0.6 объема изопропанола в течение 30 мин при комнатной температуре и
центрифугирования осадок промывали 70% этанолом, подсушивали при открытых крышках пробирок и растворяли в 400 мл буфера ТЕ (рН 7.5). После обработки КЫАзой (400 мкг/мл) в течение 30 мин при 37С, раствор ДНК экстрагировали дважды смесью фенола, хлороформа и изоамилалкоголя (25:24:1), и один раз смесью хлороформа и изоамилалкоголя (24:1), добавляли ацетат натрия до получения концентрации 0.3 М и преципитировали ДНК двумя объёмами этанола в течение 2 часов при -20С. После центрифугирования ДНК промывали 0.5мл 70% этанолом, подсушивали в открытых пробирках и растворяли в 50 мкл буфера ТЕ (рН 7.5). В случае семенного материала, ДНК выделялась из 1 месячных сеянцев тем же путем. После измерения концентрации ДНК с помощью флуорометра Hoefer DyNaQuant 200, были приготовлены образцы ДНК с концентрацией Юнг/мкл в буфере ТЕо.ь (10тМ трис-HCl рН 8.0,0.lmM EDTA).
Протокол AFLP (AFLP..., 1995) включал пять этапов. 1) Рестрикция ДНК двумя рестриктазами - EcoRl и Ms el с одновременным лигированием адаптеров. Адаптер Есо состоял из двух олигонуклеоти-дов: EI-ol.1 - CTCGTAGACTGCGTACC и EI-ol.2 AATTGGTACGCAGTC. Адаптер Mse состоял из Msel-ol.l GACGATGAGTCCTGAG и Msel-ol.2 TACTCAGGACTCAT. 2) ПНР амплификация получившихся фрагментов с помощью преселек-тивных праймеров, несущих два селектирующих нуклеотида Есо-рге AGACTGCGTACCAATTC+AC и Msel-pre GATGAGTCCTGAGTAA+CC. 3) Амплификация разбавленных продуктов с помощью трёх пар селективных праймеров Eco+ACG, Mse+CCTC; Eco+ACG, Mse+CCAC; Eco+ACG, Mse+CCCA. Праймер Есо был радиоактивно меченым с помощью у Р АТР. 4) Электрофоретическое разделение фрагментов в денатурирующем 6% полиакриламидном геле.
Радиоавтография геля. Анализ данных
В результате интерпретации радиоавтографов была получена матрица бинарных признаков присутствия-отсутствия фрагментов у каждого индивидуума размером 188 фрагментов на 361 индивидуум. Дальнейший анализ проводился с помощью программы GenAlEx 6 (Peakall, Smouse, 2005), NTSYS-pc v. 2.02h (Rohlf, 1998) и PHYLIP (ver. 3.6. http://evolution.gs.washJrigton.edu/phvlip.html, Felsenstein, 1993))
Для визуализации генетических отношений между индивидуумами вычислялись генетические расстояния методом Huff et al. (1993), и на их основании проводился анализ главных координат (РСА). Для популяционных сравнений применялся РСА, использующий генетические дистанции Ней (1972), вычисленные на основании частот фрагментов в популяциях. Использовалась также кластеризация популяций с помощью метода невзвешенных парно-групповых средних (UPGMA). В этом случае статистическая поддержка групп оценивалась методом «bootstrap» с использованием 100 bootstrap -репликаций исходных частотных данных. Нуклеотидная изменчивость во всех изученных видах оценивалась с использованием метода Irman et al. (1999).
Структура изменчивости ядерных ко доминантных маркеров (аллозимные локусы) видов Larix
В данной главе рассмотрены результаты изучения генетической изменчивости внутри и между родственными таксонами, и обсуждаются выводы, касающиеся истории лиственниц Северной Евразии, путей послеледниковых миграций и процессов межвидовой гибридизации. Данные включают результаты изучения аллозимнои изменчивости лиственниц Северной Евразии и Америки, опубликованные в (Аллозимный полиморфизм..., 1989; Семериков, 1993, 1998; Семериков, Матвеев, 1994,1995; Semerikov et al., 1999; Se-merikov, Lascoux, 1999), анализа изменчивости ядерной, хлоропластной и ми-тохондриальной ДНК североевроазиатских лиственниц, проведенные с помощью методов AFLP, хлоропластных микросателлитов, ПЦР-ПДРФ и Сау-зерн-блотинга (Semerikov, Lascoux, 2003).
Эта часть исследования была направлена на решение следующих задач:
1. Сравнить параметры генетической изменчивости изученных видов лиственниц с использованием общего набора аллозимных локусов.
2. Установить: обособлены ли генетически популяции L. sibirica, обитающие на Урале и в европейской России (L. sukaczewii Dyl.), от популяций восточной части ареала. Сравнить уровни генетической изменчивости в этих двух таксонах, изучить их происхождение и генетические связи между ними.
4. Исследовать характер генетического взаимодействия лиственниц сибирской и даурской в зоне интрогрессивной гибридизации и особенности генетических потоков, связанных с переносом пыльцы и семян.
5. Исследовать генетическую структуру восточносибирских и дальневосточных лиственниц, определить генетические взаимоотношения отдельных видов, проверить гипотезу о гибридном происхождении части дальневосточ ных популяций, подтвердить или опровергнуть генетическую самостоятельность некоторых таксонов.
Некоторые особенности изоэнзимову видов Larix
Необычный характер зимограммы был получен в локусе G6pdh у L. laricina: в дополнение к аллелям, общим с другими видами Larix, наблюдались дополнительные неопределенные электроморфы. Аналогичные проблемы в G6pdh возникали в исследовании Cheliak & Pitel (1985), где наблюдались "негенетические модификации", предположительно обусловленные, по мнению исследователей, хранением семян. Однако, поскольку диффузные «бэнды» обнаруживались не только на зимограммах мегагаметофитов и эмбрионов семян, но и у проростков и у хвои молодых растений, такое предположение кажется маловероятным. В связи с этим, локус G6pdh у L. laricina в анализе не использовался. У L. laricina, L. occidentalis и L. lyallii дополнительно проанализирован Fdh.
В случае диплоидных тканей нуль-аллели могут быть обнаружены только в гомозиготном состоянии. Высокая частота гомозигот по нуль-аллелю была обнаружена в локусе Skdh у L. occidentalis. Для вычисления его частоты использовался алгоритм ЕМ (Lange, 1997), предполагая равновесие по Хар-ди-Вайнбергу. Кроме L. occidentalis, такая гомозигота была встречена только один раз, в потомстве одного дерева L. sibirica из популяции № 10 (Яда): экстракт сеянца не показал активности в анализируемом локусе Skdh и, соответственно, сеянец рассматривается как гомозигота по нуль-аллелю в этом локу-се. Дополнительный анализ мегагаметофитов семян материнского дерева подтвердил, что оно является гетерозиготой по нуль-аллелю. Аллели Skdh-82 и Skdh-1\ со средней частотой 60% и 2%, соответственно, и с резко сниженной активностью ("semi-null alleles"), обнаружены у L. decidua.
Полиморфизм
Среднее число аллелей А, процент полиморфных локусов Р, наблюдаемая #obs и ожидаемая Яехр гетерозиготности представлены в Табл. 4.1., частоты аллелей полиморфных локусов представлены в Табл. 1А (Приложения).
Имеется тенденция к снижению генетической изменчивости у видов, имеющих ограниченные ареалы, таких, как лиственницы ольгинская и субальпийская (Нехр =0.088 и 0.094, соответственно), хотя вид, также имеющий ограниченный ареал - лиственница европейская - имел одни из наивысших значений этих параметров: ожидаемая гетерозиготность в двух популяциях была Hgxp =0.134 и 0.194, соответственно. В то же время, L. laricina, хотя и имеет один из наибольших среди изученных лиственниц размер ареала, тем не менее характеризуется весьма невысокой изменчивостью (Я = 0.048-0.100)
Довольно сходные значения параметров полиморфизма (среднее число аллелей, процент полиморфных локусов, наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготности) обнаружены у евроазиатских видов и L. occidentalis. Заметно более низкие параметры были получены у ряда популяций L. olgen-sis, L. lyalliiuL. laricina (см. Табл. 4.1.).
Оценки генетической изменчивости видов Larix (настоящее исследование и литературные данные).
Большой разброс значений, приводимых в разных исследованиях для одного вида (если такие оценки имеются), контрастирует с относительно небольшими различиями в оценках, даже между разными видами, полученными в одном исследовании (Табл. 4.2.). Так, для европейской лиственницы оценки Нехр варьируют по литературным данным от 9.5% (Zhao et al., 2001) до 22.3% (Maier, 1992). По нашим данным - только 13.4 - 19.4%. Для L. occidentalis оценки Нехр варьировали в пределах от 6.1% (Fins, Seeb, 1986) до 18.8% (Jaquish, El-Kassaby, 1998).
