Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 8
1.1 Биологические особенности, эволюция, систематика и распространение рода Larix 8
1.2 Изучение изменчивости, дифференциации и филогении родаХяга: 18
1.3 Палеогеография Дальнего Востока в позднем плейстоцене и голоцене 28
1.4 Генетические эффекты послеледниковой реколонизации. Использование генетических цитоплазматических маркеров для их изучения .31
ГЛАВА 2. Материалы и методы 36
2.1 Видовой состав, характеристика и локализация выборок 36
2.2 Материалы и методы, использованные в анализе генетической изменчивости
хлоропластных микросателлитов и маркеров митохондриальной ДНК 41
ГЛАВА 3. Изменчивость хлоропластных микросателлитов у видов Larix дальнего востока России 49
3.1 Полиморфизм микросателлитных локусов хлоропластной ДНК. Внутрипопуляционная изменчивость 49
3.2 Межпопуляционная и пространственная дифференциация 56
ГЛАВА 4. Изменчивость маркеров митохондриальной ДНК Larix дальнего востока России 65
4.1 Полиморфизм маркеров митохондриальной ДНК. Внутрипопуляционная изменчивость 65
4.2 Межпопуляционная и пространственная дифференциация 75
ГЛАВА 5. Генетическая изменчивость, дифференщация и биогеография лиственниц дальнего востока России 81
5.1 Генетическая изменчивость и дифференциации изученных популяций лиственниц 81
5.2 Биогеография лиственниц Дальнего Востока России на основе структуры изменчивости маркеров митохондриальной и хлоропластной ДНК 84
Выводы 97
Список литературы 98
Приложения 122
- Биологические особенности, эволюция, систематика и распространение рода Larix
- Видовой состав, характеристика и локализация выборок
- Полиморфизм микросателлитных локусов хлоропластной ДНК. Внутрипопуляционная изменчивость
- Полиморфизм маркеров митохондриальной ДНК. Внутрипопуляционная изменчивость
Введение к работе
Актуальность темы. Лиственница - одна из важнейших в экологическом и экономическом отношениях бореальных хвойных пород нашей страны и основная лесооб-разующая порода на территории Дальнего Востока России.
Род Larix считается относительно молодым. Для исследуемой территории описывается большое число гибридных, окончательно несформировавшихся таксонов, чей видовой статус является спорным. Поэтому особенно актуально изучение истории формирования ареалов и генетического разнообразия видов этого региона.
Использование молекулярно-генетических маркеров в изучении лиственниц Си
бири (Semerikov, Lascoux, 2003; Семериков и др, 2007; Phylogeography of Larix sukacze-
wii Dyl., 2008; Phylogeography of Eurasian Larix, 2008) позволило выявить, что совре
менное распределение генетической изменчивости таких видов, как L. sukaczewii
Dyl., L. sibirica Ledeb. и L. gmelinii Rupr. сформировано событиями плейстоценовых
вымираний и реколонизации северных частей таежной зоны из южных ледниковых ре-
фугиумов. Генетические исследования лиственниц Дальнего Востока также проводи
лись как с помощью аллозимных маркеров (Потенко, Разумов, 1996; Гончаренко, Си
лин, 1997; Semerikov et al., 1999; Ларионова и др, 2004), так и ДНК маркеров (Conflict
ing phylogenies..., 2003; Semerikov, Lascoux, 2003; Левина, Адрианова, 2003; Генетиче
ская изменчивость и взаимоотношения..., 2004; Генетическая изменчивость и популя-
ционная..., 2004; Изучение генетической изменчивости...,2008; Васюткина, 2009;
Орешкова, Барченков, 2009; и др.). Главным образом, данные работы были посвящены
внутривидовой изменчивости и основывались на ограниченном материале, недостаточ
ном для биогеографических заключений. Таким образом, большое значение имеет изу
чение дальневосточных видов лиственниц на протяжении всего их ареала с привлече
нием большого количества выборок и комплекса маркеров, позволяющих выявить ге
незис популяций лиственниц в разных географических зонах, роль гибридизации в их
видообразовании и генетическую изменчивость.
Цель и задачи исследования.
Цель работы - изучение биогеографии лиственниц, произрастающих на территории Дальнего Востока России, на основе структуры генетической изменчивости цито-плазматических маркеров.
В задачи исследования входило:
исследование изменчивости митохондриальной и хлоропластной ДНК в популяциях дальневосточных лиственниц;
определение параметров внутри- и межпопуляционной изменчивости и географической структуры генетической дифференциации по двум типам генетических маркеров в популяциях дальневосточных лиственниц;
выявление позднеплейстоценовых областей сохранения древесной растительности и путей миграции лиственницы на территории Дальнего Востока.
Защищаемые положения:
Уровень изменчивости маркеров митохондриальной и хлоропластной ДНК исследованных популяций лиственниц в основном обусловлен историческими событиями и находится в пределах изменчивости этих маркеров у видов сем. Pinaceae.
Географическая структура изменчивости маркеров хлоропластной и митохондриальной ДНК указывают на обособленное генетическое положение лиственниц крайнего северо-востока Азии и, в частности, Камчатки, что обусловлено изоляцией их популяций в период последнего максимума оледенения в пределах современных ареалов.
Генетическое разнообразие лиственниц юга Дальнего Востока обусловлено относительно стабильными размерами их популяций даже в ледниковые фазы и возможностью генетических потоков между континентальной частью и близлежащими островами.
Научная новизна. Впервые с использованием маркеров хлоропластной и митохондриальной ДНК на обширном материале исследована генетическая изменчивость лиственницы континентального северо-востока Азии и о.Сахалина. Выявлена генетическая самостоятельность Larix cajanderi Мауг. и родственные связи лиственниц юга О.Сахалин с японской лиственницей L. kaempferi Lamb. Впервые исследована изменчивость цитоплазматических генетических маркеров в популяциях лиственницы Камчатки и Курильских островов (о.Шикотан и о.Итуруп). Проведено сравнительное исследование изменчивости цитоплазматических генетических маркеров на территории Восточной Сибири и Дальнего Востока с привлечением большого числа выборок.
Практическая значимость. Полученные данные о внутрипопуляционном генетическом разнообразии и географической дифференциации дальневосточных лиственниц могут быть использованы при разработке селекционных мероприятий и программ сохра-
нения биоразнообразия лесных генетических ресурсов, для дальнейших популяционно-таксономических исследований лиственниц, для преподавания биологических в вузах.
Личный вклад соискателя. Автором выполнена работа по сбору полевого материала на территории Магаданской, Сахалинской, Камчатской областей и Хабаровского края. Работа по лабораторному анализу материала, в том числе предоставленного руководителем, обобщению и интерпретации полученных данных выполнена автором самостоятельно.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на трёх конференциях молодых ученых в ИЭРиЖ УрО РАН (Екатеринбург, 2007, 2008, 2009); на международном симпозиуме «Modern achievements in population, evolutionary and ecological genetics» (Владивосток, 2007); на Всероссийской конференции в рамках XII съезда Русского Ботанического Общества «Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века» (Петрозаводск, 2008); международной конференции молодых ученых «Молодежь в науке - 2009» (Минск, Белоруссия, 2009); на V съезде ВОГиС (Москва, 2009); на 2-м международном совещании по сохранению лесных генетических ресурсов Сибири (Новосибирск, 2009).
Публикации. Основные результаты исследований опубликованы в 9 работах, в том числе в 2 статьях в журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 137 страницах, содержит 13 рисунков и 10 таблиц и 3 приложения. Список литературы включает 230 источников, 126 из которых на иностранном языке.
Благодарности. Автор благодарит научного руководителя д.б.н. В.Л. Семерикова за помощь в проведении экспериментальных работ и обсуждение результатов, а также С.А. Семерикову за ценные замечания в ходе подготовки диссертации. Автор выражает искреннюю благодарность А.Н. Беркутенко, администрации Института биологических проблем Севера ДВО РАН, а также сотрудникам лесхозов Сахалинской области за помощь в организации сбора экспериментального материала.
Биологические особенности, эволюция, систематика и распространение рода Larix
Биологические особенности рода Larix. Лиственницы — обычно крупные деревья, иногда до 80 м высотой, с широкой конусовидной кроной, часто приобретающей неправильную, а в крайне суровых условиях произрастания стелющуюся форму. Развивают мощную пластичную корневую систему. Однодомные. Микростробилы одиночные мелкие, на концах укороченных побегов. Макростробилы также мелкие, созревают в первый год после цветения. Цветение происходит рано весной одновременно с распусканием хвои. Шишки продолговатые, яйцевидные или закругленные, ко времени цветения зеленые, красноватые или пурпурные, к спелости коричневые и одревесневшие. Семена с широким крылышком; нередко с низкой всхожестью, так как при отсутствии перекрестного опыления образуются пустые семена, внешне почти не отличающиеся от полнозернистых. Сохраняют всхожесть 2-3 года. Пыльца без воздушных мешков, но, тем не менее, достаточно легкая, чтобы разноситься ветром на дальние расстояния. Хвоя мягкая, 2.5-5 см длиной, ежегодно опадающая, собрана в пучки на укороченных и одиночная на удлиненных побегах. Именно способность сбрасывать хвою является определяющим в адаптации лиственниц к крайне неблагоприятным условиям произрастания в холодном климате с коротким вегетационным периодом. Достигают возраста 300-600 и даже более лет (Уханов, 1949; Шиманюк, 1964; Жизнь растений..., 1978; Козубов, Муратова, 1986; Крюссман, 1986).
В России лиственница является основной лесообразующей породой, как по занимаемой площади, так и по запасам древесины. Она распространена практически по всей северной части лесной зоны: от Архангельской области до дальневосточного побережья, достигая в отдельных случаях 72 с.ш. и даже несколько выше. Большая часть занимаемой ею территории приходится на вечномерзлые грунты, каменистые горные склоны, крайне неблагоприятные для произрастания. Лиственница является одной из наиболее морозоустойчивых пород и переносит холода до -7ГС. (Пономарев, 1934; Сукачев, 1938; Леса СССР..., 1969; Милютин, 2003) Лиственница - генетически лабильный род, многие его виды образуют ряд экологических и наследственных форм и рас. Большинство видов свободно гибридизируют, как в культуре, так и в естественных условиях (Колесников, 1946; Сукачев, 1924; Бобров, 1972а, 1978; Дылис, 1961). Все это затрудняет систематику рода, но с другой стороны, делает лиственницу перспективным объектом для лесной генетики и селекции, особенно учитывая ее большое экономическое значение. Древесина лиственницы высоко ценится за хорошие физико-механические свойства и устойчивость к гниению (Уханов, 1949).
Эволюция рода Larix. Наиболее ранние ископаемые остатки лиственницы известны из эоценовых отложений штатов Невада и Айдахо (Axelrod, 1991) и острова Аксель-Хейберг в канадском арктическом архипелаге (LePage, Basinger, 1991). Также имеются указания на находки Larix в эоценовых отложениях Новосибирских островов (Фрадкина и др., 1979, Никитин, 2007). В олигоцене лиственница отмечена на Камчатке (Гладенков и др., 1991) и Хабаровском крае (Блохина, 1984). Хотя в составе растительности эоцена лиственница была весьма редким компонентом, морфологическое сходство ископаемых и современных лиственниц позволяет предполагать происхождение этой группы до эоцена, вероятнее всего, в меловом периоде. Массовое же появление лиственниц отмечено в миоценовых флорах, как Северной Америки, так и России, Японии и Западной Европы (LePage, Basinger, 1995). Четвертичные флоры северо-востока Азии имеют много общего с современными умеренными флорами Северной Америки и Японии благодаря присутствию некоторых типичных представителей тсуг, сосен, елей. Лиственница, обнаруженная среди этих экзотов, была определена П.И.Дорофеевым (1972) как L. omoloica Dorof. = L. occidentalis Nutt. foss. - вид, в настоящее время распространенный в горах запада Северной Америки. Современный же облик лиственниц, произрастающих на северо-востоке Сибири, сложился, вероятнее всего, к позднему плейстоцену (Бобров, 1978).
Относительно центра происхождения и расселения рода Larix существует несколько точек зрения. Так, одна их первых, имеющая в настоящее время историческое значение, гипотеза была предложена Ф.Кеппеном в 1885 и предполагала возникновение лиственницы на Алтае, а первоначальной ее формой — L. gmelinii (Дылис, 1961).
В.Н. Сукачев (1924), В.Б. Сочава (1945), В.Н. Васильев (1958) предполагали юго-восточноазиатское происхождение рода в целом, но при этом северное происхождение L. gmelinii. Так, В.Н. Сукачев (1924) считал, что расселение шло с юга на север, но не отрицал и обратного движения лиственниц (с севера на юг) во время плейстоценового оледенения и возможность возникновения лиственницы даурской на Северо-Востоке Азии (цит. по: Блохина, 1985).
Б.П. Колесников (1946), Н.В. Дылис (1947), Е.Г. Бобров (1972а, 1978) считали местом развития Larix северо-восток Азии. Изучение третичных лиственниц Дальнего Востока (Блохина, 1995) предполагает возникновение рода Larix в тихоокеанском регионе, в составе умеренных арктотретичных флор. Их появлению способствовал позднемеловой-раннечетвертичный вулканизм, создавший более холодные и благоприятные для произрастания хвойных горные условия.
Вероятнее всего, лиственница возникла в Северной Америке и мигрировала по Берингийскому сухопутному мосту в Азию (LePage, Basmger, 1995). В Азии прослеживается два пути расселения рода: вдоль восточного побережья Азии в центральный Китай и второй, трансевразийский, с северо-востока в центральную Европу (LePage, Basmger, 1995). Эти же пути распространения были реконструированы на основе биогеографического анализа молекулярных данных и фоссилиев и для таких бореальных родов, как, например, Picea (Run et al., 2006) и Abies (Rhylogeny of Abies..., 2009). Оценки времени расхождения родственных видов флор Восточной Азии и Северной Америки варьируют от середины до конца третичного периода (Timing the Eastern Asian..., 2000). Изучение филогении рода по данным изменчивости митохондриальной ДНК, сопоставленных с данными палеоботаники (Семериков, 2009), позволили датировать отделение лиственниц запада Северной Америки от остальных лиственниц эоценом (45 м.л.н.). В этом случае дивергенция оставшихся видов Larix произошла уже в миоцене, около 10 м.л.н.
Что касается непосредственно видов лиственниц юга Дальнего Востока, то, по мнению В.Н.Васильева, их формирование происходило в горах Сихотэ-Алиня и в восточной Манчжурии в составе древних третичных лесов тургайского комплекса (цит. по: Блохина, 1985).
Видовой состав, характеристика и локализация выборок
Объектами исследования послужили выборки из природных популяций лиственниц Восточной Сибири, Дальнего Востока России и Кореи. Выборка японской лиственницы L. kaempferi получена из лесокультурных посадок с южного Сахалина. Всего исследовано 54 популяции, названия и координаты сбора которых указаны в таблице 2.1, расположение на карте демонстрирует рисунок 1. Популяция L. kaempferi обозначена на карте на о.Хонсю в пределах ее современного естественного ареала, в соответствии с происхождением семенного материала для посадок. Объем выборок составил от 6 до 37 особей, общее количество проанализированных деревьев с помощью хлоропластных маркеров - 1004, с помощью митохондриальных - 956.
Поскольку специально границы популяций и их характеристики не определялись, каждая выборка условно представляет одну популяцию. Отождествление связано, во-первых, с тем, что большинство бореальных хвойных, в частности лиственница, имеют обширные протяженные ареалы и являются ветроопыляемыми. Таким образом, в природе довольно трудно определить реальные границы их популяций, поскольку занос пыльцы, и, следовательно, генетического материала, может осуществляться на значительные расстояния, так что даже отдаленные особи из других мест обитания могут вносить вклад в генетическое разнообразие популяции в определенном локалитете (Hattemer, 2005). Во-вторых, анализ генетического разнообразия конкретных популяций не представлял первоочередную задачу исследования, а, наоборот, главным являлось выявление генетической дифференциации и ее причин в целом для представителей рода Larix на значительной территории Восточной Сибири и Дальнего Востока. Поэтому выборки, взятые на расстоянии более 50 км, считались представляющими разные популяции. Небольшой размер выборок изначально обусловлен спецификой используемых маркеров, имеющих унипарентальное наследование и, таким образом, меньший эффективный размер популяции, а также математическими оценками оптимального сбора материала для анализа изменчивости гаплоидных маркеров. В случае исследований, охватывающих большие территории, оптимальной стратегией является сбор небольшого числа особей из одного местообитания, но из как молено большего их числа (Pons, Petit, 1995). Неодинаковое количество особей, использованных в анализе изменчивости хпДНК и мтДНК, объясняется тем что для анализа маркеров мтДНК требуется повышенное качество ДНК, которое в отдельных образцах не было удовлетворительным.
Образцы ДНК из популяций № 5, 27, 33, 34, 35, 38, 50-54 ранее уже использовались в генетическом анализе (Семериков, 2007; Semerikov et al., 1999; Conflicting phylogenies of Larix..., 2003; RAPD-derived..., 2006; Semerikov, Lascoux, 1999, 2003). В настоящей работе в них была исследована изменчивость нескольких дополнительных маркеров (см. сноску под табл.2.1) и произведено сопоставление с другими выборками. Остальной материал был собран автором в течение 2003-2008 годов и анализировался впервые.
Согласно описываемым Е.Г.Бобровым (1978) ареалам лиственниц на изученной территории, популяции, включенные в анализ, собраны из мест произрастания следующих видов: L. gmelinii, L. cajanderi, L. kamtschatica, L. olgensis, L. x czekanowskii, L. haempferi. Гибридный таксон L. x maritima Sukacz, ровно, как и другие гибриды, описанные разными авторами для юга Дальнего Востока (L. х ochotensis Kolesn., L. х middendorffii Kolesn., L. x amurensis Kolesn., L. x lubarskii Sukacz, L. x komarovii Kolesn.), не рассматривались как самостоятельные и относились к более крупным таксонам. Выборки из континентальных районов произрастания указанных гибридов относились к L. gmelinii или L. cajanderi, с севера о-ва Сахалин - к L. kamtschatica. Однако во внимание было принято описание Н.В. Дылисом (1961) обособленной расы лиственницы на Камчатке.
Таким образом, исследуемый материал относится к следующим видам: 5 выборок из популяций с о. Сахалин (№ 43-47) и две с Курильских островов - Шикотан (№ 48) и Итуруп (№ 49) - собраны из области распространения L. kamtschatica (Rupr.) Carr. (=L. kurilensis Mayr.). Из мест произрастания L. olgensis A.Henry - 4 популяции: три из Приморья (№ 50-52) и одна из Кореи (№ 53). Из основной части ареала L. gmelinii (Rupr.) Rupr. -11 популяций, включая центральную Якутию (№ 22-24), Амурскую область (№ 30-32), Хабаровский край (№ 25-29), Читинскую область (№ 33, 34, 36, 37) и Бурятию (№ 35). Из мест описания гибридной L. xczekanowskii Szaf. (L.gmelinii x L.sibirica Ledeb.) - 5 популяций с севера Красноярского края (№ 38-42). Большую часть ареала L. cajanderi Мауг представляет 21 популяция с северо-востока Азии, включая северо-восток Хабаровского края (№ 20, 21), восточную Якутию (№ 17-19), Магаданскую область (№ 5-16), Чукотский АО (№ 3, 4). Популяции лиственницы Камчатского края (№ 1, 2) отнесены к подвиду L. kurilensis ssp. glabra Dylis. Выборка (№ 54) L. kaempferi (Lamb.) Carriere (=L. leptolepis Siebold & Zucc.) взята из лесокультурных посадок Тамаринского лесхоза (южный Сахалин).
Методика сбора и экстракция ДНК. Хвоя в количестве 2-4 брахибластов собиралась с деревьев, отстоящих друг от друга на расстоянии 50-100 метров, во избежание включения в анализ близкородственных особей. Материал высушивался в силикагеле и сохранялся до дальнейшей экстракции ДНК при комнатной температуре. В зимний период хвою для экстракции получали посредством выгонки из покоящихся веток, при содержании их в емкостях с водой под пленкой при постоянно высокой влажности и температуре 18-20С. Также для изоляции ДНК использовался живой камбий и проростки семян.
Полиморфизм микросателлитных локусов хлоропластной ДНК. Внутрипопуляционная изменчивость
Изменчивость хлоропластной ДНК была исследована у 1004 особей из 54 популяций лиственниц Восточной Сибири и Дальнего Востока (табл. 3.1).
Секвенирование фрагментов хлоропластной ДНК у Larix, соответствующих микросателлитным локусам хпДНК Pinus tunbergii, также выявило содержащиеся в них мононуклеотидные повторы. Разработка ПНР праймеров для их амплификации позволила использовать в исследовании пять микросателлитных локусов (cpSSR локусов), полиморфизм в каждом из которых заключался в наличии нескольких размерных вариантов (аллелей) с разницей в один нуклеотид. Фотографии фрагментов гелей, демонстрирующие полиморфизм в некоторых локусах, представлены на рисунке 3.1- А, Б.
Размерные варианты нумеровались от 1 до 9, в порядке увеличения длины микросателлитного фрагмента с шагом в один нуклеотид. Интересно, что вариант 8 не был обнаружен ни в одном из исследованных локусов.
Число аллелей в локусах варьировало. Так, наибольшее количество -семь аллелей — было обнаружено в локусе Pt26081 (варианты размеров от 2 до 9, без варианта 8), по шесть - в локусах L-Pt30204 и L-Pt9393 (варианты от 1 до 7, без варианта 2), а также в локусе L-Pt9891 (варианты от 2 до 7), и четыре аллеля - в микросателлите фрагмента LrnUV (варианты размеров от 4 до 7). Интересно, что в роде Abies для одного из исследованных в данной работе локусов - Pt30204 - наблюдается повышенная изменчивость. Так, у Abies sibirica в нем выявлено 11 аллелей, у A. nephrolepis и A. sachalinensis 14 и 16, соответственно (Семерикова, Семериков, 2007), а у A. alba до 18 аллелей (High level of variation..., 1999). Таким образом, в изученных популяциях лиственницы данный локус не проявляет свойств мутационной «горячей точки», характерной для видов Abies (High level of variation..., 1999).
Суммарно найдено 29 аллелей. Сочетание размерных вариантов в локусах у 1004 особей позволило выявить 115 хлоропластных гаплотипов (далее «хлоротипов»). Полокусные характеристики хлоротипов представлены в приложении А (табл. А1).
Подобный уровень изменчивости хлоропластных микросателлитов в целом характерен и для других хвойных. Так у Cedrus atlantica при анализе 162 особей по шести cpSSR локусам было обнаружено 25 аллелей, давших 66 хлоротипов (Genetic diversity and population..., 2006). У 235 деревьев Pinus pinaster в шести локусах выявлен 21 аллель и 32 хлоротипа (Variation in chloroplast..., 2001), а при увеличении числа анализируемых особей до 572 уже 25 аллелей и 108 хлоротипов (Comparison of genetic diversity..., 2002).
До восьми размерных вариантов в каждом из аналогичных локусов -Pt26081, Pt30204, Pt9393 и fmLV/Haelll - ранее были выявлены при исследовании нескольких видов Larix (Семериков, 2007). Анализ 353 особей, включающих представителей видов L. decidua, L. laricina, L. sukaczewii, L. sibirica, L. gmelinii, L. olgensis, L. kamtschatica и некоторых гибридных таксонов по 4 хлоропластным микросателлитным локусам выявил 24 аллеля и 79 хлоротипов (Семериков, 2007).
Таким образом, у изученных представителей лиственниц Восточной Сибири и Дальнего Востока обнаружена достаточно высокая изменчивость хлоропластных микросателлитов, характерная в целом для рода и находящаяся в пределах cpSSR изменчивости других хвойных. Значительное количество хлоротипов обусловлено как объемом проанализированного материала, так и гетерогенностью его видового состава.
Частота встречаемости хлоротипов в анализируемом материале (1004 особи) была неодинаковой. Из 115 обнаруженных хлоротипов только один -Н2 - имел частоту свыше 0.1, в то время как двадцать семь других (-23%) от 0.006 до 0.1 (преобладающие хлоротипы), тридцать шесть (-32%) от 0.002 до 0.005 (редкие) и пятьдесят один (-44%) - уникальные, встретившиеся однажды (частота 0.001). Распределение хлоротипов в популяциях приводится в приложении Б (табл. Б 1 и Б 2).
Присутствие небольшой группы преобладающих у всех видов хлоротипов, которые, вероятно, являются филогенетически более древними, указывают на общность происхождения всех восточноазиатских лиственниц от единого предка, а наличие большого количества редких и уникальных хлоротипов в этом случае можно рассматривать как результат особенностей мутационного процесса в микросателлитных локусах, для которых характерна высокая скорость мутирования.
Полиморфизм маркеров митохондриальной ДНК. Внутрипопуляционная изменчивость
На рисунке 4.5. представлено дерево минимальных расстояний, отражающее взаимоотношения между митотипами. Замкнутая форма дерева, как правило, объясняется наличием рекомбинации. Хотя в норме митохондриальная ДНК не рекомбинирует, наследуясь клонально, все же такие довольно редкие примеры известны для грибов, а также растений (Saville et al., 1998, Stadler, Delph, 2002), в том числе хвойных - в роде Picea (Jaramillo-Correa, Bousquet, 2005). Причинами появления "химерных" митотипов считают как внутригеномную рекомбинацию в пределах органеллы, так и межгеномную, обусловленную гетероплазмией, т.е. присутствием в клетке двух типов органелл, один из которых, унаследованный по отцовской линии, по каким-то причинам не был элиминирован при оплодотворении, как обычно происходит в норме. Из выявленных в данной работе предположительно рекомбинантными являются митотипы KG1, KG2 и KS поскольку они совмещают в себе черты митотипов разных линий: варианты фрагментов, характерные для митотипов Gl, G2 и S одновременно с инсерцией во фрагменте nad5(\-2r), которая специфична для митотипа К (табл.4.1). Митотипы U и SN также, вероятно, рекомбинантного происхождения, так как каждый из них отличается от митотипа L только одной мутацией в локусе nad4Qc-4r) или в локусе UBCA60, соответственно. Возникновение одинаковых мутаций в разных линиях, объясняющее такое совмещение вариантов, маловероятно. Более того, как видно из рис.4.5, все рекомбинантные митотипы редки и являются промежуточными между широко распространенными и предковыми по отношению к ним митотипами Gl, G2, S и L. Географическое распространение таких "необычных" митотипов, которые были обнаружены только в области совместного существования "чистых" митотипов на юге Дальнего Востока, в зоне гибридизации нескольких видов Larix, где гетероплазмии могло способствовать отсутствие полной репродуктивной изоляции, также указывает на возможность их происхождения в результате рекомбинации.
Ранее митохондриальные гаплотипы, генетически промежуточные по отношению к типичным для даурской и ольгинской лиственниц, наблюдались в выборках из южного Приморья. Рекомбинантный митотип был обнаружен и в одной популяции из зоны гибридизации L. sibirica и L. gmelinii (Semerikov, Lascoux, 2003). Подобный феномен наблюдался также у естественных гибридов в роде Picea (Jaramillo-Correa, Bousquet, 2005).
Сочетание вариантов аллелей по локусам каждого из маркеров (табл.4.1) позволило идентифицировать одиннадцать митотипов, что обычно для большинства биогеографических исследований широкоареальных хвойных, использующих PCR-RFLP митохондриальных фрагментов. Так, у Picea mariana выявлено десять митотипов при использовании четырех локусов (Jaramillo-Correa et al, 2004), у Picea jezoensis — семь митотипов при использовании пяти локусов (Phylogeography of a northeast Asian spruce..., 2007), у Pinus tabulaeformis Carr. шесть митотипов при использовании двух локусов (Phylogeography of Pinus..., 2008). При исследовании лиственниц европейской, сибирской и гибридов между сибирской и даурской лиственницами (Семериков и др., 2007) с помощью пяти PCR-RFLP маркеров было выявлено 29 митотипов. Однако такое количество вариантов объясняется наличием в одном из локусов минисателлита, изменчивость которого обусловила 24 митотипа, специфичных для лиственницы сибирской. При включении в анализ представителей дальневосточных видов лиственниц, а также американской лиственницы L. laricina и использовании 12 изменчивых митохондриальных локусов количество митотипов увеличилось до 36 (Семериков, 2007).
Из исследованных популяций 26 оказались фиксированными по одному митотипу, остальные 28 - полиморфными (рис.4.6; табл.4.2). Наиболее изменчивыми были выборки, взятые из зоны распространения L. kamtschatica и L. olgensis и их гибридов с L. gmelinii, 9 и 4 митотипа, соответственно. Наименее изменчивыми оказались выборки L. kurilensis ssp. glabra с Камчатки и L. kaempferi, у которых было обнаружено по одному митотипу. Выборки, относящиеся к L. cajanderi, также почти фиксированы по одному митотипу. В большинстве выборок L. gmelinii представлены два митотипа. Распределение митотипов в популяциях представлено в приложении В (табл. В 1).
На основе частот митотипов в 54 исследованных выборках лиственницы были определены значения показателей генетической изменчивости (табл. 4.2). Значения параметров в большинстве популяций были невысокими: число митотипов N0=\-2, эффективное число митотипов JVe = 1-1.2. Индекс разнообразия митотипов Н = 0-0.556, что сравнимо с таковым у других массовых представителей Pinaceae, как, например, Pinus silvestris (Н = 0-0.480) (Glacial vicariance in Eurasia..., 2007) и распространенной на Дальнем Востоке Picea jezoensis (Н = 0-0.536) (Phylogeography of a northeast Asian spruce..., 2007).
Примечательны значительные отличия показателей изменчивости выборок из северо-восточной части исследуемой территории (№ 1-20) с низким индексом разнообразия митотипов Н = 0-0.184 от некоторых популяций с о. Сахалин (№ 43, 44, 46) и Приморья (№52), которые, напротив, имели довольно высокие его значения Н— 0.626-0.812. Это, как и в случае с изменчивостью хлоропластных маркеров, объясняется историческим прошлым северо-восточных популяций, претерпевших значительное сокращение численности и, напротив, стабильными размерами более южных популяций в периоды ледниковых фаз
