Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы
Морфологические классификации и критерии прогноза рака желудка 14
Иммунофенотипирование карцином желудка на основе маркеров функциональных активности
Возможности морфологического исследования в оценке потенциала злокачественности карцином желудка Заключение
Материал и методы исследования
Материал исследования
Методы исследования
Результаты собственных исследований
Морфологическая характеристика операционного материала
Экспрессия маркеров функциональной активности MUC1, MUC2, MUC5АС, MUC6 и CD10 (иммуногистохимическое исследование)
Варианты экспрессии муцинов и CD10 в эпителии внеопухолевой слизистой оболочки и карциномах желудка
Количественная оценка экспрессии муцинов и CD10 в карциномах желудка 93 Иммунофенотипические варианты карцином желудка по экспрессии муцинов и CD10
Показатели пролиферации, апоптоза и клеточного обновления Внеопухолевая слизистая оболочка желудка Индекс KI67 Митотический индекс
3.3.1.3 Индекс апоптоза
3.3.1.4 Коэффициент клеточного обновления (ККО)
3.3.2 Карциномы желудка
3.3.2.1 Индекс KI67
3.3.2.2 Митотический индекс
3.3.2.3 Индекс апоптоза
3.3.2.4 Коэффициент клеточного обновления
Экспрессия молекулярно-биологических маркеров, ассоциированных с опухолевым ростом (иммуногистохимическое исследование)
E-кадхерин (E-CAD)
Галектин-3 (GAL3)
Коллаген базальных мембран (COL4 )
Тенасцин-С внеклеточного матрикса (TN-C)
Матриксные металлопротеиназы 2 и 3 типа (MMP2, MMP3)
Послеоперационная 4-х летняя скорректированная безрецидивная выживаемость больных раком желудка 202
Сравнительная оценка прогностической значимости, исследованных показателей потенциала злокачественности карцином желудка 212
Сопоставление данных магнитно-резонансной томографии и патоморфологического исследования операционного материала при «проксимальном» раке желудка
Выводы
Глава 4 Обсуждение результатов исследования .
Практические рекомендации
- Иммунофенотипирование карцином желудка на основе маркеров функциональных активности
- Морфологическая характеристика операционного материала
- Показатели пролиферации, апоптоза и клеточного обновления Внеопухолевая слизистая оболочка желудка Индекс KI67 Митотический индекс
- Коллаген базальных мембран (COL4
Введение к работе
Актуальность темы
Рак желудка представляет собой гетерогенную группу опухолей с высоким злокачественным потенциалом и неблагоприятным прогнозом. Хотя доля рака желудка в структуре общей онкологической заболеваемости и смертности населения России за последние десятилетия сократилась (Чиссов В.И. и соавт., 1997; Каприн А.Д. и соавт., 2014), эта проблема сохранила ряд не решенных вопросов, требующих дальнейшего углубленного изучения.
Противоречивы и малочисленны результаты исследований, посвященных изучению злокачественного потенциала рака желудка с различным функциональным иммунофенотипом по набору экспрессируемых муцинов (MUC) и гликопротеина CD10. Недостаточны знания о закономерностях клеточного обновления карцином желудка, определяемых по показателям пролиферативной активности опухолевых клеток (индекс KI67 и митотический индекс), а также гибели клеток по типу апоптоза (апоптотический индекс). Недостаточно изучены при раке желудка особенности иммуногистохимической экспрессии молекулярно-биологических маркеров, ассоциированных с опухолевым ростом (Е-кадхерина (E-CAD), галектина-3 (GAL3), матриксных металлопротеиназ 2 и 3 типа (MMP2, MMP3), коллагена 4 типа (COL4), тенасцина-С (TN-С)).
Высказывается предположение о существовании зависимости злокачественного потенциала карциномы желудка от функционального иммунофенотипа опухолевых клеток, вместе с тем выводы авторов публикаций по этой проблеме неоднозначны (Wakatsuki K. et al., 2008; Krsti M. et al., 2008; Namikawa T. et al., 2010; Shin N. et al., 2011).
Прогностическая значимость митотического и апоптотического индексов при опухолевом росте проверена на достаточно большом числе наблюдений (Staunton M.J. et al., 1995; Лушников Е.Ф. и соавт., 2001), однако, подобные исследования, выполненные на материале карциномы желудка малочисленны и фрагментарны (Казанцева И.А., 1981; Saragoni L. et al., 2003), а сопоставления указанных показателей с иммунофенотипической характеристикой рака желудка не проводились.
Традиционно индекс пролиферации по KI67 предлагают использовать для рака желудка в качестве показателя потенциала злокачественности, расценивая высокие показатели иммуногистохимической экспрессии этого белка как неблагоприятный прогностический признак (Tzanakis N.E. 2009). Вместе с тем, в ряде исследований показано, что в карциномах желудка прогностическая значимость этого маркера сомнительна (Joo Y.E. et al., 2006; Lazr D. et al., 2010; Roh J.H. et al., 2010 Lee H.E. et al., 2010) и требует уточнения.
Полагают, что снижение экспрессии E-кадхерина и коллагена 4 типа сопровождается увеличением подвижности и миграционной способности клеток, являясь важными механизмами инвазии (Lazaris A. et al., 2003; Франк Г.А. и соавт., 2005; Chan A.O.O. et al., 2006; Zali M.R. et al., 2009; Кушлинский Н.Е. и соавт., 2010). Повышение инвазивного потенциала опухолевых клеток в определенной степени может быть обусловлено нарушением экспрессии регуляторного белка галектина-3, уровнем экспрессии матриксных металлопротеиназ и изменением состояния гликопротеинов внеклеточного матрикса, в том числе тенасцина-C (Wiksten J.P. et al., 2003; Kim S.J. et al., 2010; Zhou Y. et al., 2010). Высказывается предположение, что уровень и варианты иммуногистохимической экспрессии перечисленных маркеров могут иметь определенное значение для уточнения злокачественного потенциала рака желудка и прогноза (Bozzuto G. et al., 2010).
Размеры опухоли являются важной клинической характеристикой рака желудка, однако определение их при лучевом исследовании ограничено возможностями метода, в том числе и магнитно-резонансной томографии. Для более точной оценки протяженности раковой инфильтрации на этапе дооперационной диагностики мы посчитали необходимым провести сопоставление протяженности опухолевой инфильтрации при «проксимальных» карциномах желудка гистологической стадии T2-T3, полученной методом магнитно-резонансной томографии, с подлинными размерами новообразования в операционном материале. В качестве объектов исследования выбраны карциномы кардиального отдела и дна желудка, как наиболее сложные для клинической диагностики (Derakhshan, M.H. et al., 2008).
Мы полагаем, что поиск дополнительных морфо-функциональных и молекулярных маркеров биологической агрессивности опухоли с изучением их влияния на прогноз, а также уточнение распространенности опухоли на этапе дооперационной диагностики необходимы для повышения эффективности лечения рака желудка.
Цель исследования
Совершенствование патоморфологической диагностики рака желудка на основе комплексной оценки злокачественного потенциала новообразования с разработкой дополнительных критериев прогноза.
Задачи исследования
1. Изучить закономерности иммуногистохимической экспрессии маркеров функциональной активности – муцинов MUC1, MUC2, MUC5АС, MUC6 и гликопротеина CD10 в неопухолевой слизистой оболочке и карциномах желудка и выделить иммунофенотипические варианты рака желудка, определив возможную взаимосвязь этих факторов с локализацией, гистологическим типом и глубиной инвазии опухоли.
2. На основе изучения скорректированной безрецидивной выживаемости больных раком желудка после радикальных операций оценить зависимость злокачественного потенциала карциномы от ее функционального иммунофенотипа.
3. Провести комплексную оценку пролиферативной активности опухолевых клеток рака желудка по индексу KI67 и митотической активности, а также выраженности гибели клеток по типу апоптоза в сравнении с неопухолевым эпителием желудка, определив возможную взаимосвязь их количественных показателей с морфо-функциональной характеристикой карциномы и послеоперационной выживаемостью.
4. Изучить закономерности иммуногистохимической экспрессии молекулярно-биологических маркеров, ассоциированных с опухолевым ростом Е-кадхерина, галектина-3, коллагена 4 типа, тенасцина-С, матриксных металлопротеиназ 2 и 3 типа в эпителии неопухолевой слизистой оболочки желудка и клетках карциномы, определить их возможную взаимосвязь с морфо-функциональной характеристикой карциномы и послеоперационной выживаемостью.
5. Установить возможность использования функционального иммунофенотипа карциномы, показателей клеточного обновления и иммуногистохимической экспрессии перечисленных молекулярно-биологических маркеров в качестве независимых факторов прогноза при раке желудка.
6. Оценить объективность протяженности опухолевой инфильтрации при «проксимальном» раке желудка, полученной методом магнитно-резонансной томографии на этапе дооперационной диагностики и разработать методику, уточняющую размеры опухоли при карциномах этой локализации.
Научная новизна
Заключается в комплексном патоморфологическом и иммуногистохимическом исследовании показателей клеточного обновления, функциональных свойств и инвазивного потенциала опухолевых клеток, а также состояния внеклеточного матрикса карциномы желудка. Разработаны дополнительные морфо-функциональные критерии злокачественного потенциала рака желудка, имеющие высокую прогностическую значимость. Уточнена протяженность опухолевой инфильтрации при дооперационной диагностике «проксимальных» карцином желудка.
Установлено, что функциональный иммунофенотип рака желудка, определяемый по иммуногистохимической экспрессии опухолевыми клетками муцинов MUC1, MUC2, MUC5АС, MUC6 и гликопротеина CD10, не связан с локализацией, гистологической стадией и гистологическим вариантом опухоли.
Показано, что карциномам смешанного иммунофенотипа свойственен более высокий злокачественный потенциал и худшая выживаемость, по сравнению с раками желудочного иммунофенотипа, что позволяет использовать функциональный иммунофенотип в качестве дополнительного фактора прогноза.
Установлено, что параметры клеточного обновления карциномы желудка, определяемые по совокупности митотического и апоптотического индексов, а также показатели индекса KI67 статистически значимо ассоциированы с гистологическим вариантом и функциональным иммунофенотипом опухоли. Предложен условный количественный «коэффициент клеточного обновления» (ККО) рака желудка, имеющий прогностическое значение.
Впервые в карциномах желудка изучена иммуногистохимическая экспрессия матриксной металлопротеиназы 3 типа и определено ее прогностическое значение, а также уточнено прогностическое значение галектина-3.
Показано, что количественные показатели иммуногистохимической экспрессии молекулярно-биологических маркеров инвазивного потенциала галектина-3, матриксных металлопротеиназ 2 и 3 типа статистически значимо ассоциированы только с гистологическим вариантом и функциональным иммунофенотипом рака желудка.
Перечисленные критерии, а также митотический и апоптотический индексы, «коэффициент клеточного обновления» и количественные показатели экспрессии E-кадхерина статистически значимо ассоциированы с выживаемостью и поэтому могут быть использованы в качестве независимых факторов прогноза.
На основании исследования операционного материала показано, что протяженность опухолевой инфильтрации при «проксимальном» раке желудка гистологической стадии T2-T3, определяемая методом магнитно-резонансной томографии, превышает действительные размеры новообразования и нуждается в коррекции.
Теоретическая и практическая значимость
Проведенное исследование подтвердило предположение о возможности влияния функционального иммунофенотипа опухолевых клеток на злокачественный потенциал рака желудка. Внесен определенный вклад в изучение параметров клеточного обновления, а также иммуногистохимической экспрессии опухолевыми клетками ряда молекулярно-биологических маркеров, ассоциированных с опухолевым ростом, в карциномах этой локализации.
Показано, что злокачественный потенциал карциномы желудка обусловлен не только гистологическим вариантом и показателями пролиферативной активности опухолевых клеток, но и другими важными регуляторными механизмами: интенсивностью гибели клеток по типу апоптоза, морфо-функциональной дифференцировкой клеток опухоли и уровнем экспрессии белков и протеиназ, участвующих в межклеточных и клеточно-матриксных взаимодействиях. Комплексный анализ результатов позволил разработать дополнительные объективные количественные критерии индивидуального прогноза при раке желудка, доступные для применения в повседневной практике, что может быть использовано для оптимизации лечебной тактики.
Установлено, что индекс KI67 в раке желудка не имеет прогностического значения, что по всей вероятности объясняется неадекватностью этого показателя для оценки биологического потенциала опухолей, развивающихся в тканях с непрерывно обновляющимися клеточными популяциями, что присуще эпителию слизистой оболочки желудка, особенно шеек желез, с которыми гистогенетически связано большинство карцином этой локализации.
Даны практические рекомендации по уточнению протяженности опухолевой инфильтрации, выявляемой методом магнитно-резонансной томографии на этапе дооперационной диагностики «проксимальных» карцином желудка.
Методология и методы исследования
Заключалась в системном подходе и комплексном анализе научных трудов отечественных и зарубежных ученых в области патоморфологии, молекулярной биологии, хирургии, лучевой диагностики, которые занимались проблемой рака желудка и сформировали ряд морфо-функциональных моделей биологической агрессивности опухоли, разработали или усовершенствовали диагностические методики и прогностические схемы, проследили динамику заболеваемости и смертности. В исследовании использованы гистологический, иммуногистохимический, описательный, системно-структурный и статистический методы.
Положения, выносимые на защиту
1. Иммунофенотипические варианты рака желудка, выделяемые по набору экспрессируемых муцинов, имеют различный злокачественный потенциал и не связаны с локализацией в желудке, гистологическим вариантом и глубиной инвазии опухоли. Карциномам желудка смешанного иммунофенотипа, по сравнению с раком желудка желудочного иммунофенотипа свойственен более высокий злокачественный потенциал и худший прогноз.
2. Пролиферативный потенциал рака желудка может быть оценен по условному количественному показателю – «коэффициенту клеточного обновления» (ККО), равному соотношению митотического и апоптотического индексов.
3. Показатели коэффициента клеточного обновления, митотического и апоптотического индексов, а также иммуногистохимической экспрессии E-кадхерина, галектина-3, матриксных металлопротеиназ 2 и 3 типа в карциномах желудка статистически значимо ассоциированы с выживаемостью. Признаками неблагоприятного прогноза являются: коэффициент клеточного обновления >0,7, митотический индекс >30, апоптотический индекс 40; 50% опухолевых клеток, иммунопозитивных к E-кадхерину и галектину-3, >40% –иммунопозитивных к матриксной металлопротеиназе 2 типа и >50% – к матриксной металлопротеиназе 3 типа.
4. Протяженность опухолевого инфильтрата, полученная при дооперационной диагностике «проксимального» рака желудка гистологической стадии T2-T3 методом магнитно-резонансной томографии, статистически значимо превышает подлинную протяженность, определяемую при патоморфологическом исследовании операционного материала и нуждается в коррекции с коэффициентом поправки, равным 0,4.
Достоверность и апробация результатов исследования
Основные результаты исследования обсуждались на научных и научно-практических форумах с участием ведущих специалистов и представлены в устных, постерных и интернет докладах на: Республиканской научно-практической конференции (Беларусь, Витебск, 2010); XVI Российской гастроэнтерологической неделе (Москва, 2010, отмечен дипломом за 2 место в постерной сессии); III Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2010); Всероссийской научной конференции (Стерлитамак, 2010); Заседании Московского областного общества патологоанатомов (Москва, 2010); 37 сессии ЦНИИ Гастроэнтерологии и XI съезде Научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 2011, отмечен дипломом за 2 место в постерной сессии); II съезде патологоанатомов республики Беларусь (Гомель, 2011); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием (Санкт-Петербург, 2011); Межрегиональной научно-практической конференции (Ижевск, 2011); Международной заочной научно-практической конференции (Новосибирск, 2011); II заочной Международной научно-практической конференции (Екатеринбург, 2011).
Результаты исследования внедрены в практическую работу патологоанатомических отделений ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, МБЛПУ «Лобненская центральная городская больница», МБУЗ «Долгопрудненская центральная городская больница», МБУЗ «Наро-Фоминская районная больница №1», а также в педагогический процесс кафедры лучевой диагностики ФУВ ГБУЗ МО МОНИКИ им. М. Ф. Владимирского и кафедры патологической анатомии ИПО ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России.
Публикации
Результаты исследования отражены в 14 печатных работах, опубликованных в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК РФ и 77 работах, опубликованных в зарубежных и отечественных монографиях, руководстве, журналах и сборниках материалов научных форумов.
Объем и структура работы
Диссертация изложена на 308 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и заключения. Библиографический указатель включает 42 отечественных и 303 зарубежных источников. Иллюстративный материал представлен 57 таблицами и 264 рисунками.
Иммунофенотипирование карцином желудка на основе маркеров функциональных активности
MUC2 позитивные перстневидно-клеточные раки желудка ассоциированы с более высоким инвазивным и метастатическим потенциалом, по сравнению с MUC2 негативными карциномами, а гиперэкспрессия маркеров кишечной дифференцировки MUC2, CDX2, Villin и Li-cad коррелирует с высокой частотой метастазирования в лимфатические узлы [293]. Снижение частоты экспрессии MUC2 в карциномах желудка ассоциировано с увеличением стадии TNM и числа метастазов [135]. Вместе с тем, Lazr D. с соавторами (2011) не выявили зависимости между гистологической стадией, наличием инвазии сосудов опухоли, критериями системы TNM и показателями экспрессии MUC2 [176]. Экспрессия MUC2 ассоциирована с ранним раком желудка и редким метастазированием в лимфатические узлы [154].
Результаты исследований, посвященные влиянию MUC2 на прогноз РЖ противоречивы [179, 298, 335]. Показано, что выживаемость пациентов с MUC2 позитивными карциномами желудка в среднем составляет 20 месяцев, а с MUC2 негативными – 72 месяца [185]. Обратные результаты получили T. Utsunomiya и соавторы, которые выявили, что экспрессия MUC2 является благоприятным прогностическим фактором [298]. Похожие данные получены H.S Lee с соавторами, установивших, что пациенты с MUC2 негативными карциномами имеют худшие показатели послеоперационной выживаемости (результаты статистически недостоверны) [179] H.K. Zhang с соавторами (2004) установили, что MUC2 свойственен слизистым карциномам желудка [335]. В своем исследовании Lazr D. с соавторами (2011) не обнаружил влияния показателей экспрессии MUC2 на 5-летнюю послеоперационную и среднюю выживаемость, составивших для MUC2-позитивных и MUC2-негативных карцином соответственно 16% и 16,7% [176]. M. Bamba с соавторами (2001) показали, что темпы опухолевого роста РЖ не зависят от показателей экспрессии MUC2 [61]. Кроме того, в аденомах толстой кишки увеличение экспрессии MUC1 и снижение экспрессии MUC2, ассоциировано с развитием дисплазии эпителия высокой степени и злокачественной трансформацией [186]. S. Yonezawa с соавторами (2008) показали, что в карциномах панкреатобилиарной зоны гиперэкспрессия MUC2 коррелировала с лучшим прогнозом [331].
MUC5AC – выполняет функцию защиты эпителиальных клеток слизистой оболочки кардиального отдела и тела желудка [113]. Исследования, посвященные изучению экспрессии MUC5AC в раке желудка и определению его влияния на биологические свойства опухолевых клеток, немногочисленны. Указанный гликопротеин обнаруживают в 19-70,5% раках желудка [154, 156, 176, 185, 266, 285, 293, 335]. В опухолевых клетках РЖ встречается только цитоплазматическая экспрессия этого гликопротеина [335].
D. Lazr с соавторами (2011) не выявил зависимости между экспрессией MUC5AC опухолевыми клетками РЖ, полом и возрастом пациентов, но установил, что раки пилорического отдела чаще экспрессируют MUC5АС (80,6% карцином этой локализации), чем новообразования других отделов. В карциномах тела желудка он выявил этот гликопротеин в 66,7% карцином, а в опухолях кардии – не обнаружил [176]. Результаты исследований, посвященные изучению экспрессии MUC5АС в различных гистологических типах РЖ противоречивы. По некоторым данным, слабо когезивные карциномы экспрессируют указанный муцин чаще, чем АК [118, 154, 176, 185]. Обратные результаты получил O. Ilhan и соавторы (2010), которые выявили, что АК экспрессировали MUC5AC в 48,0% наблюдений, а слабо когезивные раки – в 10% [135]. Seki T. и соавторы (2009) обнаружили наибольшую экспрессию MUC5AC перстневидно-клеточными карциномами [259], а H.K. Zhang с соавторами (2004) наименьшую – слизистыми раками [335]. Y. Grbz с соавторами (2002) обнаружили корреляцию между экспрессией MUC5AC и инфильтративным типом роста РЖ [118]. В карциномах, экспрессирующих MUC5AC, обнаружены характерные молекулярно-генетические повреждения. В частности в таких раках чаще обнаруживали мутации apc [285]. CA. Reis с соавторами (2000) обнаружили, что экспрессия MUC5AC свойственна ранним карциномам желудка. Они установили, что в опухолях более поздней гистологической стадии экспрессия этого маркера отмечалась в 58,6% наблюдений. Авторы заключили, что все карциномы желудка в начальных стадиях канцерогенеза имеют желудочный ИФТ [245]. O. Ilhan с соавторами (2010) обнаружили, что частота экспрессии MUC5AC снижалась со снижением степени дифференцировки карциномы, увеличением глубины инвазии и увеличением числа метастазов в лимфатические узлы [135], а Tajima Y. и соавторы не выявили в метастатических карциномах экспрессию этого гликопротеина [285]. В свою очередь, D. Lazr с соавторами (2011) не обнаружили статистически значимой зависимости между инвазивным потенциалом карцином желудка, гистологической и TNM стадией опухоли, частотой метастазирования в лимфоузлы и показателями экспрессии MUC5АС [176].
Морфологическая характеристика операционного материала
Параметры клеточного обновления карцином желудка и внеопухолевой слизистой оболочки изучали по количественным показателям пролиферативной активности и клеточной гибели, используя методики определения МИ и АИ, а также индекса Ki67. При этом подсчет ядер меченых KI67, фигур митоза и апоптотических телец осуществляли при увеличении микроскопа х1000 с учетом не менее 1000 опухолевых клеток в максимальном количестве репрезентативных полей зрения. Полученный результат выражали в промилле.
Результаты радикального хирургического лечения больных РЖ, включенных в исследование, были прослежены ретроспективно. В качестве наиболее точного показателя выживаемости была использована скорректированная безрецидивная выживаемость. При ее расчёте за стартовое событие принимали дату радикально проведенного оперативного вмешательства, а за мониторируемое – дату диагностики рецидива или смерти от прогрессирования основного заболевания. Опрос пациентов включенных в исследование, проводили через 1, 3-и и 4-е года после проведения операции, а в случае смерти больного – его родственника, для суждения о причине смерти запрашивали протокол вскрытия. Пациенты, умершие в ближайшем послеоперационном периоде и/или от интеркуррентных заболеваний, не учитывались. Анализ выживаемости проводили без учета локализации опухоли в желудке и наличия или отсутствия метастазов в регионарных лимфатических узлах, т. к. объем оперативного вмешательства был неоднородным.
В зависимости от локализации новообразования карциномы подразделяли на 3 группы: опухоли кардии, тела или пилорического отдела желудка, для выделения указанных групп пользовались анатомической номенклатурой Войленко В.Н. и соавт. (1965) [6]. Отдел желудка определяли по гистологическому строению слизистой оболочки, прилежащей к опухоли в соответствии с критериями гистологического строения слизистой оболочки желудка, представленными в монографии В.Л. Быкова (1997; Рисунок 2) [5].
Для проведения сопоставлений протяженности опухолевой инфильтрации полученной методом магнитно-резонансной томографии с протяженностью, выявленной при патоморфологическом исследовании операционного материала карциномы кардии и дна желудка, были объединены в группу «проксимального» рака. Сопоставление проводили по разработанной нами ранее методике, суть которой заключается в том, что из стенки препарата через опухолевый инфильтрат, вырезают не менее двух полосок, от одного края резекции до другого. Полоски делят на участки протяженностью не более 1,5 см и маркируют для микроскопического исследования, по результатам которого составляют схематическое изображение реальной топографии опухолевого инфильтрата [31].
Статистическая обработка данных проведена методами описательной статистики, вариационной статистики и анализа таблиц сопряжённости. Вариационные ряды проверялись на нормальность распределения по методу Смирнова-Колмогорова и в зависимости от характера распределения выбирали параметрический или непараметрический методы сравнения. Непараметрические методы включали вычисление критерия Пирсона, U критерия Манна-Уитни и точного критерия Фишера, параметрические – t-тест и z-тест. При корреляционном анализе использовали определение коэффициента ранговой корреляции Спирмена (r). Анализ выживаемости проводили по методу Каплан-Мейера (лог-ранговый критерий). Уровень статистической значимости различий принят равным 0,05.
Показатели исследования представлены средними арифметическими (M) со стандартным отклонением (s) в виде (М±s), в ряде случаев с определением медианы (Me), квартилей (QL25(%); QU75%(%)) и 95% доверительного интервала.
Данные обработаны и проанализированы и на персональном компьютере с помощью компьютерных программ «Microsoft Word 2003», «Microsoft Exсel 2003», “Microsoft PowerРoint 2003”, «SigmaPlot 11.0», «Adobe Photoshop CS3». Для макро- и микрофотосъемки использовали цифровые фотокамеры «Nikon», «Zeiss Axiocam Erc 5c» и «Leica».
Показатели пролиферации, апоптоза и клеточного обновления Внеопухолевая слизистая оболочка желудка Индекс KI67 Митотический индекс
Заключение : показатели коэффициента клеточного обновления статистически значимо ассоциированы с гистологическим вариантом и функциональным ИФТ РЖ. Слабо когезивным и смешанным карциномам свойственны достоверно большие показатели ККО, по сравнению с папиллярными, тубулярными АК НСЗ и ВСЗ, а также слизистой карциномой, а при группировке в зависимости от функционального ИФТ – РЖ со смешанным ИФТ большие, по сравнению с желудочным ИФТ.
Общее заключение: количественные и полуколичественные показатели пролиферативной активности, определяемой по индексу Ki67 и МИ, а также клеточной гибели по типу апоптоза, определяемой по АИ, статистически значимо ассоциированы с гистологическим вариантом и функциональным ИФТ РЖ. Прирост количества опухолевых клеток достоверно выше в слабо когезивных и смешанных карциномах, по сравнению со слизистой карциномой, папиллярными и тубулярными АК НСЗ и ВСЗ, а при группировке в зависимости от функционального ИФТ – в карциномах смешанного ИФТ выше, по сравнению с раками желудочного ИФТ.
Экспрессия молекулярно-биологических маркеров, ассоциированных с опухолевым ростом (иммуногистохимическое исследование) Предположительный потенциал злокачественности карцином желудка оценивали по показателям ИГХ экспрессии комплекса маркеров, ассоциированных с опухолевым ростом: адегезивной белковой молекулы Е-CAD, регуляторного белка GAL3 и белка базальных мембран COL4, а также матриксных металлопротеиназ MMP2 и MMP3.
Экспрессию этих маркеров оценивали в преобладающем структурном компоненте опухоли на всех уровнях инвазии стенки желудка в репрезентативных полях зрения, а в раках смешанного гистологического строения – во всех структурах карциномы.
Для оценки прогностической значимости морфологических изменений, предшествующих и/или сопутствующих РЖ, экспрессия перечисленных маркеров была изучена и во внеопухолевой слизистой оболочке, как морфологически интактной, так и в участках с «фоновыми» изменениями, наблюдаемыми при РЖ (атрофический гастрит, ФГ, полная и неполная КМ, ИН разной степени)
В слизистой оболочке желудка, в том числе с признаками атрофического гастрита в т.ч. с ФГ, КМ и/или ИН низкой степени наблюдалась только нормальная (мембранная) экспрессия E-CAD, которая выявлялась в 100% клеток.
Иммунореактивность к E-CAD была установлена в 51/55 (93%) случае. В 4 (7%) карциномах (наблюдения 5, 46, 53 и 55 смотри таблицу 2) экспрессия E-CAD наблюдалась менее чем в 5% опухолевых клеток, поэтому эти случаи были расценены как иммунонегативные к исследуемому маркеру и из дальнейшего анализа исключены. Иммунонегативные к E-CAD наблюдения были представлены слабо когезивными и смешанными карциномами, T2-Т3 гистологических стадий, локализующиеся в кардии и пилорическом отделе желудка и имеющих желудочный, кишечный и смешанный функциональные ИФТ.
В наблюдениях РЖ с наличием экспрессии E-CAD количество иммунопозитивных к этому маркеру опухолевых клеток колебалось от 392%о до 674%о на 1000 учтенных, составляя в среднем 498,3±53,2%0; медиана - 522 (Таблица 26). Количество иммунопозитивных к E-CAD опухолевых клеток на 1000 учтенных в карциномах желудка Локализация карциномы (отдел желудка) п (M±S %о) p
Кардия 16 508,0±61,4 Тело 9 457,1±50,2 Кардия 26 529,3±52,1 Гистологическая стадия карциномы ТІ 2 527,0±46,7 Т2 14 463,7±43,0 ТЗ 35 505,2±51,9 Гистологический вариант карциномы Папиллярная АК 4 543,3±53,1 Тубулярная АК НСЗ 8 526,5±60,6 Тубулярная АК ВСЗ 2 477,0±57,8 Слабо когезивная 16 444,3±49,0 Смешанная 20 476,1±51,9 Слизистая 1 522,0 Функциональный ИФТ карциномы Желудочный 30 489,5±57,9 Кишечный 1 499,0 Смешанный 20 507,6±67,4 Анализ статистической достоверности различий показал, что количество иммунопозитивных к E-CAD опухолевых клеток в карциномах, сгруппированных в зависимости от локализации и гистологической стадии, гистологического варианта и функционального ИФТ рака статистически значимо не различалось, 152 однако в менее дифференцированных карциномах их содержание ниже, по сравнению с более дифференцированными опухолями. На рисунках 150 и 151 карциномы, сгруппированные в зависимости от гистологического варианта и функционального ИФТ, расположены в порядке, уменьшения усредненного количества иммунопозитивных к E-CAD опухолевых клеток.
Количество иммунопозитивных к E-CAD опухолевых клеток на 1000 учтенных в гистологических вариантах РЖ (p 0,05). Наибольшее количество иммунопозитивных к E-CAD опухолевых клеток выявлено в папиллярных, тубулярных аденокарциномах НСЗ и слизистой карциноме, меньшее количество – в тубулярных аденокарциномах ВСЗ, смешанных и слабо когезивных раках (p 0,05).
Коллаген базальных мембран (COL4
В подгруппе пациентов с карциномами желудочного ИФТ (наблюдения 1-27 в таблице 44), мужчин было 15, женщин – 12; больных в возрасте 58 лет и старше – 14, младше – 13; карцином T2 гистологической стадии 5 наблюдений, T3 стадии – 22; раков кардии 10 случаев, тела и пилорического отдела – 4 и 13 соответственно; АК – 7, слабо когезивных карцином – 9, смешанных карцином – 11 случаев.
В подгруппе пациентов с РЖ со смешанным ИФТ (наблюдения 28-44 в таблице 44), мужчин было 9, женщин – 8; больных в возрасте 58 лет и старше – 10, младше – 7; карцином T2 гистологической стадии 6 наблюдений, T3 стадии – 11; раков кардии 6 случаев, тела и пилорического отдела – 2 и 9 соответственно; АК – 6, а слабо когезивных карцином – 5, смешанных карцином – 6.
РЖ с кишечным ИФТ (это наблюдение 45 в таблице 44) выявлена у женщины 58 лет. Операция проведена по поводу смешанной карциномы пилорического отдела, гистологической стадии T1a. Больная на момент мониторирования была жива и не имела клинических признаков рецидива заболевания.
На момент мониторирования (окончание 48 месяца наблюдения) из 45 пациентов, входящих в группу анализа выживаемости 10 (22%) больных были живы и не имели клинических признаков рецидива, 35 (80%) – умерли в различные сроки после операции от прогрессирования основного заболевания (Рисунок 230). При этом послеоперационная 1-летняя скорректированная безрецидивная выживаемость составила 86% (Ме – 20,5 мес., М – 30), 3-летняя выживаемость – 26% (Ме – 55 мес., М – 54), а 4-летняя выживаемость – 20% (Ме – 18 мес., М – 26,9). Оперированные пациенты:
Учитывая неоднородность материала, включенного в исследование, нами принято решение оценить соотношение живых и умерших на момент мониторирования пациентов в зависимости от их клинической характеристики, а также локализации, гистологической стадии и гистологического варианта РЖ.
Рассматриваемая группа пациентов, сформированная для оценки скорректированной безрецидивной выживаемости, была представлена 24 мужчинами и 21 женщиной, при этом больных в возрасте, соответствующем возрастной медиане (58 лет и старше) было 26 человек, младше – 19. Операцию по поводу карциномы гистологической стадии T1а и T2 перенесли 12 больных, по поводу стадии T3 – 33. Опухоли локализовались в кардиальном, теле и пилорическом отделах желудка соответственно в 16, 6 и 23 наблюдениях. Гистологическое строение аденокарциномы выявлено в 14 наблюдениях, слабо когезивной и смешанной карциномы – в 14 и 17 соответственно. Желудочный функциональный ИФТ карциномы обнаружен в 27 случаях, кишечный – в 1, смешанный – в 17 (Таблица 45).
Ниже представлены результаты исследования выживаемости пациентов. Выживаемость у оперированных мужчин составила 21%, Me – 17 мес., у женщин – 24%, Ме – 20 мес. (p=0,4; Рисунок 231). Выживаемость пациентов, возраст которых соответствует 58 лет, составила 19%, Ме – 18 мес., 58 лет – 28%; Ме – 21 мес. (p=0,5; Рисунок 232). Выживаемость больных, оперированных по поводу РЖ T2 гистологической стадии, составила 18%, Ме – 17 мес., Т3 стадии – 21%; Ме – 18 мес. (p=0,8; Рисунок 233). Выживаемость больных, оперированных по поводу карциномы кардии, была равна 0, при этом Ме составила 14 мес, тела желудка – 40%, Ме – 29 мес., пилорического отдела – 33%, Me – 21 мес. (p=0,2; Рисунок 234).
