Введение к работе
Актуальность проблемы. С развитием молекулярной биологии и генной -инженерии неразрывно связано развитие новых биотехнологий. В частности, в настоящее время можно получить штамм-продуцент практически любого белка (Ferguson etal., 2001). Поэтому разработка и создание новых высоко эффективных биотехнологий получения белков в настоящее время приобретает большую актуальность и значимость. При этом основные усилия при - их разработке направлены, прежде всего, на сокращение, упрощение и удешевление процедур выделения и очистки белковых молекул (Галаев, 1999). Технологии, позволяющие решать задачи быстрой наработки чистых белков с минимальными затратами, не только расширяют арсенал известных методов белковой химии, но и, в свою очередь, интенсифицируют поиски путей и возможностей в расширении спектра практического применения белков, прежде всего, обладающих маркерными свойствами, например, в иммунологии, фармакологии и медицине. В связи с этим данная работа посвящена исследованиям по разработке и созданию новой высокоэффективной технологии выделения и очистки рекомбинантных белков, не требующей применения хроматографического оборудования и сорбентов и позволяющей значительно, упростить и ускорить процедуру их получения.
Цели настоящего исследования — обоснование и разработка новой биотехнологии для очистки рекомбинантных белков без применения хроматографии - метода лигандообменного разделения белков (ЛОРБ).
Основные задачи исследования:
Сформулировать основные, принципиальные положения метода ЛОРБ и провести проверку его пригодности в модельных экспериментах на примере разделения смеси коммерческих белковых препаратов.
Исследовать применимость метода ЛОРБ для выделения и очистки из биомассы бактериальных клеток Е. coli рекомбинантных Са2+-активируемых фото протеинов: апообелина, апоакворина и их мутантных форм.
Исследовать применимость метода ЛОРБ для выделения и очистки из бактериальных клеток Е. coli рекомбинантной бактериальной люциферазы.
Разработать общую технологическую схему выделения и очистки, рекомбинантных белков методом ЛОРБ.
Научная новизна работы. В результате проведенных исследований был обнаружен эффект преципитации белков в растворе под действием низких концентраций ионов двухвалентных металлов. Изучение данного эффекта и анализ полученных результатов позволил обосновать, разработать и предложить новый метод выделения и очистки белковых молекул, получивший название «лигандообменное разделение белков» (ЛОРБ). Предложенный метод нашел свою практическую реализацию в решении ряда прикладных задач, связанных с выделением и очисткой различных рекомбинантных белков. На основе метода ЛОРБ были разработаны схемы выделения и очистки мономерньж белков фотопротеиновой группы - апообелина, апоакворина, а также их различных мутантов. Разработана схема, позволяющая с помощью метода ЛОРБ проводить столь же эффективное выделение и очистку гегеродимерного белка - бактериальной люциферазы. На основании анализа
- j. *
полученньж результатов была обоснована и предложена общая принципиальная схема выделения и очистки белков технологией ЛОРБ. Была также предложена и продемонстрирована действующая модель технологической установки, показывающая на примере рекомбинантного апообелина возможность проведения процесса очистки белка методом ЛОРБ непрерывно.
Теоретическая и практическая значимость работы. Проведенные исследования дополняют и расширяют представления о координационных и лигандообменных взаимодействиях ионов двухвалентных металлов с белковыми молекулами в растворе, что имеет несомненную общебиологическую значимость. Учитывая результаты работы можно с большой долей уверенности говорить о том, что создана новая высокоэффективная технология, основанная на принципах лигандообменных взаимодействий/ расширяющая арсенал известных методов, применяемых в белковой химии, и позволяющая в значительной мере интенсифицировать процессы разделения и очистки белковых молекул. Отличаясь от известных методов простотой, метод ЛОРБ не требует использования дорогого специализированного хроматографического оборудования и сорбентов, является экспрессным и позволяет с высокой эффективностью получать высокоочищенные белки из сложных белковых смесей. Это дает основания полагать, что предложенная в работе технология имеет широкие перспективы практического применения.
Основные положения, выносимые на защиту:
Новый метод ЛОРБ позволяет проводить разделение белковых молекул без применения хроматографии.
Метод ЛОРБ применим для выделения и очистки из клеточной биомассы бактериальных клеток Е. соїірядя рекомбинантных белков, таких как апобелин, апоакворин, некоторых их мутантов, бактериальной люциферазы.
Предложенная общая схема разделения и очистки белков методом ЛОРБ позволяет выбрать стратегию поиска оптимальных вариантов применения данного метода при решении практических задач белковой химии.
Апробация работы и публикации. Материалы диссертационной работы
докладывались на IV Съезде Белорусского Общественного Объединения
Фотобиологов и Биофизиков «Молекулярно-клеточные основы
функционирования биосистем» (Минск, 2000), I Международном Конгрессе "Биотехнология - состояние и перспективы развития" (Москва, 2002), на семинарах лаборатории - фотобиологии Института биофизики СО РАН. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи и 2 тезисов.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, шести глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 121 странице машинописного текста, содержит 29 рисунков и 4 таблицы. Список цитируемой литературы включает 149 источников, из них 134 зарубежных.
