Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы .
1.1 Преимущества изоферментов и история их становления как генетических маркеров у хвойных 6
1.2. Характер наследования ферментных систем у хвойных 23
1.3. Исследование генетической изменчивости природных популяций рода Pinus 37
1.4. Определение уровня внутри- и межвидовой генетической дифференциации хвойных 42
1.5. Применение метода электрофореза в лесной селекции 46
1.6. Pinus koraiensis Sieb. et Zucc. как объект исследования 51
Глава 2. Материалы и методы .
2.1. Получение экспериментального материала 60
2.2. Электрофоретический анализ 62
2.3. Статистическая обработка 67
Глава 3. Результаты и обсуждение .
3.1. Генетический контроль исследуемых ферментных систем сосны кедровой корейской 75
3.2. Описание ген-ферментных систем
3.2.1 Алкогольдегидрогеназа (к.ф. 1.1.1.1.) 77
3.2.2. Сорбитолдегидрогеназа (к.ф. 1.1.1.14.) 79
3.2.3. Шикиматдегидрогеназа (к.ф. 1.1.1.25.) 79
3.2.4. Малатдегидрогеназа (к.ф. 1.1.1.37.) 80
3.2.5. Изоцитратдегидрогеназа (к.ф. 1.1.1.42.) 81
3.2.6. 6-фосфоглюконатдегидрогеназа (к.ф. 1.1.1.44.) 82
3.2.7. Формиатдегидрогеназа(к.ф. 1.2.1.2.) 83
3.2.8. Глутаматдегидрогеназа (к.ф. 1.4.1.2.) 83
3.2.9. Диафораза (к.ф. 1.6.4.3.) 84
3.2.10. Аспартатаминотрансфераза (к.ф. 2.6.1.1.) 85
3.2.11. Глутаматпируваттрансаминаза (к.ф. 2.6.1.2.) 87
3 2.12. Фосфоглюкомутаза (к.ф. 2.7.5.1.) 87
3.2.13. Флуоресцентная эстераза (к.ф. 3.1.1.2.) 88
3.2.14. Лейцинаминопептидаза(к.ф. 3.4.11.1.) 88
3.2.15. Аконитаза (к.ф. 4.2.1.3.) 90
3.3. Частоты аллелей и показатели полиморфизма в популяциях P. koraiensis 91
3.4. Подразделенность и дифференциация в популяциях P. koraiensis 98
3.5. Время дивергенции и история вида на территории Дальнего Востока 105
3.6. Генетические маркеры в семеноводстве P. koraiensis 108
3.7. Сохранение генофонда вида 112
Выводы 115
Литература Г, 7
- Определение уровня внутри- и межвидовой генетической дифференциации хвойных
- Электрофоретический анализ
- Малатдегидрогеназа (к.ф. 1.1.1.37.)
- Частоты аллелей и показатели полиморфизма в популяциях P. koraiensis
Введение к работе
«Виды животных и растений и естественные экосистемы, которыми изобилует наша Земля, будут в скором времени рассматриваться как блага, которые следует сохранять и рационально использовать в интересах всего человечества.»
Наше Общее Будущее: Доклад Международной комиссии по окружающей среде и развитию, 1989 г.
Оценка генетического разнообразия в популяциях и выяснение механизмов его поддержания, раскрытие генетических последствий отбора и других факторов микроэволюции, установление источников генетической изменчивости в популяциях и изучение системы вида и начальных этапов процесса видообразования являются задачами экспериментальной генетики популяций. Генетика популяций среди направлений современной генетики и биологии занимает особое место будучи с методологической точки зрения наиболее формализованной областью исследований, и наиболее актуальной с точки зрения анализа динамической системы природа - общество. Хотя антропогенное давление испытывает биосфера в целом, точкой приложения соответствующих внешних воздействий оказываются популяции - элементарные самовоспроизводящиеся и структурные единицы, обеспечивающие преемственное существование и развитие живого (Алтухов, 1989).
До недавнего времени анализ популяций осуществлялся преимущественно по морфологическим признакам. Подавляющая часть генетических различий, однако, таким путем не выявляется. Решительный сдвиг на пути к раскрытию генетической гетерогенности в популяциях произошел благодаря новым принципам и методам генетического анализа, основанных на маркировании белками генетических систем организма.
В настоящее время белки-маркеры успешно применяются в селекции для паспортизации генотипов элитных животных, получения гетерозисных особей с улучшенными хозяйственными признаками и регистрации сдвига в генных частотах в ходе селекции и производственного культивирования животных и растений (Nielsen, 1985; Левитес, 1986; Князев, Тихонов, 1988; Бороздин и др., 1992, О'Брайен и др., 1993 и др.). Благодаря применению разработанных ген-ферментных систем проведено изучение структуры популяций и сортов злаковых, бобовых культур, подсолнечника (Созинов, Лаптев, 1986; Лещенко и др., 1990; Конарев и др., 1993 и др.), а также многих лесных древесных видов (Hamrick et al., 1979; Hamrick, Godt, 1989; Гончаренко и др., 1989 и др.).
Использование маркеров позволило вскрыть громадную изменчивость в диких популяция* животных и растений (Lewontin, Hubby, 1966; Левонтин, 1978, Алтухов, 1983, Айала, 1984, Ledig, 1986), о которой многие ученые и не подозревали ранее.
Особенно перспективно применение методов белковых маркеров в лесной селекции, поскольку длительная смена поколений у древесных не позволяет использовать традиционные методы генетики и селекции (скрещивания и анализ потомства в нескольких поколениях) для улучшения хозяйственных признаков деревьев. Исследования хвойных пород с применением белковых маркеров уже давно проводятся в рамках древесно-улучшающих программ основных лесообразующих видов в популяциях США, Канады, Японии, Западной и Северной Европы (MuUer G., 1976; Adams, 1983; Cheliak Y.M., Yeh F.C.X., Pitel J.A., 1987; Ennos R.A., Tang Qian, 1994; Беликов, 1997). Метод электрофоретического фракционирования изоферментов с последующим их гистохимическим выявлением рекомендован «Центрлессемом» Российской Федерации в качестве метода идентификации партии лесных семян. (Наставление по лесосеменному делу в Российской Федерации, 1994).
Учитывая, что сосна кедровая корейская (Pinus koraiensis Sieb. et Zucc.) является основным компонентом дальневосточных кедрово-широколиственных лесных формаций, имеющих огромное водоохранное, водорегулирующее, противоэрозионное, рыбоохранное, санитарное и эстетическое значение, и, которые, по мнению лесоводов (Петропавловский, 1999; Ирошников, Твеленев, 2001; Шейнгауз, Шевейко, 2001 и др.) в настоящее время истощены в результате нерегламентированного использования, целью работы было изучить генетическую изменчивость и дифференциацию природных популяций сосны кедровой корейской на Дальнем Востоке методом электрофоретического фракционирования белков семян с последующим их гистохимическим выявлением.
При этом решались следующие задачи:
Подобрать условия электрофоретического разделения изоферментов и установить их генетический контроль.
Описать и проанализировать ген-ферментные системы в гаплоидной ткани семян сосны кедровой корейской.
Исследовать генетическую структуру и определить уровни генетической изменчивости популяций P. koraiensis.
Определить уровни генетической дифференциации и подразделенности естественных популяций.
Проанализировать относительное время обособления популяций, как один из аспектов истории вида на территории Дальнего Востока.
Рекомендовать лесохозяйственному производству белковые маркеры при работе с селекционным материалом.
Обосновать норматив выделения генетических резерватов с целью сохранения генофонда исследуемого вида.
Автор считает своим долгом выразить чувство глубокого восхищения и уважения своему научному руководителю ВВ. Потенко, с которым довелось трудиться с момента организации им в 1903 г. первой на Дальнем Востоке лаборатории генетики и лесной селекции, сначала в Дальневосточном НИИ лесного хозяйства (ДальНИИЛХ), которая затем (в 1994 г.) была перенесена в Хабаровский селекционно-семеноводческий лесохозяйственный центр (ХабССЛХЦ). Поблагодарить директора ХабССЛХЦ Ю.Д. Кныш и директора ДальНИИЛХ Д.Ф. Ефремова за предоставление помещений под биохимические лаборатории. За предоставление места работы в сложное перестроечное время - Б.А. Воронову, директору Института водных и экологических проблем (ИВЭП). За создание режима благоприятствования для работы над диссертацией и за отеческое наставление автор благодарен Чакову ВВ., заведующему лабораторией ресурсов болот и леса ИВЭП ДВО РАН. И многим другим людям - российским и зарубежным коллегам; труженикам леса, администраторам и служащим, чьи отзывчивость и доброта содействовали нам при сборе и переработке материала; переводчикам, рецензентам и издателям при подготовке и публикации научных работ по теме диссертации, а также при популяризации приобретенного опыта на конференциях, производственных совещаниях, на встречах с коллективами и личных беседах.
Работа частично поддерживалась грантом Ассоциации Модельный Лес "Гассинский" (при содействии Model Forest "McGregor", Канада), плановым финансированием Управления лесами Хабаровского края, а затем и Департамента природных ресурсов по ДВ региону по темам НИР.
Результаты работы были иллюстрированы и подготовлены для устного доклада за счет средств гранта Дальневосточного Отделения Российской Академии (Раздел А. Проект № 73. договор от 17.06.2002 г.).
Определение уровня внутри- и межвидовой генетической дифференциации хвойных
Достоверные различия найдены между 18 островными популяциями Pinus риті la в ходе исследований выполненных сотрудниками Университета в Цукубе (Tani et al., 1996). По локусам Sdh-1, G2d (к.ф. 1.1.1.29), Mdh-1 и Fm (к.ф. 4.2.1.2) внутриполуляционная генетическая изменчивость в краевых южных популяциях была выше, чем в северных. Что позволило японским исследователям предположить о существовании корреляции между аллельными частотами и гетерозиготностью указанных локусов с градиентом среды, а также с условиями миграции, историей вида на японском архипелаге и эколого-географическими характеристиками Р. риті la (Tani et al., 1996).
Американскими исследователями (Schmidtling, Hipkins, 1998) обнаружен тренд с востока на запад в изменчивости параметров генетического разнообразия 23 популяций Pinus palustris, рассчитанных по 24 изоферментным локусам, указывающий на тесную корреляцию с географической долготой: все показатели внутрипопуляционной- изменчивости снижались с запада на восток (решающим климатическим показателем было количество выпадаемых осадков, которое снижалось в обратном направлении). Также наблюдался значительный тренд с севера на юг по аллоферментной изменчивости и адаптивным признакам также указывающий на тесные корреляционные связи. Данные наблюдения в сочетании с анализом ископаемой пыльцы позволили проследить древние пути миграции P. palustris на юго-востоке северо-американского континента (Schmidtling, Hipkins, 1998).
Для Pinus koraiensis уже в 1994 году были определены основные показатели генетической изменчивости восьми южно-корейских популяций (Kim et al, 1994). В целом из 23 проанализированных локусов 22 оказались полиморфными. В среднем 16 полиморфных локусов на популяцию (от 52% до 87%). По большинству полиморфных локусов было встречено 2-3 аллеля, а по локусам Мпг-1 и Skdh-І обнаружено по 5 аллелей. Аллельное разнообразие варьировало от 1,7 до 2,3 аллелей на локус. Наблюдаемая гетерозиготность принимала значения от 0,157 до 0,268, ожидаемая - от 0,157 до 0,247. Соотношение наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности свидетельствовало о присутствии отбора в 7 из 8-ми изученных популяций. Причем в шести популяциях наблюдаемая гетерозиготность была меньше ожидаемой при независимом расщеплении в соответствии с законом Харди-Вайнберга. В единственной популяции (Mt. Songni) наблюдалось превышение наблюдаемой над ожидаемой гетерозиготкостью. А в популяции Кайджи (Mt. Kaji) они оказались равными. Сравнивая генетическую изменчивость в различных популяциях оказалось, что наиболее высокими показателями генетического разнообразия обладает популяция, занимающая северо-восточные склоны г. Кайя-сан (Национальный парк "Гора Кайясан), а наименее полиморфная и с меньшим числом аллелей на локус - популяция Кайджи (Kaji). (Kimetal., 1994а).
Что касается российской части ареала, то исследования были проведены лишь по 4 популяциям В исследованиях Крутовского с соавторами (Крутовский и др., 1990) на материале из российской части ареала P. koraiensis показатели генетического разнообразия были определены по 16 локусам (Adh-1, Dia-1, Fe-2, Gdh, Got-1, Got-2, Got-3, Idh, Mdh-1, Mdh-2, Mdh-3, Mdh-4, Pgi-2, Pgm-l, Pgm-2 и Skdh-1) для трех популяций. Среднее число аллелей на локус колебалось от 1,56 (популяция Сихотэ-Алинь) до 1,75 (популяции Хорский и Малохехцирское). Полиморфность по 99% критерию была наиболее высокой в Хорской популяции (56,25), а по 95% критерию была равной во всех популяциях (37,50). Показатель ожидаемой гетерозиготности колебался от 0,116 (популяция Сихотэ-Алинь) до 0,130 (Хорский). На этом же материале Политов с соавторами (1992) опубликовал работу о генофондах популяций кедровых сосен по совокупности 20 изоферментных локусов. Для Р. koraiensis были дополнены локусы Dia-2, Lap-2 и Lap-З (Политов и др., 1992).
Белорусские исследователи (Гончаренко, Силин, 1997а) обнаружили 36 аллельных вариантов по 20 проанализированным локусам (Aat-1, Aat-2, Aat-3, Adh, Gdh, Gpi, Fl-est, Dia-1, Dia-2, Dia-3, Skdh, Idh, Lap-1, Lap-2, Mdh-1, Mdh-2, Mdh-3, Mdh-4, Pgm-l, Pgm-2) для 13 деревьев Pinus koraiensis из популяции Кедровая Падь. Доля полиморфных генов составила 50%. Среднее число аллелей на локус (и среднее число нередких аллелей на локус, т.е. с частотой более 1 %) оказалось равным 1,8. Значение ожидаемой гетерозиготности составило 0,212, а наблюдаемой - 0,233.
Таким образом, наиболее высокий уровень изменчивости обнаружен в южно-корейских популяциях. Уровни полиморфизма, установленные для российской части ареала сосны кедровой корейской носят фрагментарный характер и выглядят противоречивыми. 1.4. Определение уровня внутривидовой генетической подразделенное и дифференциации
На основании электрофоретического анализа изоферментов, можно определить не только величину генетической изменчивости, но и степень подразделенности, интенсивность межпопуляционного генного потока, уровень дифференциации. Изучение аллоферментов показало, что древесные лесные виды, и в частности хвойные, являются наиболее полиморфными видами (Hamrick, Godt, 1989). Кроме того, доказано, что такой запас генетической изменчивости является результатом длительного естественного отбора, а характер его распределения внутри и между популяциями отражает историю вида (Ledig, 1986; Bush, Smouse, 1991). Таким образом, исследование генетической подразделенности и дифференциации популяций растений является актуальной проблемой популяционной и эволюционной биологии, поскольку от её решения зависит целостность теории видообразования, систематики, а также решение вопросов управления процессами, протекающими в природных и искусственных популяциях (Алтухов, 1989, Гончаренко, 1991 и др.).
На основании обнаруженных методом изоферментного анализа аллелей и вычисленных аллельных частот для каждой популяции и вида в целом определяются следующие показатели генетической дифференциации (коэффициент дистанции Ней, DN) И подразделенности (F- статистики Райта и G-статистики Ней), к которым относят: коэффициент инбридинга особи относительно популяции (Fis), коэффициент инбридинга особи относительно вида в целом (FIT), коэффициент инбридинга популяции (субпопуляции) относительно всего вида (FST), позволяющий рассчитать интенсивность генного потока между популяциями (Nem), общее генетическое разнообразие (Нт), среднее генетическое разнообразие внутри популяции (Hs), генетическое разнообразие между популяциями (DST) И доля межпопуляционного разнообразия (GST)- Биологический смысл используемых показателей внутривидовой генетической дифференциации и математический аппарат излагаются в главе "Материалы и методы".
На сегодняшний день показатели подразделенности определены для многих представителей рода Pinus (табл 3). Так, например, в подроде Diploxylon коэффициенты FST И GST составляли 2% у представителей секции Banksia - P. contorta и P. banksiana (Dancik, Yeh, 1983); в секции Eupitus 3,9% у Iі. densiflora и 4,2% у P. thunbergii (Kim, Lee, 1995), 2,8% у P. sylvestris (Goncharenko et al., 1994); и в секции Pseudostrobus 12% у P. ponderosa (O Malley et al., 1979); в секции Taeda подразделенность составляла 2,4% у P. rigida (Guries, Ledig, 1982), 12% у P.attenuaia, 13% P. radiata и даже 22% у P. muricata (Millar et al., 1988); в секции Australes 4,1% у P. palustris (Schmidtling, Hipkins, 1998).
Электрофоретический анализ
Электрофоретическое фракционирование ферментов осуществлялось в крахмальных гелевых блоках в бытовых холодильниках. Крахмал гидролизовали самостоятельно, по уже отработанной методике (Гончаренко, Падутов, 1988с; Гончаренко и др., 1989). Использовался 13-15% крахмальный гель. Для придания гелю эластичности мы использовали смесь гидролизованного и негидролизованного крахмала, соотношение которых подбиралось эмпирически. Во избежание подгорания при варке и улучшения механических свойств геля добавлялась 10% сахароза. Полимеризацию производили в течение 45-50 минут в холодильнике.
Использовались источники постоянного тока УИП-2 и PS 500-2 фирмы «Сигма». В качестве электродов использовалась платиновая проволока. Для горизонтального электрофореза использовались кюветы, сделанные из органического стекла, формирующие гелевый блок - 186 х 168 мм. Электродные кюветы были размером 210 х 120 х 50 мм. В качестве токопроводящих мостов использовались полосы вафельного полотенца. Сверху токопроводящих мостов и геля укладывалась тонкая полиэтиленовая изолирующая пленка, предохраняющая гель от высыхания. Для разметки и пробивки стартовых щелей использовались самодельные стальные гребенки на 25 и 37 зубьев, с высотой зуба 10-14 мм. Для взвешивания реактивов, компонентов геля использовались электронные весы «Ohaus Scout» Модель SC2020. Для приготовления буферных растворов использовался рН-метр «Орион» Модель 320.
В качестве электродных и гелевых буферных растворов мы использовали три буферные системы: (А) трис-ЭДТА боратную (с рН 8,6), (В) трис-цитратную (с рН 6,2) и (С) трис-цитрат/трис-HCl прерывистую буферную систему (с рН 8,0).
Для приготовления трис-ЭДТА-боратного буфера (рН 8,6) в одном литре дистиллированной воды растворяют 109 г трис(оксиметил)аминометана (0,9М), 31 г борной кислоты (0,5М) и 7,6 ЭДТА-№2 (0,02М). Полученный состав является «маточным». Его 5-ти кратное разбавление дает раствор электродного буфера, а разбавление порядка 15 мл на 360 мл - гелевый буфер.
Для приготовления трис-цитратного буфера (рН 6,2) в одном литре дистиллированной воды растворяют 27 г трис(оксиметил)аминометана (223мМ) и 16,5 г лимонной кислоты (86мМ). Этот состав используется без разбавления для электродного буфера, а разбавление порядка 12 мл на 280 мл дает раствор гелевого буфера.
Для приготовления трис-HCl буфера (рН 8,0) 78 г трис(оксиметил)аминометан гидрохлорида (0,5М) растворяют в 1 л дистиллированной воды, и, по мере доведения рН, вносят NaOH. Этот состав является «маточным». Его разбавление порядка 12,5 мл на 360 мл дает раствор гелевого буфера.
В качестве основного буферного раствора для окраски использовали трис-HCl буфер с рН 8.0, приготовленный по вышеуказанному способу. Также использовали буферные растворы: (D) фосфатный -для окраски аспартатаминотрансферазы и (Е) ацетатный - для окраски лейцинаминопептидазы и флуоресцентной эстеразы (табл. 9.).
Электрофоретический анализ изоферментов гаплоидных мегагаметофитов позволяет в случае обнаружения менделевской сегрегации (1:1) аллельных продуктов (аллозимов) среди мегагаметофитов семян гетерозиготных деревьев установить их генетический контроль (Алтухов и др., 1986). Поскольку мы имеем дело с диплоидными организмами, то вероятность ошибки в определении обоих наборов генов рассчитывается из соотношения: Р = 0,5я- ,
где п - это количество проанализированных мегагаметофитов. Поэтому от каждого дерева для анализа брались мегагаметофиты не менее чем шести семян, что позволяло при отсутствии нарушения агрегаций с вероятностью более 0,95 правильно определить генотип дерева по каждому локусу.
Для этого с каждого семени удалялись твердая оболочка и нуцеллус, затем срезался тонкий слой ткани мегагаметофита и гомогенезировалось в 100 - 120 мкл экстрагирующего буфера (1% PVP-40, Тритон Х-100, 0,2% аскорбиновой кислоты в трис-HCl буфере). Гомогенизация осуществлялась вручную стеклянной палочкой. Для переноса гомогената в гель использовали бумажные фитили (Ватман ЗММ), которые вставлялись в стартовые щели гелевого блока.
Электрофоретическую разгонку проводили в холодильной камере при +4 С в течение 4-14 часов. После разгонки ферментов из гелевого блока толщиной 10-12 мм удается получить 6-8 срезов, каждый из которых помещается в отдельную кювету и красится на отдельный фермент.
Анализ материала 899 деревьев из природных популяций P. koraiensis проводился нами по 15 ген-ферментным системам (табл. 10.). Окрашивание ферментов проводили по стандартным методикам (Cheliak, Pitel, 1984; Гончаренко, Падутов, 1988с; Гончаренко и др., 1989; Гончаренко, Силин, 1997) с небольшими модификациями. Гелевый срез заливали раствором и затем инкубировали в темноте при 35С до появления фракций фермента. Благодаря различной электрофоретической подвижности фракций дегидрогеназ окраска ADH была возможна с одновременным окрашиванием GDH, а в некоторых случаях и SDH. При совместном окрашивании этанол (субстрат) добавлялся после появления фракции GDH и SDH.
Малатдегидрогеназа (к.ф. 1.1.1.37.)
У мегагаметофитов P. koraiensis электрофоретический спектр данного фермента состоял из четырех зон (рис. 14). Самая быстрая зона кодировалась мономорфным локусом Mdh-1.
Более медленная зона находилась под контролем локуса Mdh-2, в котором мы обнаружили три аллеля Mdh-2a ;, Mdh-21 00 и Mdh-21 05. Нами встречена единственная гетерозигота, несущая редкий аллель ограниченного распространения - Mdh-21 05 (выборка Мульча).
Локус Mdh-З был представлен тремя аллелями: редкий ограниченного распространения Mdh-З , общий широкого распространения - Mdh-З1 00 и редкий широко распространенный Mdh-З . По данному локусу зарегистрировано: 3 гетерозиготы Mdh-З 65/1 00 в выборке Мельничное и 11 гетерозигот Mdh-З100/114- Облучье, Бойцово, Покровка, Малиново и Устиновка.
Самая медленная зона (MDH-4) была представлена тремя вариантами - 0; 1,00 и 1,14, кодируемыми соответственно аллелями: общими широкого распространения Mdh-4 и Mdh и редким локального распространения Mdh-41 14 (табл. 11). Аллель Mdh-41 14 был встречен в выборке Мульча.
Ким с соавторами (Kim et al., 1994), работая по корейской части ареала данного вида, выявили четыре локуса Mdh, в которых были учтены: Mdh-A -2 аллеля; Mdh-B - 3 аллеля; Mdh-C - 3 аллеля и Mdh-D - 2 аллеля, включая один общий широко распространеный «нуль-аллель» , что соответствует нашим наблюдениям по Mdh-4.
Для российской части ареала учитывалось как три локуса Mdh-1, -2, -3 (Белоконь и др., 1998), так и четыре слабополиморфных локуса (Крутовский и др., 1990; Krutovskii et al., 1994; Politov, Krutowskii, 1994; Гончаренко, Силин, 1997a). Локус Mdh-1 везде учитывался как мономорфный.
Локус Mdh-2 был представлен 2 аллелями (Mdh-20 90; Mdh-21 00), Mdh-3 - двумя аллелями, и локус Mdh-4 - тремя аллелями, Mdh-4; Mdh-40 80; Mdh-41 00 (Гончаренко, Силин, 1997а).
При исследовании в тканях P. koraiensis изоцитратдегидрогеназа выявлялась в виде слабополиморфной зоны (рис 15). Было обнаружено две электрофоретических фракции, кодируемых общим широко распространенным аллелем Idh1 00 и редким ограниченного распространения аллелем Idh
Единственная гетерозигота по ней была встречена в популяции Догордон, где из 16 проанализированных мегагаметофитов от одного дерева семь несли медленную фракцию (с подвижность 0,80). То есть аллель Idh встречается с частотой менее чем 0,00123 (единственный аллель на более чем 5700 геномов, общее число проанализированных мегагаметофитов).
Ким с соавторами (1994) обнаружили три аллеля, включая один редкий аллель широкого распространения, его частота в южнокорейских популяциях колебалась от 0,015 до 0,075.
Другими исследователями российских популяций P. koraiensis полиморфизма по этому локусу не обнаружено (Крутовский и др., 1990; Гончаренко, Силин, 1997а; Белоконь и др., 1998). .6. 6-фосфоглюконатдегидрогеназа (к.ф. 1.1.1.44) 6-PGD выявлялась сложным спектром, в котором были различимыми три зоны и слабопрокрашиваюшаяся инертная зона (рис. 16). Анализ расщепления подтвердил генетическую природу электрофоретических фракций быстрой зоны активности фермента. Зона кодируется одним локусом б-Pgd-l. По этому локусу было встречено два общих аллеля широкого распространения: б-Pgd-l1 00 и б-Pgd-l111 (табл. 11). По локусу б-Pgd-l было встречено 155 гетерозигот.
Частоты аллелей и показатели полиморфизма в популяциях P. koraiensis
На основании анализа электрофоретических данных по 26 локусам рассчитали аллельные частоты в популяциях (табл. 13). Сравнение частот аллелей по всем локусам позволяет сделать вывод о том, что в пределах каждой популяции аллели встречаются с определенной частотой, которая характерна только для этой популяции. Частоты аллелей по 26 генетическим локусам в 25 российских популяциях P. koraiensis являются исходным материалом для всех последующих статистических расчетов (табл. 13).
Наиболее изменчивыми в проанализированных популяциях оказались 7 локусов: Adh-1 (наблюдаемая гетерозиготность Н0 равна 0,398 ), Adh-2 (Н0 = 0,421), Skdh-1 (Н0 = 0,427), Dia-1 (Но = 0,408 ), Gpt (Н„ = 0,359), Lap-1 (Н0 = 0,505) и Lap-2 (Н0 = 0,547), поскольку их средняя наблюдаемая гетерозиготность у P. koraiensis в целом превышала 35%. Среднеполиморфными (средняя наблюдаемая гетерозиготность не превышает 35%) оказалось 7 локусов: Mdh-2 (Н„ = 0,283), Mdh-4 (Н0 = 0,152), б-Pgd-l (На = 0,165), Dia-3 (Н0 = 0,156), Aat-З (Но = 0,320), Pgm-1 (Н„ = 0,290), Fl-est (Н0 = 0,064). Наименее изменчивыми (средняя наблюдаемая гетерозиготность менее 5%) оказалось 9 локусов: Sdh (Н0 = 0,001), Skdh-2 (Н0 = 0,011), Mdh-З (Н0 = 0,020), Idh (Н0 = 0,001), 6-Pgd-2 (Н0 = 0,001), Fdh (Н0 = 0,017), Gdh (Но = 0,043), Pgm-2 (Н„ = 0,001), Асо (Н0 = 0,007). Мономорфными во всех 25 исследованных популяциях оказались 3 локуса: Mdh-1, Aat-1 и Aat-2. Обращает на себя внимание, что из 86 аллелей, найденных в природных популяциях P. koraiensis найдены 21 редких аллеля ограниченного распространения, так как они были встречены только в одной популяции с частотой менее 10%,
На основе представленных аллельных частот по 26 генам были рассчитаны основные показатели генетической изменчивости в 25 популяциях P. koraiensis (табл. 14).
Доля полиморфных локусов по 99% критерию в популяциях Российского Дальнего Востока колеблется от 50,00 до 69,23%. Интересно отметить, что наибольшие значения наблюдаются в центральной (Малиново) и в одной краевой (Галичное) популяции, Р99 равно 69,23 и 65,38%, соответственно. А наиболее низкие значения (50,00%) наблюдаются как в наиболее южной прибрежной популяции (остров Петрова), так и в северо-западной популяции (Кукан). В то же время высокие значение Р99 (61,54%, выше среднего) наблюдались как в краевых северо-западных популяциях (Облучье, Ниран) популяциях, вюжных (Кедровая Падь, Архипонка, Устиновка), так и в ряде популяций, относимых к зоне оптимума произрастания (Сукпай, Обор, Медвежий, Покровка). Сходная тенденция сохраняется и по другим показателям.
Показатель Р95 принимал значения от 42,31 до 57,69. Наиболее высокие значения показателя Р95 наблюдались как в краевых популяциях Галичное и Пивань, так и в некоторых центральных популяциях (Медвежий, Малиново). А наиболее низкие значения наблюдались в популяции о. Петрова (южная прибрежная популяция) и некоторых северо-западных популяциях (Сельгон, Сутара). Сходные выше среднего значения Р95 наблюдались в популяциях, относящихся к периферии ареала северо-восточная популяция Лесное, северозападная популяция Догордон, южная Кедровая Падь, на восточных отрогах Сихотэ-Алиня -Киевка, Архиповка, Устиновка), так и в популяциях зоны оптимума произрастания (Сукпай, Обор, Покровка).
Средняя ожидаемая гетерозиготность () принимала значения от 0,152 до 0,215, составляя в среднем для вида 0,179. Наибольшие значения ожидаемой гетерозиготности наблюдались как в центральной популяции Малиново, так и в самой северной популяции Галичное (Не=0,215 и 0,201, соответственно). Наименьшие значения по этому показателю наблюдались в краевых популяциях - Сельгон, о. Петрова, Ниран и Лесное, принимая соответственно значения 0,152, 0,157 и 0,162, у двух последних. Как и по другим показателям выше среднего значения показатели Не (от 0,181 до 0,195) наблюдались в различных частях ареала - Архиповка, Медвежий, Пивань, Покровка, Терней, Мульча, Устиновка, Бурга, Кедровая Падь, Обор).
