Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 6
1.1. Ботанико-географическое описание елей, сосен и пихт Дальнего Востока России 6
1.1.1. Ели (род Piced) 6
1.1.2. Сосны (род Pinus) 8
1.1.3. Пихты (род Abies) 12
1.2. Преимущества изоферментов и история их становления как генетических маркеров у хвойных видов 14
1.3. Характер наследования ферментных систем 19
1.4. Исследование генетической изменчивости природных популяций 21
1.5. Анализ состояния равновесия и степени подразделенности популяций ... 28
1.6. Определение внутри- и межвидовой генетической дифференциации 32
Глава 2. Материалы и методы 36
2.1. Получение экспериментального материала 36
2.2. Электрофоретический анализ 44
2.3. Обозначение и генетическая символика 49
2.4. Математическая обработка 51
Глава 3. Результаты и обсуждение 55
3.1 Генетическая изменчивость и филогенетические взаимоотношения у пятихвойных сосен 55
3.1.1 Описание и характер наследования ген-ферментных систем 55
3.1.2 Частоты аллелей и показатели полиморфизма в популяциях 60
3.1.3 Оценка равновесия и подразделейность популяций 74
3.1.4 Внутри- и межвидовая дифференциация 78
3.2 Генетическая изменчивость и филогенетические взаимоотношения у двухвойных сосен 82
3.2.1 Описание ген-ферментных систем 82
3.2.2 Частоты аллелей и генетическая изменчивость популяций 85
3.2.3 Оценка равновесия и подразделенность популяций 98
3.2.4 Дифференциация популяций, филогенетические взаимоотношения среди двухвойных сосен и решение спорных таксономических вопросов 102
3.3 Генетическая изменчивость и филогенетические взаимоотношения у дальневосточных елей 108
3.3.1 Описание ген-ферментных систем 108
3.3.2 Частоты аллелей и показатели полиморфизма в популяциях 113
3.3.3 Дифференциация популяций, филогенетические взаимоотношения среди елей и решение спорных таксономических вопросов 127
3.3.4 Оценка равновесия и подразделенность популяций 132
3.4 Генетическая изменчивость и филогенетические взаимоотношения у пихт. 136
3.4.1 Описание ген-ферментных систем 136
3.4.2 Частоты аллелей и показатели полиморфизма в популяциях 139
3.4.3 Дифференциация популяций и филогенетические взаимоотношения дальневосточных пихт 144
3.4.4 Оценка равновесия и подразделенность популяций 145
Заключение 148
Выводы 156
Литература 158
- Преимущества изоферментов и история их становления как генетических маркеров у хвойных видов
- Анализ состояния равновесия и степени подразделенности популяций
- Описание и характер наследования ген-ферментных систем
- Частоты аллелей и генетическая изменчивость популяций
Введение к работе
Последние десятилетия ознаменовались всесторонним изучением генетических ресурсов природных популяций лесных древесных растений. Это связано с тем, что угроза утраты генетического разнообразия сегодня встает со всей очевидностью, поскольку интенсивное и зачастую нерегламентированное ведение лесного хозяйства приводит к "эрозии" популяционных генофондов, т.е. к их необратимым отрицательным изменениям. Общеизвестно, что уменьшение генетического разнообразия приводит к снижению адаптивных свойств популяций и сопротивляемости к вредителям и болезням.-Это, в конечном счете, ведет к ухудшению состояния популяций, их распаду и вырождению в результате действия стрессовых или иных факторов. Сокращение размеров популяций древесных растений или шГ гибель может вызвать каскадную реакцию среди живых организмов, т.к. древесные виды являются основными структурными компонентами лесных экосистем. Таким образом, истребление лесов актуализирует проблему сохранения, восстановления и рационального использования их генетических ресурсов.
Данную проблему невозможно решить без учета состояния генофонда, уровня генетической изменчивости и дифференциации природных популяций лесных древесных растений, поэтому все более острой становится необходимость их оценки. Особое значение при исследовании популяций древесных видов имеют генетико-биохимические методы, в частности - электрофоретический анализ изоферментов. Это связано с тем, что применение традиционных методов генетического анализа к этим видам затруднено, вследствие длительности жизненного цикла и полигенного характера наследования морфологических признаков у древесных.
К настоящему времени, использование изоферментов в качестве генетических маркеров позволило не только определить уровень изменчивости и дифференциации популяций растений леса, но и установить эволюционно-филогенетические взаимоотношения среди видов, границы лесосеменных районов, параметры системы скрещивания в искусственных и естественных насаждениях, критерии выделения генетических резерватов и др. (Muller, 1976; Yeh, EI-Kassaby, 1980; Szmidt, 1984; Miiller-Starck, 1987, 1995; Hamrick et al., 1992; Krutovskii et al., 1994; Korol, Schiller, 19Ї/6; Tani et al., 1996; Гончаренко, 1999; Jorgensen et al., 2002 и др.). В основном, эти исследования проведены в США, Канаде, Израиле, Японии, в странах Западной и Северной Европы, а также в Беларуси и, частично, в России.
На территории Дальнего Востока России основными лесообразующими видами являются хвойные растения, включая представителей родов Pinus, Picea и Abies. Однако, генетические исследования хвойных Дальнего Востока России начаты сравнительно недавно и их крайне мало. Практически не известно, каким уровнем генетической изменчивости обладают дальневосточные виды хвойных растений, не ясны таксономический статус и филогенетические взаимоотношения многих представителей сосен, елей и пихт. Необходимость проведения популяционно-генетических исследований не вызывает сомнений, т.к. разработка стратегий и проведение мероприятий по сохранению биологического разнообразия лесов Дальнего Востока невозможны без генетической информации. Более того, результаты исследований популяционных генофондов могут быть использованы и для решения прикладных задач в области лесовосстановления и неистощительного лесопользования.
Целью настоящей работы было изучение генетической изменчивости и дифференциации популяций дальневосточных хвойных растений из родов Ріиіч, Picea и Abies, а также определение таксономического статуса и филогенетических взаимоотношений между ними. ,
Конкретными задачами исследования природных популяций дальневосточных сосен, елей и пихт были:
1. Провести описание генофондов не менее чем по 20 локусам.
2. Выявить уровень генетической изменчивости.
3. Оценить степень подразделенности и состояние равновесия популяций.
4. Установить закономерности внутривидовой генетической дифференциации.
5. Определить степень генетической дифференциации между видами хвойных растений.
Работа выполнена в лаборатории генетики и селекции Дальневосточного специализированного семеноводческого лесхоза в рамках научно-исследовательской работы "Проведение генетического анализа популяций основных лесообразующих хвойных пород и разработка долговременной программы генетического улучшения лесов Хабаровского края" и частично финансировалась грантом Модельного леса "Гассинский" по проекту № 43.6 "Анализ генофонда основных лесообразующих пород МЛГ".
Основная часть результатов получена самостоятельно, а также при участии сотрудника Института водных и экологических проблем ДВО РАН, к.б.н. А. В. Беликова, работавшего под руководством автора. Часть полевых работ проведена совместно с сотрудником Горнотаежной станции ДВО РАН, Б. В. Попковым. Коллегам автор приносит благодарность за участие в совместной работе. Автор также признателен преподавателю Гомельского государственного университета, д.б.н., академику НАН Беларуси Г. Г. Гончаренко за помощь на первых этапах работы и директору БПИ ДВО РАН, д.б.н., академику РАН Ю. Н. Журавлеву за всестороннюю поддержку генетических исследований в Хабаровском крае.
Преимущества изоферментов и история их становления как генетических маркеров у хвойных видов
К настоящему моменту генетический характер наследования установлен для огромного количества морфологических признаков у многих животных и сельскохозяйственных растений. Более того, на таких растениях как кукуруза, пшеницы, ячмень, томаты и др. появилась возможность в специальных скрещиваниях проводить локализацию (т.е. определять точное расположение) генов в хромосомах и даже вносить нужные гены, создавая сочетание необходимых селекционеру признаков (Genome mapping in plants, 1996).
Несколько изменчивых альтернативных признаков найдены и у древесных видов хвойных растений. Изменчивость обнаружена по таким признакам, как форма семенной чешуи, цвет семенных крылаток и семян, число семядолей проростка и др. (Правдин, 1964, 1975; Урусов, 1974; Райт, 1978; Мамаев, Попов, 1989; Фролов, 1993; Потемкин, 1994). Имеются и морфологические варианты с вредным или летальным эффектом, такие как, например, альбинизм (Морозов, 1978; Cram, 1983). Однако, определить контролируется ли тот или иной признак у древесных конкретными генами или зависит от случайных обстоятельств (например, благоприятное и неблагоприятное освещение, повреждения и т.д.) является трудной, а порой и неразрешимой задачей. Так скажем проведение на хвойных видах экспериментов, аналогичных менделевским по установлению характера наследования цвета семян, потребует около ста лет из-за длительности жизненного цикла. Таким образом, использование морфологических признаков в качестве маркеров в селекционных экспериментах на хвойных видах бесперспективно, по крайней мере, в ближайшее время.
Другой класс изменчивых признаков у хвойных был обнаружен по монотерпенам. Оказалось, что высокий и низкий уровни монотерпенов контролируются генами, но в отличие от морфологических маркеров, различия по монотерпенам найдены только между популяциями, а не между отдельными деревьями. Кроме того, они маркируют несущественную часть генома, отражающую чувствительность организма к факторам окружающей среды, и поэтому оказались пригодны только для изучения генетической изменчивости на географической и экологической основе (Phillips, Croteau, 1999; Forrest et al., 2000; Duncan et al, 2001; Sagnard et al., 2002; Manninen et al., 2002). Как отмечает Адаме, анализ монотерпенов проводится довольно дорогостоящим методом газовой хроматографии и занимает много времени. Следует также подчеркнуть, что, как и для морфологических признаков, в случае анализа монотерпенов, необходимо проведение скрещиваний в нескольких поколениях (Adams, 1983). В связи со всем вышеизложенным монотерпены вряд ли можно рекомендовать в качестве удобных генетических маркеров в селекции хвойных.
Новый класс генетических маркеров появился в середине 80-х годов благодаря развитию методов выделения, клонирования и рестрикции ДНК. На основе рестрикции ДНК был разработан метод анализа, носящий название полиморфизм по длине фрагментов рестрикции (ПДРФ; англ.: RFLP - restriction fragment lenth polymorphism).
Решающую роль в развитии ДНК маркеров сыграл метод полимеразной цепной реакции (ПЦР; англ.: PCR - polymerase chain reaction), и разработанные на его основе маркеры полиморфизма ДНК. К ним относятся: полиморфизм ДНК на основе случайной амплифицикации (англ.: RAPD - random amplified polymorphic DNA), варьирующее число тандемных повторов (англ.: VNTR - variable number of tandem repeats) или минисателлиты, микросателлиты (англ.: SSR- simple sequence repeats), однонуклеотидный полиморфизм (англ.: SNP - single nucleotide polymorphism) и другие, включая маркеры на основе комбинации различных методов, например, полиморфизм по длине фрагментов амплификации (англ.: AFLP - amplified fragment length polymorphism), который сочетает в себе методы рестрикции ДНК и полимеразной цепной реакции. Причем, в анализ включается как ядерная, так и рибосомальная, хлоропластная и митохондриальная ДНК (Brown, Kresovich, 1996; Алтухов, Салменкова, 2002). Все эти маркеры полиморфизма ДНК стали активно использоваться в популяционной и эволюционной генетике хвойных видов с 90-х годов (Wagner, 1992; Boscherini et al., 1994; Tsumura et al., 1994, 1995, 1996; Aagaard et al., 1995, 1998; Isabel et al., 1995, 1999; Vendramin et al., 1995; Ziegenhagen et al., 1995; Szmidt et al., 1996, 1998; Lu et al., 1997; Stefanovic et al., 1998; Parducci, Szmidt, 1999; Thomas et al., 1999; Wang et al., 1999; Hayashi et al., 2000; Terry et al., 2000; Fazekas, Yeh, 2001; Hwang et al., 2001; Parducci et al., 2001; Walter, Epperson, 2001; Semerikov, Lascoux, 2003 и др.). Необходимо отметить, что использование фрагментов ДНК в качестве молекулярно-генетических маркеров требует высочайшей квалификации специалистов, уникального оборудования (большинство процессов роботизировано) и существенных денежных вложений (Molecular genetic analysis of populations, 1992).
Наиболее перспективным для решения прикладных и фундаментальных вопросов лесной генетики оказалось направление, получившее название генетики изоферментов. Одним из главных методов, лежащих в основе нового направления, является метод разделения белков и ферментов в электрическом поле путем электрофореза (Корочкин и др., 1977; Айала, 1984). Достоинство этого метода состоит в том, что по числу и расположению окрашенных красителем белковых и ферментных фракций на специальной гелевой пластине можно непосредственно судить о генах, имеющихся в каждом растении. Окрашенные фракции получили название изоферментов и стали широко использоваться в качестве маркеров для селекционных и генетических экспериментов на различных видах древесных, в основном хвойных (Rudin, Lingren, 1977; Adams, 1981, 1983; Falkenhagen, 1985; Cheliak et al., 1987, 1988; Geburek et al., 1987; Adams et al., 1988,1992; Adams, Birkes, 1989, 1991; Miller et al., 1989; Muona, 1990; Millar, Libby, 1991; Muller-Starck, 1991; Millar, Westfall, 1992; Savolainen, Karkkainen, 1992; Westfall, Conkle, 1992; Xie, Knowles, 1992; Jermstad et al., 1993; Mitton et al., 1993; Ennos, Tang Qian, 1994; Mejnartowicz, Lewandowski, 1994; Ziegenhagen et al., 1995; Burczyk et al., 1997; Gomory et al., 1998; Pichot et al, 2000). Изоферменты (наследуемые фракции ферментов) или как их еще называют изозимы, имеют целый ряд неоспоримых преимуществ по сравнению с другими классами наследуемых генетических маркеров: 1. Современные методы электрофореза дают возможность без чрезмерных временных затрат анализировать большое количество изоферментных локусов (генов) у многих древесных (Conkle et al., 1982; Cheliak, Pitel, 1984). 2. На одном геле можно анализировать одновременно по 60 и более образцов и, соответственно, сразу определять их генотипы. При хорошо налаженной работе в некоторых лабораториях исследователи анализируют от 100 до 200 образцов в день по 11 20 генам каждый (Adams, 1983; Cheliak et al., 1987). 3. Все известные в настоящее время изоферменты наследуются моногенно, проявляются кодоминантно и, в основном, расщепляются в соответствии с Менделевским соотношением. Это позволяет сразу после электрофореза типировать как гомозиготные, так и гетерозиготные фенотипы и генотипы без проведения специальных анализирующих скрещиваний. 4. Важным преимуществом изоферментов является то, что они могут быть проанализированы в различных тканях, включая хвою, почки, пыльцу, эндоспермы, зародыши семян и др. (Conkle, 1971а; Pitel, Cheliak, 1982; Mitton et al., 1979; Cheliak et al., 1985; Govindaraju, Dancik, 1986 и др.). По общему признанию наилучшее электрофоретнческое разрешение наблюдается в тканях семян. Так, например, у Pseudotsuga menziesii Fr. удалось проанализировать 29 генов в эндоспермах и 23 в зародышах семян, в то время как в почках и однолетней хвое взрослых и саженцев -только 18 и 12 генов, соответственно (Adams, 1983). К тому же, следует отметить, что более 80% исследованных в почках и хвое локусов обнаруживается в эндоспермах и зародышах. Таким образом, имея возможность анализировать одни и те же локусы в различных тканях, можно легко проводить генетические сравнения между родителями и потомками.
Анализ состояния равновесия и степени подразделенности популяций
В то же время, необходимо подчеркнуть тот факт, что эволюционная история вида может играть даже более существенную роль в формировании генетической структуры, чем выявленные J. L. Hamrick с соавторами факторы. В этом можно наглядно убедиться на примере анализа изменчивости у американских сосен P. torreyana и P. resinosa. Например, у P. torreyana, по данным F. Т. Ledig и М. Т. Conkle (1983), генетическая изменчивость отсутствует практически полностью. Считается, что этот вид в недавнем прошлом (ледниковый период) испытал жесткое давление естественного отбора, в результате чего сохранилось только несколько деревьев. Следовательно, инбридинг, через который прошел этот вид, сократил изменчивость до полного предела в результате отбора по типу "бутылочного горлышка", и теперь P. torreyana пока не восстановит генетическую изменчивость, вряд ли расширит ареал своего обитания за счет заселения разнообразных экологических ниш. В настоящее время численность представителей P. torreyna постепенно увеличивается и за 70 последних лет достигла 3401 дерева, тогда как в 1916 году насчитывалось только 200 деревьев (Ledig, 1986). Необходимо обратить внимание и на P. resinosa, которая в настоящее время занимает в США и Канаде достаточно большой ареал, хотя гетерозиготность у нее не превышает одного процента (Fowler, Moris, 1977; Allendorf et al., 1982). D. P. Fowler и R. W. Morris объясняют столь низкие показатели изменчивости у P. resinosa влиянием жесткого инбридинга. По данным Девиса 20 тыс. лет назад ареал P. resinosa в результате наступления ледника был уменьшен до небольшой популяции на юго-востоке Соединенных Штатов и только 8-11 тыс. лет назад сосна смолистая распространилась на север до современных границ (Davis, 1976, цит. по Fowler, Moris, 1977). По-видимому, P. resinosa, так же как и P. torreyana прошла через жесткий отбор по типу "бутылочного горлышка", что и обеспечило полную гомозиготизацию вида. Не последнюю роль в современном широком распространении сосны смолистой играет тот факт, что потомки от самооплодотворения показывают только незначительную инбредную депрессию и оценки частот видимых рецессивных генов у P. resinosa на несколько порядков ниже, чем для других сосен (Fowler, 1965).
Отмечая, что хвойные в целом более изменчивы, чем животные и растения, нельзя не обратить внимания и на тот факт, что внутри класса Хвойные наиболее изменчивым оказался род Picea - ель. Так, например, гетерозиготность у елей достигает в среднем значения 0,219, тогда как у сосен значение этого показателя равняется 0,157, а у пихт -0,145 (Hamrick et al., 1992). Объяснить этот факт можно тем, что ели в своем местообитании обычно представляют последнюю стадию сукцессии. Этот признак, как и указывали J. L. Hamnck с соавторами (Hamnck et al., 1979, 1981), по-видимому, и связан с более высокой гетерозиготностью у елей. Хотелось бы отметить, что результаты получены, в основном, на североамериканских и европейских хвойных видах. В то же время, сообщений, касающихся изучения уровня изменчивости природных популяций хвойных российского Дальнего Востока, очень мало. Имеются работы, посвященные лишь нескольким популяциям 13 видов хвойных: лиственницам Гмелина (Потенко, Разумов, 1996; Semerikov et al., 1999), ольгинской, амурской и камчатской (Semerikov et al., 1999), а также курильской (Гончаренко, Силин, 1997b; Semerikov et al., 1999), сосне могильной (Гончаренко, Силин, 1997а), сосне корейской и сосне приземистой (Крутовский и др., 1990; Goncharenko et al., 1993а; Гончаренко, Силин, 1997а), пихте белокорой и пихте сахалинской (Гончаренко и др., 1998) и тису остроконечному (Потенко, 2001; Potenko, 2001). Причем, по сосне могильной, сосне корейской и сосне приземистой выборки, в среднем, представлены всего 10-13 деревьями, а у пихты белокорой генетическая изменчивость оценена по одной особи.
Таким образом, подобные популяцинно-генетические исследования хвойных пород на Дальнем Востоке России только начинают разворачиваться, а имеющиеся данные носят фрагментарный характер.
Многие животные и растения селятся поблизости от места своего рождения, занимая территорию, которая была достаточно хороша для их родителей, а принимая во внимание тот факт, что скрещивание обычно происходит между особями, находящимися поблизости друг от друга, это приводит к тому, что большая популяция оказывается более или менее подразделенной на небольшие инбредные субпопуляции (Меттлер, Грегг, 1972; Солбриг, Солбриг, 1982). В огромной степени вышесказанное характерно и для хвойных, поскольку их семена обычно падают на землю и прорастают возле материнских деревьев. Поэтому, популяции хвойных зачастую разделены на субпопуляционные структуры -"neighbourhoods" (Tigerstedt et al., 1982; Dancik, Yeh, 1983; Brunei, Rodolphe, 1985).
Для анализа степени подразделенности природных популяций хвойных исследователи LQ пользуется коэффициентами, предложенными С. Райтом (F - статистики) и М. Ней (G статистики) (Nei, 1973,1975,1977; Алтухов, 1989,2003). Еще в 1923 году С. Райт ввел специальный коэффициент для определения уровня инбридинга и назвал его индексом "фиксации". Коэффициент инбридинга определяется как "вероятность того, что данный индивидуум получит от родителей в данном локусе два гена, идентичных по происхождению" (Солбриг, Солбриг, 1982). Позднее С. Райт предложил еще несколько показателей: Fis - коэффициент инбридинга особи (I) относительно популяции или субпопуляции (S); FIT - коэффициент инбридинга особи (I) относительно вида в целом (Т) и FST - коэффициент инбридинга популяции и субпопуляции (S) относительно всего вида (Т) (Алтухов, 1989). Необходимо отметить, что значения Fis и FIT могут быть как положительными, так и отрицательными, что указывает, соответственно, на недостаток или избыток гетерозигот в популяциях. G - статистики разработанные М. Ней также включают в себя несколько параметров: Нт - общее генетическое разнообразие, Hs - среднее генетическое разнообразие внутри популяций, DST - генетическое разнообразие между популяциями и GST - доля межпопуляционного разнообразия (Nei, 1973, 1975). Причем, в одной из своих работ М. Ней (Nei, 1975) показал, что FST И GST эквивалентны друг другу. Вероятно, поэтому многие исследователи используют только один из этих показателей.
К настоящему времени, анализ подразделенности, на основании 20 и более генов, включая мономорфные, осуществлен для 35 видов хвойных из родов Abies, Picea и Pinus (Табл. 2). Приблизительно у половины этих видов обнаружен избыток гетерозигот в популяциях, а у остальных видов был найден недостаток гетерозиготных деревьев. Недостаток гетерозигот был отмечен и для многих перекрестноопыляемых рас ительных видов (Brown, 1979). Для хвойных видов недостаток гетерозигот объясняется частичным самоопылением, скрещиванием близкородственных особей, взятием образцов от нескольких семей с различными аллельными частотами, незначительными генетическими отличиями внутри популяций в ответ на разнонаправленное давление отбора, отбором против гетерозигот на определенной стадии развития и другими причинами (Guries, Ledig, 1982; Dancik, Yeh, 1983; Politov, Krutovskii, 1992; Changtragoon, Finkeldey, 1995; Lee et al., 1998). В то время как избыток гетерозигот у хвойных приписывается как отбору против гомозигот, так и превосходству гетерозигот при балансирующем отборе (Morgante et al., 1993; Krutovskii et al., 1995).
Описание и характер наследования ген-ферментных систем
Популяции сосны корейской оказались менее изменчивыми, что предполагалось выше на основе распределения аллельных частот в популяциях этих видов. Для них значения показателей среднего числа аллелей на локус, полиморфностн по 95 и 99% критериям, ожидаемой и наблюдаемой гетерозиготности, в среднем, равнялись 1,91, 45,5, 54,8, 0,169 и 0,165, соответственно. Также как и у сосны приземистой, показатели ожидаемой и наблюдаемой гетерозиготности для отдельных популяций значимо не отличались друг от друга (Р 0.05). В то же время, значения показателей гетерозиготности значимо отличались между наиболее и наименее гетерозиготными популяциями, а между Галичное (3) и Малиново (10), с одной стороны, и о-в Петрова (14), Лесной (17) и Догордон (2), с другой, были высоко достоверны (Р 0,001).
Для объяснения наблюдаемых различий нужно учитывать гипотезы заселения сосной кедровой корейской территории современного российского Дальнего Востока в голоцене. По данным пыльцевых анализов М. И. Нейштадта (1957) в торфяных отложениях в плейстоцене (более 12 тысяч лет назад) сосна кедровая корейская произрастала за пределами настоящих границ Дальнего Востока России. В раннем голоцене (7700-9800 лет назад) граница её распространения была севернее озера Ханка, а в среднем голоцене (2500-7700 лет назад) достигла устья р. Уссури. Наибольшее развитие этот вид получил в позднем голоцене (0-2500 лет назад), когда он продвинулся далее всего на север.
Исследования В. М. Урусова (1995) ископаемой пыльцы хвойных из низовьев р. Амур "однозначно свидетельствуют о присутствии кедра в составе ценозов юга советского Дальнего Востока в течение всего квартера. Менялась только плотность его ценопопуляций".
Исследования А. М. Короткого с соавторами (1997) говорят о том, что 18-20 тысяч лет назад растительность Сихотэ-Алиня была сходна с современной северо-западного Приохотья. После поздневюрмского похолодания сосна кедровая корейская появилась в горном обрамлении на юге Дальнего Востока в голоцене 9,5 тысяч лет назад. И уже в среднем голоцене северная граница её распространения достигала рек Селемджа, Тугур и Нимелен. Таким образом, ареал сосны кедровой корейской был гораздо шире современного.
В работе Л. В. Голубевой и Л. П. Карауловой (1983) также описывается, что во время поздневюрмского похолодания для среднего Сихотэ-Алиня были характерны березово-лиственничные леса и редколесья с большим участием тундровых фитоценозов и широким поясом горных тундр. Кедрово-широколиственные леса появились в нижнем поясе гор в предбореальном периоде голоцена, то есть более 9800 лет назад.
Мы не наблюдали падения уровня изменчивости по ареалу сосны кедровой корейской в направлении с юга на север, которое могло бы наблюдаться исходя из истории расселения вида в голоцене с юга на север по Нейштадту. Так, например, в самой северной популяции (Галичное) уровень изменчивости превосходил некоторые более южные популяции (см. табл. 10) и был сравним с южнокорейскими (Kim et al., 1994). Высокий уровень изменчивости на Сихотэ-Ллине и в Нижне-Амурской горной группе может служить подтверждением гипотез о длительном присутствии сосны кедровой корейской в этой части ареала (Голубева, Караулова, 1983; Короткий и др., 1997). В то же время, более низкие величины параметров генетической изменчивости в популяциях Малого Хингана - Куканского хребтов (Облучье, Догордон), возможно, свидетельствуют о сравнительно недавнем заселении сосной кедровой корейской этой территории.
В прибрежной части ареала, исторически наиболее молодая популяция пос. Лесной (см. рис. 1), как следует из истории развития растительного покрова на территории юга Дальнего Востока России в плейстоцене и голоцене (Голубева, Караулова, 1983; Короткий и др., 1997), и популяция на о-ве Петрова обладают самыми низкими значениями средней гетерозиготности (см. табл. 10). Следует отметить, что более низкие значения показателей гетерозиготности в краевой части ареала были обнаружены также в популяциях сосны скрученной (Yeh, Layton, 1979) и сосны жесткой (Guries, Ledig, 1982). Авторы объяснили этот факт более интенсивным действием отбора на периферии ареала, дрейфом генов или более сильным инбридингом в небольших популяциях. Низкие параметры генетической изменчивости, обнаруженные на о-ве Петрова, могут быть объяснены действием эффекта основателя при заселении острова сосной корейской. В настоящее время площадь данного острова составляет 36 га, на нем произрастает всего несколько сот деревьев сосны корейской.
По нашим данным, сосна корейская на территории российского Дальнего Востока характеризуется высоким уровнем генетической изменчивости: показатели оказались значительно выше, чем полученные К. В. Крутовским с соавторами (1990) по трем популяциям из Сихотэ-Алиня и его отрогов. Так, среднее число аллелей на локус в настоящем исследовании было 1,91 против 1,69 в работе К. В. Крутовского с соавторами (1990), полиморфность (Р99) - 54,8 против 47,9, ожидаемая гетерозиготность - 0,169 против 0,123. Как отмечено в вышеуказанной работе, "К сожалению, из-за трудностей, связанных с генетической интерпретацией..." изоферментных систем LAP и DIA у P. koraiensis из анализа пришлось исключить локусы Lap-2, Lap-З и Dia-1 (по описанию в статье К. В. Крутовского с соавторами (1987), по-видимому, аналогичные Lap-І и Lap-2 и Dia-І в данном исследовании), которые, по полученным оценкам, отличались высоким уровнем гетерозиготпости (см. табл. 7). Кроме того, в исследованиях отличались численность выборки из популяций, число исследованных локусов и методика анализа (Крутовский и др. (1990) анализировали в среднем - 19 особей в выборке, использовали 16 локусов, из них по 12 локусам анализировали зародыши). По-видимому, наблюдаемые различия в показателях изменчивости вызваны больше указанными причинами, чем действительно существующими различиями в генетической изменчивости популяций.
Тем не менее, показатель среднего числа аллелей на локус (1,91) в российских популяциях оказался несколько ниже, чем в южнокорейских популяциях, где он равнялся - 2,0 (Kim et al., 1994). Также были ниже и другие показатели изменчивости: процент полиморфных локусов (Р99) в южно-корейских популяциях составил 69,0%; ожидаемая гетерозиготность — 0,208. Таким образом, разница в показателях изменчивости между южнокорейскими и российскими популяциями не так существенна, как отмечалось ранее (Kim et al., 1994) на основе сравнения с данными К. В. Крутовского с соавторами (1990). Показатели изменчивости, рассчитанные по 16 общим локусам (Асо, Fl-Est, Gdh, Aat-1, Aat-2, Aat-3, Idh, Lap-1, Mdh-1, Mdh-2, Mdh-3, Mdh-4, Dia-1 (Mnr-A в статье Z.-S. Kim с соавторами (1994)), Pgm-1, Skdh-1 и Skdh-2), были также несколько ниже в популяциях Дальнего Востока России. Это говорит о сравнимости результатов, полученных по 23 локусам для кедровой сосны в Южной Корее и по 26 - в России, и свидетельствует о более древнем происхождении популяций южной части п-ва Корея.
Есть еще одна работа, где приведены данные по генетической изменчивости сосны корейской, которые были получены из анализа одной выборки, состоящей из 13 особей (Гончаренко, Силин, 1997). Значения показателей гетерозиготности для нее были одними из самых высоких для российской части ареала, что вероятно связано с ошибкой выборки особей из популяции. Это замечание в полной мере справедливо и по отношению к результатам этих авторов по другим кедровым соснам, для которых, в среднем, проанализировано от 8 до 13 особей на популяцию.
Частоты аллелей и генетическая изменчивость популяций
Нужно отметить и тот факт, что в большинстве популяций P. funebris был выявлен аллель Mdh-10 85, который имел значительную частоту встречаемости (0,140-0,240), однако отсутствовал в популяциях сосен обьпсновенной и густоцветковой.
Уровень генетической изменчивости в популяциях сосен обьпсновенной, могильной и густоцветковой был оценен на основании значений основньк показателей генетического полиморфизма, рассчитанных по 24 локусам (табл. 21). Он был наивысшим в двух приханкайских популяциях сосны погребальной, при этом в популяциях P. funebris среднее число аллелей на локус равняется 2,18, процент полиморфных локусов (Р99) — 73,3%, ожидаемая гетерозиготность - 0,239, наблюдаемая гетерозиготность - 0,234. Близкими показатели изменчивости оказались в популяциях сосны обьпсновенной, где их значения равняются в среднем 2,11, 71,9%, 0,249 и 0,223, соответственно. Самыми низкими величинами характеризовались популяции сосны густоцветковой, где среднее число аллелей на локус равнялось 1,98, процент полиморфных локусов - 62,5%, ожидаемая гетерозиготность - 0,201, наблюдаемая гетерозиготность — 0,.196.
Генетическая изменчивость сосны обьпсновенной, пожалуй, наиболее изучена среди хвойных видов (Gullberg et al., 1982; Szmidt, 1984; Gullberg et al., 1985; Mejnartowicz, Bergmann, 1985; Muona, Szmidt, 1985; Kinloch et al., 1986; Muller-Starck, 1987; Mejnartowicz, Palowski, 1989; Старова и др., 1990; Гончаренко и др., 1991, 1996; Wang et al., 1991; Goncharenko et al., 1994; Prus-Glowacki, Bernard, 1994; Prus-Glowacki, Stephan, 1994; ІПигапов, 1995; Шигапов и др., 1995; Szmidt et al., 1996; Гончаренко, Силин, 1997; Forrest et al., 2000; Падутов, 2001; Ларионова, 2002; Филиппова, 2002; Шигапова, Шигапов, 2002 и др.), хотя нет ни одного исследования, охватывающего весь ареал Р. sylvestris и, в частности, его дальневосточную часть.
Значения показателей изменчивости для дальневосточных популяций сосны обыкновенной (см. табл. 21) оказались ниже данных для Восточной Европы и Сибири (Goncharenko et al., 1994), которые были получены по сходным популяционным выборкам и с использованием практически одинакового набора локусов. Эти различия могут быть объяснены относительно недавним заселением сосной территории Дальнего Востока (Бобров, 1978), что подтверждается палинологическими исследованиями (Нейштадт, 1964), которые показали, что 10-12 тыс. лет назад ареал сосны обыкновенной был значительно меньше современного, а район оз. Байкал был восточным пределом ее произрастания. Кроме того, на западной границе ареала в Испании, где сосна обыкновенная является реликтом третичного периода и представляет "древний" генофонд было выявлено более высокое аллельное разнообразие (А = 2,86; Prus-Glovvacki, Stephan, 1994).
Уровень генетической изменчивости у сосны густоцветковой оказался значительно ниже, чем в южнокорейских популяциях этой сосны, для которых среднее число аллелей равно 2,4, число полиморфных локусов - 80,2%, ожидаемая гетерозиготность - 0,262, наблюдаемая геторозиготность - 0,258 (Kim, Lee, 1995), а также в Японии и Китае, где значения этих показателей равны 3,5, 64,3%, 0,275 и 0,255 (Szmidt, Wang, 1993), соответственно. Более низкие величины внутрипопуляционной изменчивости сосны густоцветковой можно также объяснить недавним заселением территории Дальнего Востока России (Куренцова, 1962).
Таким образом, исследованные популяции сосен обыкновенной и густоцветковой произрастают на границе своих ареалов и относительно недавно заселили данную территорию, что и обуславливает более низкую генетическую изменчивость в сравнении с популяциями основной части ареалов. Эти результаты хорошо согласуются с данными по краевым популяциям хвойных видов (Bergmann, Gregorius, 1979; Yeh, Layton, 1979; Guries, Ledig, 1982; Hawles, DeHayes, 1994).
В связи с предположением, что P. funebris является гибридом, который возник в результате интрогрессивной гибридизации P. sylvestris и P. densijlora (Урусов, 1974, 1995; Бобров, 1978) нами была предпринята попытка сопоставить уровни изменчивости между тремя видами сосен. Обычно, в гибридных естественных и искусственных популяциях сосен и елей генетическая изменчивость превышает показатели, характерные для родительских видов (Wheeler, Guries, 1987; Yeh, Arnott, 1986; Wang et al., 1990; Korol et al., 1995; Edwards-Burke et al., 1997; Wang et al., 2001). Следует отметить, что на территории Китая гибридная сосна, описанная как P. densiflora var. sylvestriformis (Takenouchi) также характеризуется более высокой внутрипопуляционной изменчивостью (Szmidt, Wang, 1993), по сравнению с родительскими видами - соснами обыкновенной и густоцветковой. У сосны погребальной, только в двух северных популяциях, наиболее близко расположенных к ареалу сосны обыкновенной, уровень изменчивости был выше, чем у сосен обыкновенной и густоцветковой, что свидетельствует в пользу ее возможной гибридной природы. Более низкие значения показателей изменчивости в южных популяциях, по отношению к предполагаемым родительским видам, могут объясняться структурой этой части ареала P. funebris в виде небольших (до 25 плодоносящих деревьев в популяции Горнотаежное) географически изолированных насаждений (см. рис. ЗБ), что подразумевает действие дрейфа генов, который снижает генетическую изменчивость. В пользу существования дрейфа генов в южных популяциях сосны погребальной могут свидетельствовать высокие частоты встречаемости аллельных вариантов, например, Pgm-211 Fl-Est110 и Асо110, по отношению к популяциям сосен обыкновенной и густоцветковой, которые трудно объяснить с позиций только лишь гибридизации. В этой связи также необходимо учитывать данные Г. Э. Куренцовой (1962), которая допускала, что островной характер распространения этой сосны на территории современного Ханкайского бассейна был и в доагрикультурный период, т.е действие дрейфа генов в популяциях могло быть относительно продолжительным. Также как и у кедровых сосен, найденные значения ожидаемой гетерозиготности превышали среднее значение (Не = 0,136) для 93 видов рода Pinus (Hamrick et al., 1992). Таким образом, наши результаты свидетельствуют, что все проанализированные дальневосточные сосны обладают достаточно высоким уровнем генетической изменчивости.
