Содержание к диссертации
Введение
Глава І. Клинико-морфологические и патофизиологические особенности красного плоского лишая слизистой оболочки полости РТА 12
1.1. Современные аспекты клинико-патогенетической и морфологической картины красного плоского лишая слизистой оболочки полости рта 12
1.2. Роль иммунных механизмов в развитии красного плоского лишая 22
1.3. Краткая характеристика факторов общего иммунитета в полости рта 24
1.4. Роль свободнорадикального окисления в развитии красного плоского лишая 30
1.5. Роль микроорганизмов в развитии красного плоского лишая 32
1.6. Резюме 34
Собственные исследования
Глава 2. Характеристика клинических наблюдений и методов исследования 35
2.1. Общая характеристика клинических наблюдений 35
2.2. Методы клинического исследования 35
2.3. Методы патоморфологического исследования 41
2.4. Методы биохемилюминесцентного исследования 43
2.5. Методы исследования системного и местного цитокинового статуса 44
2.6. Методы микробиологического исследования 46
2.7. Методы статистической обработки 47
2.8. Резюме 48
Глава 3. Клинико-микробиологическая характеристика полости рта при красном плоском лишае слизистой оболочки полости рта 49
3.1. Клинические проявления красного плоского лишая слизистой оболочки полости рта з
3.2. Стоматологический статус пациентов с красным плоским лишаем слизистой оболочки полости рта 55
3.3. Соматический статус пациентов с красным плоским лишаем слизистой оболочки полости рта 58
3.4. Микробиологический статус пациентов с красным плоским лишаем слизистой оболочки полости рта 60
3.5. Резюме 66
Глава 4. Патоморфологический и иммуногистохимический анализ слизистой оболочки полости рта при красном плоском лишае 68
4.1. Патоморфологический анализ слизистой оболочки щеки пациентов с красным плоским лишаем слизистой оболочки полости рта 68
4.2. Пролиферативная активность эпителиоцитов слизистой оболочки щеки пациентов с красным плоским лишаем слизистой оболочки полости рта 77
4.3. Патоморфологический и ультраструктурный анализ слизистой оболочки десны вблизи очагов красного плоского лишая 81
4.4. Резюме 91
Глава 5. Сравнительный анализ системного и местного свободнорадикального статуса полости рта у больных красным плоским лишаем слизистой оболочки полости рта 93
5.1. Состояние системного и местного свободнорадикального статуса у здоровых лиц 93
5.2. Состояние системного и местного свободнорадикального статуса у больных красным плоским лишаем 95
5.3. Резюме 98
Глава 6. Сравнительный анализ системного и местного цитокинового статуса полости рта у больных красным плоским лишаем слизистой оболочки полости рта 100
6.1. Состояние системного и местного цитокинового статуса у здоровых лиц 100
6.2. Состояние системного цитокинового статуса
у больных красным плоским лишаем 104
6.3. Состояние местного цитокинового статуса
у больных красным плоским лишаем 106
6.4. Резюме
Глава 7. Заключение 110
Выводы 120
Практические рекомендации 122
Список литературы
- Роль иммунных механизмов в развитии красного плоского лишая
- Методы биохемилюминесцентного исследования
- Стоматологический статус пациентов с красным плоским лишаем слизистой оболочки полости рта
- Патоморфологический и ультраструктурный анализ слизистой оболочки десны вблизи очагов красного плоского лишая
Введение к работе
Актуальность темы. Красный плоский лишай (КПЛ) большинство исследователей относят к хроническим воспалительным заболеваниям аутоиммунной природы с преимущественным поражением слизистой оболочки полости рта, а также кожи, ногтей, слизистых оболочек половых органов (Ismail S.B. et al., 2007). Распространенность КПЛ варьирует в разных популяциях от 0,5 до 2,6% (Ikeda N. et al., 1991; McCartan B.E., Healy C.M., 2008). В ряде работ за последний период времени отмечена тенденция к увеличению числа больных, страдающих данной патологией, некоторыми авторами, зарегистрированы случаи возникновения КПЛ у детей (Рабинович О.Ф., 2001; Laeijendecker R. et al., 2005; Patel S. et al., 2005; Woo V.L. et al., 2007). Среди всех случаев КПЛ наиболее распространенной является КПЛ слизистой оболочки полости рта (СОПР).
Частота малигнизация КПЛ СОПР, по данным различных источников, варьирует от 0,07 до 7% (Петрова Л.В., 2004; Алиев А.Д. и др., 2007; et al., 2005; Larsson A., Warfvinge G., 2005; Lodi G. et al., 2005; Szlosarek P.W. et al., 2006; Hsue S.S. et al., 2007; Fang M. et al., 2009). Следует отметить, что не все исследователи разделяют точку зрения о возможной малигнизации КПЛ СОПР (Anuradha Ch. et al., 2008; Paveras M.R. et al., 2013; Mares S. et al., 2013). Тем не менее, этот вопрос остается одним из самых актуальных в проблематике КПЛ.
Этиология КПЛ СОПР до сих пор точно не установлена. В качестве этиологических факторов предлагается рассматривать воздействие различных внешних агентов (материал зубных протезов, композитные материалы и т.п.), специфических вирусов, лекарственных препаратов (антигипертензивных, антималярийных препаратов, нестероидных противовоспалительных препаратов и т.п.), стрессирующие воздействия, табакокурение и т.д. (Koch P. Et al., 1999; Carrozzo M. et al., 2005; Ivanovski K. et al., 2005). В патогенезе КПЛ важная роль уделяется аутоиммунным факторам и изменениям экспрессии провоспалительных цитокинов (Спицина В.И., 2002; Eversole L.R., 1997; Thornhill M.H., 2001). В последнее время стала популярной концепция об инициации патологической пролиферации при КПЛ СОПР активированными Т-хелперами 1-го типа (Th1), инфильтрирующими слизистую оболочку (Taniguchi Y. et al., 2002; , 2005; Rhodus N.L. et al., 2007; Flatharta C.O. et al, 2008; Gonzalez Moles M.A. et al., 2009). Будучи активированными, эти клетки наряду с клетками моноцитарно-макрофагальной системы и эпителиоцитами вырабатывают большое количество провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкины (IL-1, IL-2, IL-6), фактор некроза опухоли (TNF-), гамма-интерферон (IFN-), что вызывает гиперпролиферацию и нарушение дифференцировки эпителия (Khan A. et al., 2003; Kalogerakou F. et al., 2008; Bai J. et al., 2009; Ficarra G. et al., 2010).
Снижение общего иммунитета и местной резистентности полости рта у больных КПЛ СОПР может спровоцировать переход условно-патогенных микроорганизмов – Lactobacilus acidophilus, Klebsiella pneumoniae, Corineba cterium, Candida albicans в патогенную микрофлору (Рабинович И.М. и др., 2001). Ряд авторов полагают, что структурные изменения СОПР при КПЛ являются предрасполагающим фактором для инвазивного роста грибов рода Candida, выступающих в ряде случаев канцерогенными провокаторами (Lipperheide V. et al., 1996; Zeng X. et al., 2005, 2008, 2009).
В развитие патологических процессов, в том числе и КПЛ СОПР, определенный вклад вносят процессы свободно-радикального окисления (СРО) и антиоксидантной антирадикальной защиты (АОРЗ) (Меньщикова Е.Б. и др., 2006). Недостаточность АОРЗ при КПЛ СОПР, выражающаяся в накоплении продуктов свободнорадикальных реакций, может быть связана с образованием элементов поражения на слизистой оболочке полости рта ( et al., 2005; , 2010).
В связи с этим комплексный подход к изучению СОПР при КПЛ с анализом структурных изменений, уровня цитокинов, свободно-радикального окисления, активности клеточной пролиферации пораженных участков и микробиоценоза полости рта будет способствовать разработке более эффективных лечебных мероприятий, направленных на коррекцию выявленных нарушений.
Цель исследования – изучить характер структурной реорганизации слизистой оболочки полости рта с оценкой пролиферативного потенциала, экспрессией про- и противовоспалительных цитокинов у больных красным плоским лишаем слизистой оболочки полости рта.
Задачи исследования:
-
Проанализировать клинические критерии тяжести и изучить спектр микробиологического состава полости рта у больных КПЛ СОПР.
-
Изучить характер структурной реорганизации СОПР при КПЛ, выраженность пролиферативных реакций (по экспрессии антигена Ki-67) эпителиоцитов в пораженных участках слизистой оболочки щеки больных КПЛ.
-
Изучить характер структурной реорганизации и ультраструктурных изменений в слизистой оболочке полости рта вблизи очагов КПЛ.
-
Исследовать соотношение уровней цитокинов с про- и противовоспалительным действием (IL-1, IL-6, IL-4, TNF-a и IFN-) в ротовой жидкости и сыворотке крови у больных КПЛ СОПР.
-
Определить активность процессов свободно-радикального окисления с учетом состояния антиоксидантной антирадикальной системы ротовой жидкости и сыворотки крови у больных КПЛ СОПР.
Научная новизна. Впервые при проведении комплексного морфологического анализа установлены особенности структурной реорганизации слизистой оболочки полости рта при красном плоском лишае в очагах и вблизи очагов поражения. Установлено, что к патоморфологическим особенностям реорганизации слизистой оболочки щеки в очагах поражения КПЛ СОПР относятся нарушения процессов ороговения, пролиферации и дифференцировки эпителиоцитов (акантоз, гранулез, сочетание гиперкератоза и паракератоза), выраженная воспалительноклеточная инфильтрация собственной пластинки слизистой оболочки щеки. Выраженность морфологических изменений зависит от тяжести заболевания и возрастает у больных с эрозивно-язвенной формой. Показано, что в слизистой оболочке десны вблизи очага поражения при типичной форме КПЛ СОПР манифестируют патоморфологические признаки хронического склерозирующего гингивита, при эрозивно-язвенной форме – язвенно-некротического процесса.
Впервые изучен характер ультраструктурных изменений эпителиоцитов десны при КПЛ СОПР. Показано, что при типичной форме ультраструктурные изменения эпителиального пласта заключаются преимущественно в усилении гетерогенности эпителиоцитов базального и шиповатого слоев (присутствии «темных» и «светлых» клеток) и умеренных литических изменениях цитоплазмы, утолщении пучков тонофиламентов. При эрозивно-язвенной форме КПЛ СОПР превалируют деструктивные изменения эпителиоцитов всех слоев (лизис и деструкция органелл, парциальные некрозы), нарушения межклеточных контактов и выраженный отек межклеточного пространства.
Впервые при изучении процессов пролиферации в эпителии слизистой оболочки полости рта у больных КПЛ доказана связь повышенной экспрессии Ki-67 с прогрессированием заболевания, что может служить диагностическим и прогностическим критерием, определяющим поражение слизистой оболочки полости рта у данной категории больных.
При проведении комплексной оценки микробиологического статуса полости при КПЛ СОПР установлено, что при эрозивно-язвенной форме изменения микробиологического статуса полости рта более выражены (преобладают дисбактериоз III и IV степени) по сравнению с типичной формой.
Впервые установлена активация процессов свободнорадикального окисления на фоне снижения антиоксидантной антирадикальной защиты в ротовой жидкости и сыворотке крови у больных красным плоским лишаем слизистой оболочки полости рта, что дало возможность выявить новые звенья патогенеза.
Впервые выявлены значимые изменения в экспрессии наиболее значимых про- и противовоспалительных цитокинов в ротовой жидкости и сыворотке крови у больных КПЛ слизистой оболочки полости рта, показана их роль в усилении патологического процесса.
Практическая значимость. Показана высокая эффективность комплексного клинико-морфологического исследования в оценке выраженности повреждений слизистой оболочки полости рта при КПЛ. Изучение структурной реорганизации слизистой оболочек полости рта и изменений процессов свободнорадикального окисления, активности антиоксидантной антирадикальной защиты, цитокинового статуса, микробиоценоза ротовой полости, пролиферативного потенциала эпителиоцитов в участках поражения у больных КПЛ СОПР дает возможность охарактеризовать патогенетические механизмы развития данной патологии и разработать на этой основе комплекс эффективных лечебных мероприятий.
Полученные данные могут быть использованы для разработки алгоритма диагностики и прогноза КПЛ СОПР.
Внедрение результатов исследования. Результаты исследований внедрены в учебный процесс на кафедре стоматологии ортопедической ГБОУ ВПО Дальневосточного государственного медицинского университета Минздравсоцразвития России и практику работы МУЗ «Городской стоматологической поликлиники № 18 г. Хабаровска».
Основные положения, выносимые на защиту:
-
КПЛ СОПР относится к пролиферативным заболеваниям, основными патоморфологическими особенностями которого являются акантоз, гранулез, сочетание гиперкератоза и паракератоза. Выраженность патоморфологических изменений СОПР при КПЛ определяется формой заболевания (типичной и эрозивно-язвенной); при эрозивно-язвенной форме преобладают деструктивные и литические процессы в эпителиальном пласте, которые сопровождаются более выраженными экссудативными и воспалительноклеточными реакциями в собственной пластинке.
-
Усиление пролиферативной активности эпителиоцитов (по выявлению антигена Ki-67) в слизистой оболочке полости рта больных КПЛ отражает прогрессирование патологического процесса и усиление тяжести заболевания.
-
Высокий уровень экспрессии провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6, TNF-a и IFN-) на фоне незначительного повышения противовоспалительного IL-4 ротовой жидкости и сыворотки крови отражает наличие выраженного дисбаланса цитокинов. Совокупность маркеров структурного повреждения СОПР, уровня провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, выраженности прооксидантных процессов и антиоксидантной защиты может использоваться в качестве объективного критерия при диагностике и прогнозе КПЛ для разработки комплексного подхода в лечении.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на научно-практической конференции «Актуальные проблемы стоматологии», посвященной 30-летию стоматологического факультета ДВГМУ (Хабаровск, 2009), научном семинаре отдела клеточной биологии и морфологии НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 2010), 6-й Всероссийской конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2013), межлабораторной научной конференции в ФГБУ «НИИ региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН (Новосибирск, 2011, 2013).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них 6 – в рецензируемых журналах по списку ВАК и в системе цитирования (библиографической базе) Web of Science.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, характеристики материала и методов исследования, описания 3 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитированной литературы (290 источников, из них 159 отечественных и 131 иностранных авторов). Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста, содержит 13 таблиц, 38 рисунков.
Роль иммунных механизмов в развитии красного плоского лишая
Больные с изолированным поражением только слизистой оболочки полости рта описываются дерматологами гораздо реже, в то время как стоматологи отмечают большой процент изолированных форм КПЛ: от 50 до 75% (Савкина Г.Д., 1985). По данным Г.Д.Савкиной (1978), поражения только слизистой оболочки рта выявляются у 78%) больных КПЛ.
Высыпания на слизистой оболочке полости рта могут задолго предшествовать возникновению высыпаний на коже или оставаться единственным признаком заболевания. По данным Л.В.Петровой (2002), КПЛ крайне редко диагностируется у детей и людей пожилого возраста (Петрова Л.В., 2002).
При поражении СОПР 62 - 67% больных составляют женщины в возрасте 40 - 60 лет (Абудуев Н.К., 1989; Hornstein О.Р. et al., 1980). А.Л. Машкиллейсон (1995) рассматривает КПЛ СОПР как особую форму заболевания, развивающиеся преимущественно у женщин во время климактерического периода и менопаузы.
Клинические проявления КПЛ на СОПР и губ, характеризуется многообразием форм, что может приводить к диагностическим ошибкам. По данным Е.В.Боровского при диагностике заболеваний слизистой полости рта и губ правильный диагноз ставится только в 30-35%) случаев (Анисимова И.В. и соавт., 2008).
Общепринятой в настоящее время является классификация, разработанная А.Л.Машкиллейсоном и Е.В.Боровским (1984), которые различают 6 клинических форм КПЛ слизистой оболочки полости рта и красной каймы губ: типичную, экссудативно-гиперемическую, эрозивно-язвенную, буллез-ную, гиперкератотическую, атипичную. Кафедрой кожных болезней Московского государственного медицинского стоматологического университета им. Н.А.Семашко предложено включить в классификацию инфильтративную форму, наличие которой подтверждается клиническими наблюдениями, гистологическими и электронно-микроскопическими исследованиями (Петрова Л.В., 2002).
По данным Е.И.Абрамовой (1966), типичная форма КПЛ встречается примерно у 45% больных, экссудативно-гиперемическая - 25%, эрозивно-язвенная - у 23%, буллезная - у 3%, гиперкератотическая - у 2%, атипичная - у 2%. Инфильтративная форма КПЛ встречается редко, в течении ряда лет удалось наблюдать только 11 пациентов с такой формой заболевания (Петрова Л.В., 2002).
По течению красный плоский лишай может быть острым (до 1 мес) или подострым (до 6 мес) и длительно протекающим - хроническим без ремиссий или рецидивирующим (Довжанский СИ., Слесаренко Н.А., 1998).
Заболевание характеризуется наличием тяжело протекающих клинических форм, длительным течением, рецидивами, полиморфизмом клинических проявлений, резистентностью к различным методам лечения, склонностью к малигнизации в 0,07 - 3,2% случаев, особенно эрозивно-язвенные формы болезни (Машкиллейсон А.Л. и др., 1989; Петрова Л.В., 2002; Bascones С. et al., 2005; Larsson A., Warfvinge G., 2005).
Поражение слизистой оболочки полости рта при красном плоском лишае сопровождается выраженными болевыми и другими неприятными ощущениями у пациентов, затрудняют приём пищи, усугубляют имеющуюся у них лабильность нервной системы. Особенно длительным и тяжелым течением отличается эрозивно-язвенная форма КПЛ, на долю которой приходится 23-46%) случаев (Carrozzo М., Thorpe R., 2009).
КПЛ отличается от многих других заболеваний слизистой оболочки полости рта частотой сочетания с различными соматическими болезнями: хронический гастрит, холецистит, колит, персистирующий гепатит, язвенная болезнь желудка и 12-перстной кишки, сахарный диабет, первичный гипотиреоз, гипертоническая болезнь и др. Кроме того, в литературе описаны лихеноидные поражения пищевода, желудка, кишечника, мочевого пузыря, эндометрия, что позволяет о многосистемности патологического процесса при красном плоском лишае. Имеются данные, свидетельствующие об идеи 15 тичности неспецифического язвенного колита и эрозивно-язвенной формы красного плоского лишая (Машкиллейсон А.Л. и др., 1980; Машкиллейсон А.Л., 1984; Манухина О.Н., 1998; Williams T.R., Haider-Shah Н., 2005; Hoskyn J., Guin J.D., 2005; Carrozzo M. et al., 2005; Lin L.M., Qi X.M., 2005).
Ассоциация красного плоского лишая с другими болезнями позволила выделить синдром Литтла - Лассюэра и Гриншпана - Потекаева (Довжан-ский СИ., Слесаренко Н.А., 1990).
Синдром Литтла-Лассюэра характеризуется высыпанием фолликулярных папул на кожных покровах туловища и конечностей, нерубцовой алопецией подмышечных впадин и лобка, и рубцовой атрофией волосистой части головы. Описанное сочетание красного плоского лишая с сахарным диабетом и гипертонической болезнью в литературе известно как синдром Гриншпана - Потекаева.
Несмотря на успехи, достигнутые в изучении клинико-патогенетиче-ских и терапевтических аспектов, проблема КПЛ остается актуальной проблемой клинической стоматологии. Число больных этим заболеванием слизистой оболочки полости рта неуклонно растет (Довжанский СИ., Слесаренко Н.А., 1998). В настоящее время этиология и патогенез КПЛ остаются маловыясненными, а лечение заболевания представляет определенные трудности (Довжанский СИ., Слесаренко Н.А., 1998).
Из многообразия предполагаемых причин заболевания можно выделить три основные группы: I - инфекция, о чем свидетельствует острое начало, хроническое течение, связь обострений с переохлаждением, респираторными вирусными заболеваниями, активацией фокальной инфекцией; II - экзогенные факторы: химические, лекарственные средства и материалы профессионального назначения; III - эндогенные факторы: собственные метаболиты, возникающие при стрессовых ситуациях. Имеется ряд теорий развития КПЛ, основанных на клинических, генетических, биохимических, гистологических и иммунологических исследованиях.
Для некоторых авторов КПЛ является полиэтиологическим заболеванием, в патогенезе которого участвуют различные нейроэндокринные, иммунные, интоксикационные и метаболические процессы с развитием воспалительных и дистрофических реакций на коже и слизистой (Абудуев Н.К., 1989).
Методы биохемилюминесцентного исследования
Интегральная оценка процессов свободнорадикального окисления в ротовой жидкости и сыворотке крови проведена с использованием метода хемилюминесценции (ХМЛ). Изучали спонтанную и индуцированную Fe ХМЛ по методу Ю.А.Владимирова и соавт. (1991) и люминол-зависимую инициированную Н202 (Арутюнян А.В., 2000).
В качестве материала для исследования служили ротовая жидкость и сыворотка крови у больных с КПЛ СОПР и практически здоровых лиц (контрольная группа). Забор периферической крови проводили в утренние часы (Лебедев К.А., Понякина И.Д., 1990) из локтевой вены в количестве 10 мл в сухую центрифужную пробирку, после образования сгустка при комнатной температуре центрифугировали при 1500 об./мин 7-10 мин на центрифуге ОПН-3. Слой образовавшейся сыворотки использовали для постановки реакции.
Исследование ротовой жидкости и сыворотки крови проводили на люминесцентном спектрометре LS-50B фирмы «PERKIN ELMER» (Швейцария). Стандартизацию сигнала и математическую обработку кривых ХМ Л выполняли с помощью встроенной программы «Finlab» к люминесцентному спектрометру. Исследовали спонтанную и индуцированную Fe2+ ХМЛ, определяя: - светосумму за 1 мин спонтанной ХМЛ (Ssp), величина, которой коррелирует с интенсивностью генерации свободных радикалов; - максимум быстрой вспышки (h) индуцированной ХМЛ, свидетельствующий о содержании гидроперекисей липидов; - светосумму (S ind-І) за 2 мин после «быстрой» вспышки, отражающую скорость накопления перекисных радикалов липидной природы. Кинетику ХМЛ, инициированную Н202 в присутствии люминола, анализировали по следующим параметрам: - светосумме за 1 мин люминол-зависимой ХМЛ (Slum), свидетельствующей об интенсивности образования гидроксил-радикалов; - максимуму Н202 -индуцированного свечения (Н), указывающего на потенциальную способность биологического объекта к перекисному окислению; - светосумме за 2 мин Н202- индуцированной ХМЛ (Sind-2), величина которой свидетельствует об активности антиоксидантной антирадикальной защиты.
Показатели хемилюминесценции ротовой жидкости и сыворотки крови у больных красным плоским лишаем выражали в относительных единицах интенсивности свечения. Материалом для исследования системного и местного цитокинового статуса служили сыворотка крови и ротовая жидкость обследуемых мужчин и женщин. Исследование сыворотки крови и ротовой жидкости включало определение содержание цитокинов с провоспалительным (IL-lp, IL-6, TNF-а, IFN-y) и противовоспалительным действием (IL-4).
У всех обследуемых лиц из локтевой вены был проведен забор периферической крови в утренние часы (Лебедев К.А., Понякина И.Д., 1990), в количестве 10 мл в сухую центрифужную пробирку (после образования сгустка при комнатной температуре; центрифугировали при 1500 об./мин 7 -10 мин на центрифуге ОПН-3). Слой образовавшейся сыворотки использовали для постановки реакции. Сыворотку разливали по аликвотам и хранили npHt-18-20C.
Материалом для исследования местного цитокинового статуса полости рта служила нестимулированная смешанная слюна, взятая утренние часы натощак в количестве 10 мл в чистые пробирки путем сплевывания в течение 10 мин (Методические рекомендации МЗ РСФСР; 28.07.08). Полученную смешанную слюну центрифугировали при 1500 об./мин в течение 10 мин, собирали надосадочную фракцию и замораживали при t -18-20С для дальнейшего исследования.
Методом ИФА, ELISA в сыворотке крови и ротовой жидкости обследуемых лиц проводили определение количественного содержания медиаторов иммунитета с использованием стандартных наборов (IL-1-beta-ИФА-БЕСТ, IL-4-ИФА-БЕСТ, IL-6-ИФА-БЕСТ, IF-gamma-ИФА-БЕСТ, TNF-alfa-ИФА-БЕСТ производства ЗАО «Вектор - БЕСТ», Новосибирск) в соответствии с инструкциями производителя.
Принцип твердофазного иммуноферментного анализа основан на выявлении комплекса антиген-антитело с помощью фермента (пероксидаза, щелочная фосфотаза и др.) по изменению окраски специфического субстрата. Основной компонент твердофазных иммуноферментных тест-систем -полистироловый планшет с лунками. При конкурентном методе ИФА в лунки планшета одновременно вносятся исследуемый материал и конъюгат. Конъюгат в данном случае - это антитела против гормонов человека, меченные ферментом. При последующей инкубации цитокины, содержащиеся в сыворотке, и конъюгат вступают в конкурентное взаимодействие с иммо-билизированными на твердом носителе антителами.
Цитокины взаимодействуют с антителом, блокируя образование ком 46 плекса антиген-конъюгат. При отсутствии цитокина в сыворотке крови и ротовой жидкости происходит образование комплекса антиген-конъюгат. Оставшиеся несвязанные компоненты после инкубации отмываются, и в систему добавляется соответствующий субстрат. Изменение окраски раствора происходит при окислении красителей (оротофенилендиамина или др.), который входит в состав субстратного раствора. Краситель из восстановленной формы переходит в окисленную окрашенную форму. Таким образом, происходит окрашивание только тех лунок, в которых присутствует комплекс антиген-антитело-конъюгат.
Результаты иммуноферментного анализа регистрировали на автоматическом вертикальном фотометре BIO-RAD 550, позволяющем проводить фотометрические и агглютинационные измерения в прозрачных 96-луноч-ных планшетах при длине волны 450 нм, устанавливая нулевое поглощение по лунке со стандартом 0. Расчет результатов производили с помощью встроенной программы "Microplate Manager" версия 4,0 (1996) к фотометру. Количественное содержание цитокинов выражали в пг/мл.
Стоматологический статус пациентов с красным плоским лишаем слизистой оболочки полости рта
В биоптатах оппозитной к очагу поражения десны при типичной форме КПЛ СОПР преобладала склерозирующая форма воспаления, которая характеризовалась сохраненной архитектоникой эпителиального пласта и его значительной очаговой атрофией (рис. 30). Отмечался полиморфизм эпите-лиоцитов всех слоев. В базальном, шиповатом и зернистом слоях наблюдались очаги дистрофически измененных клеток (с выраженными опустошениями околоядерной зоны). Эпителиоциты рогового слоя всегда также были полиморфными: в одних присутствовали гиперхромные ядра и кератогиали-новые гранулы, другие представляли собой истинные роговые чешуйки (см. рис. 30). В базальном и шиповатом слоях эпителия, как правило, отсутствовал межклеточный отек; в собственной пластинке отек также был незначительным.
В собственной пластинке слизистой оболочки воспалительноклеточ-ная инфильтрация была умеренной или слабой, чаще периваскулярной по локализации, а по клеточному составу - мононуклеарной (лимфоцитарно-плазмоцитарной). Важной морфогенетической характеристикой склерози-рующих форм воспаления является фиброз собственной пластинки слизистой оболочки, особенно сосочкового слоя. В этом слое формировались многочисленные утолщенные пучки коллагеновых волокон, которые располагались вдоль базальной мембраны, вокруг кровеносных сосудов, образовывали массивный фиброзный остов. В сосочковом слое собственной пластинки регистрировались многочисленные лимфатические сосуды, отмечался лимфостаз; присутствовали миофибробласты. Значительным был фиброз собственной пластинки (см. рис. 30).
У пациентов с эрозивно-язвенной формой КПЛ СОПР в биоптатах десны преобладала язвенно-некротическая форма воспалении, для которой были характерны разрывы, изъязвления и дезорганизация эпителиального пласта, его деэпителизация на большом протяжении. Зоны деэпителизации были заполнены клеточным детритом, остатками эпителиоцитов, эритроцитами, лейкоцитами. Вблизи отмечались выраженные дистрофические и некробиотические изменения эпителиоцитов всех слоев. Для этой формы ЯН Рис. 30. Пациент
В собственной пластинке слизистой оболочки десны регистрировалась выраженная воспалительноклеточная инфильтрация (рис. 31); значительным было плазматическое пропитывание основного вещества соединительной ткани. Во всех случаях отмечалось выраженное полнокровие сосудов сосочкового слоя, в очагах некроза - гемо- и плазморрагии. Регистрировались новообразование лимфатических сосудов и лимфостаз. Выраженным также был фиброз собственной пластинки.
При электронно-микроскопическом исследовании биоптатов слизистой оболочки щеки при обеих формах красного плоского лишая выявлены преимущественно стереотипные изменения ультраструктуры эпителиоци-тов, но выраженность этих изменений была разной.
Ультраструктурные изменения эпителия десны при типичной форме КПЛ СОПР выражались в значительной гетерогенности эпителиоцитов базального и шиповатого слоев: выявлялись как «темные» клетки (с электронно-плотной цитоплазмой, немногочисленными плохо различимыми орга-неллами, большим количеством грубых пучков тонофиламентов), так и «светлые» более крупные клетки (с мелкими митохондриями, гранулами гликогена, нежными пучками тонофиламентов и разреженной лизированной цитоплазмой) (рис. 32).
Эпителиоциты базального слоя характеризовались умеренной электронной плотностью; в их цитоплазме различались немногочисленные ультраструктуры (фрагменты гранулярной цитоплазматической сети, единичные митохондрии, небольшие пучки тонофиламентов). Вблизи ядер во многих клетках отмечалось формирование зон «опустошения», лишенных ультраструктур и зернистого цитоплазматического матрикса.
Наблюдался как умеренный, так и выраженный отек межклеточного пространства, в котором появлялись миелиноподобные структуры, хлопьевидный материал, зернистные вакуолеобразные структуры и мигрирующие макрофагальные клетки (рис. 33). Плазматические мембраны макрофагаль-ных клеток во многих участках плотно прилегали к эпителиоцитам и формировали как небольшие, так и протяженные межклеточные контакты (рис. 34). "ЧИ
Плотное соприкосновение плазматических мембран эпителиоцита и макрофага, формирование протяженного межклеточного контакта. Ув. 25 000. В эпителиоцитах шиповатого слоя присутствовали утолщенные пучки тонофиламентов, везикулы расширенной цитоплазматической сети, многочисленные гранулы гликогена, его секвестрация, в некоторых клетках -«опустошение» околоядерной зоны по тину парциального некроза (рис. 35) или разреженного пространства. Ядра шиповатых эпителиоцитов содержали эухроматин и макргинально расположенный гетерохроматин. В расширенных межклеточных пространствах присутствовали зернистые и хлопьеви-дын вакуобеобразные структуры.
В эпителиоцитах зернистого слоя наблюдались кератогиалиновые гранулы и небольшие пучки тонофиламентов, которые располагались преимущественно вокруг ядер. Большинство эпителиоцитов имели разреженную цитоплазму, часто отмечались небольшие очаги лизиса. Во многих эпителиоцитах наблюдалась также «опустошенность» околоядерной зоны по периферии ядер (рис. 36). Поверхностный слой был представлен преимущественно уплощенными эпителиоцитами, в которых плохо различались ультраструктуры. В то же время встречались клетки с разреженной цитоплазмой в состоянии некробиоза или некроза.
В собственной пластинке слизистой оболочки десны при типичной форме КПЛ СОПР присутствовали утолщенные пучки коллагеновых волокон, между которыми располагались активные формы фибробластов (с расширенными цистернами гранулярной цитоплазматической сети) (рис. 37).
При эрозивно-язвенной форме КПЛ СОПР в биоптатах десны наблюдались деструктивные изменения эпителиоцитов всех слоев (лизис и деструкция органелл, обширные очаги «опустошения» цитоплазмы - парциальные некрозы). Отмечались значительная деструкция межклеточных контактов и выраженный отек межклеточного пространства. В этих зонах регистрировались многочисленные миелиноподобные структуры, детрит, хлопьевидный материал, мигрирующие макрофаги и лейкоциты.
В собственной пластинке слизистой оболочки десны отмечалось плазматическое пропитывание, формирование массивных скоплений детрита между утолщенными пучками коллагеновых волокон. Присутствовали многочисленные нейтрофилы, плазмоциты и активные формы макрофагов. Эн-дотелиоциты кровеносных капилляров отличались выраженной гетерогенностью.
Патоморфологический и ультраструктурный анализ слизистой оболочки десны вблизи очагов красного плоского лишая
Присутствие в воспалительном инфильтрате преимущественно лимфоцитов, несомненно, связано с этиопатогенезом КПЛ СОПР. Ряд авторов считают, что именно лимфоциты играю ведущую роль в альтерации эпителиального пласта и хронизации воспаления (Быков В.Л., 2005; Майбородин И.В. и др., 2007, 2008, 2009). В воспалительноклеточном инфильтрате при КПЛ СОПР в значительных количествах содеражтся CD68+ и CD3+ Т-лимфоциты (Hussein M.R. et al., 2008).
Ультраструктурные изменения эпителиоцитов были связаны в основном с развитием деструктивных и литических процессов, которые охватывали большинство клеток. К манифестным изменеиям следует отнести выраженную гетерогенность клеток («светлые» и «темные» клетки), формирование зон выраженного лизиса цитоплазмы и деструкции органелл в пери-нуклеарных зонах (парциальный некроз, «опустошенность» цитоплазмы), нарушения межклеточных контактов.
Подобные изменения также не обладали специфичностью и были выявлены при острых и хронических воспалительных процессах и КПЛ СОПР (Лушникова Е.Л., Бакулин И.И., 2008; Paul М., Shetty D.C., 2013). Следует отметить, что, по данным разных авторов, наиболее значительным изменениям подвергаются эпителиоциоты базального и шиповатого слоев.
Различия в выраженности ультраструктурных изменений эпителиоцитов при КПЛ СОПР также определяются формой воспалительного процесса - типичной или эрозивно-язвенной. При эрозивно-язвенной форме некоторые авторы также отмечали более выраженные ультраструктурные изменения базальных эпителиоцитов, которые проявлялись в формировании удлиненных, узких цитоплазматических отростков, часто неправильной формы (Paul М., Shetty D.C., 2013). Межклеточные пространства также были наиболее расширенными при эрозивной форме КПЛ; наблюдалось уменьшение числа десмосом. Среди других ультраструктурных изменений следует отметить уменьшение количества органелл, утолщение пучков тонофиламентов, наличие зон деструкции. При эрозивной форме КПЛ отмечено также усиление апоптотической гибели клеток, появление разрывов базальной мембраны. Именно с разрвывами базальной мембраны связывают усиление миграции лимфоцитов в эпителиальный пласт (Hashimoto К. et al., 1966). Подобные ультраструктурные изменения, но несколько в меньшей степени, выявляются и в шиповатом слое.
Установленные различия в выраженности ультраструктурных изменений эпителиоцитов базального и шиповатого слоев при разных формах КПЛ СОПР могут свидетельствовать о разных молекулярных механизмах, вовлеченных в развитие патологического процесса. Некоторые исследователи полагают, что разрушения эпителиального пласта начинаются с деструкции полудесмосом и десмосом, что приводит к деградации цитоплазматических структур (в том числе, утолщению пучков тонофиламентов) и в последующем - к апоптотической гибели клеток (Paul М, Shetty D.C., 2013).
К различиям в ультраструктурной организации эпителиального пласта слизистой оболочки щеки разных формах КПЛ относят также разные виды повреждений базальной мембраны: при типичной форме - дупликацию базальной мембрны, при эрозивно-язвенной - разрывы, деструкцию (Paul М., Shetty D.C., 2013). Мы не обнаружили столь явных различий в строении базальной мембраны при разных формах КПЛ. В то же время следует отметить, что нарушения целостности базальной мембраны могут играть определенную роль в патогенезе КПЛ, поскольку облегчают миграцию лимфоцитов в эпителиальный пласт. Считается, что разрывы базальной мембраны могут быть обусловлены протеазами, секретируемыми тучными клетками, а также активированными Т-лимфоцитами, секретирующими ММР-9 (Suger-manP.B.etal., 2002).
Роли тучных клеток в патогенезе КПЛ СОПР многими исследователями придается большое значение (Jahanshahi G., Aminzadeh А., 2010; Paul М., Shetty D.C., 2013). Мы также регистрировали многочисленные скопления тучных клеток вблизи сосудов в сосочковом слое собственной пластинки слизистой оболочки щеки.
В характеристике биологических особенностей эпителиоцитов при КПЛ СОПР несомненно важное значение имеет оценка их пролиферативной активности. Это обусловлено тем фактом, что КПЛ СОПР характерно утолщение шиповатого и зернистого слоев эпителиального пласта, которое достигается за счет более высокой пролиферативной активности клеток.
Проведенная нами оценка пролиферативной активности эпителиоцитов с помощью иммуногистохимического анализа выявила повышение концентрации Ki-67 положительно окрашенных ядер в эпителии слизистой оболочки щеки у больных КПЛ СОПР. Уровень их содержания был существенно и достоверно выше относительно аналогичных показателей здоровых лиц контрольной группы.
Отмечены различия в показателях индекса меченных Ki-67 ядер в эпителии слизистой оболочки щеки у больных КПЛ СОПР с разными клиническими формами заболевания. Более высокие уровни экспрессии Ki-67 антигена в эпителии слизистой щеки установлены при эрозивно-язвенной форме заболевания. Выявленные при проведении исследования особенности про-лиферативных процессов, повышение индекса меченных Ki-67 ядер у пациентов КПЛ СОПР можно использовать для уточнения выраженности воспалительного (патологического) процесса.
Другие авторы при оценке пролиферативной активности эпителиоцитов с помощью выявления активности ядрышкового организатора (AgNOR) при КПЛ с диспластическими и недиспластическими изменениями не выявили столь существенных различий (Jaafari-Ashkavandi Z., Fatemi F.S., 2013). Однако при диспластической форме КПЛ СОПР была обнаружена более высокая активность AgNOR в ядрах эпителиоцитов (2,39±0,2 против 2,27±0,59 при недиспластической форме), так же как и более высокий процент пациентов с поражениями слизистой оболочки щеки кандидозом (14,3 против 12,5%).
