Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 20
1.1. Немелкоклеточный рак легкого: клинико-морфологические параметры и прогноз 20
1.2. Взаимосвязь молекулярно-биологических характеристик с клинико-морфологическими параметрами и прогнозом жизни больных НМКРЛ 30
1.2.1. Ag-ЯОР-белки 30
1.2.2. Маркеры пролиферативной активности (Ki-67, топоизомераза II) 36
1.2.3. Маркеры апоптоза (p53, bcl-2 и bax) 42
1.2.4. ПМЦР-Г и ПМЦР-Л 49
1.2.5. Статус белка и гена Her2 55
1.3. Резюме 60
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 61
2.1. Материал исследования 61
2.2. Методы исследования 64
ГЛАВА 3. Ag-ЯОР-белки 78
3.1. ИП Ag-ЯОР-белков и клинико-морфологические параллели 79
3.2. ИП Ag-ЯОР-белков и молекулярно-биологические маркеры 88
3.3. КВ Ag-ЯОР-белков и клинико-морфологические параллели 91
3.4. КВ Ag-ЯОР-белков и молекулярно-биологические маркеры 98
ГЛАВА 4. Ag-ЯОР-Белки В MIB-1 позитивных клетках 102
4.1. Ag-ЯОР-белки в MIB-1 позитивных клетках и клинико-морфологические параллели 102
4.2. Ag-ЯОР-белки в MIB-1 позитивных клетках и молекулярно-биологические маркеры 4.3. Показатель пролиферации и клинико-морфологические параллели 114
4.4. Показатель пролиферации и молекулярно-биологические маркеры 118
ГЛАВА 5. Маркеры пролиферативной активности 122
5.1. Ki-67 и клинико-морфологические параллели 123
5.2. Ki-67 и молекулярно-биологические маркеры 130
5.3. Топоизомераза II и клинико-морфологические параллели 133
5.4. Топоизомераза II и молекулярно-биологические маркеры 139
ГЛАВА 6. Маркеры апоптоза 143
6.1. p53, bcl-2, bax и клинико-морфологические параллели 143
6.2. p53, bcl-2, bax и молекулярно-биологические маркеры 151
ГЛАВА 7. ПМЦР-Г и ПМЦР-Л 158
7.1. ПМЦР-Г и клинико-морфологические параллели 159
7.2. ПМЦР-Г и молекулярно-биологические маркеры 164
7.3. ПМЦР-Л и клинико-морфологические параллели 165
7.4. ПМЦР-Л и молекулярно-биологические маркеры 169
ГЛАВА 8. Статус белка и гена her2 171
8.1. Статус белка Her2 и клинико-морфологические параллели 171
8.2. Статус белка Her2 и молекулярно-биологические маркеры 175
8.3. Статус гена Her2 и клинико-морфологические параллели 177
8.4. Статус гена Her2 и молекулярно-биологические маркеры 179
ГЛАВА 9. Анализ выживаемости 182
9.1. Клинические критерии 182
9.2. Клинико-морфологические параметры 184
9.3. Молекулярно-биологические маркеры 186
9.3.1. Ag-ЯОР-белки 186
9.3.2. Ag-ЯОР-белки в MIB-1 позитивных клетках 188
9.3.3. Маркеры пролиферативной активности (Ki-67, топоизомераза II) 191
9.3.4. Маркеры апоптоза (p53, bcl-2 и bax) 193
9.3.5. ПМЦР-Г и ПМЦР-Л 196
9.3.6. Статус белка и гена Her2 198
9.4. Коэкспрессия молекулярно-биологических маркеров 202
9.4.1. Коэкспрессия Ag-ЯОР-белков, маркеров пролиферативной активности (Ki-67, топоизомераза II) и Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках 202
9.4.2. Коэкспрессии маркеров апоптоза (p53, bcl-2 и bax) 213
9.4.3. Коэкспрессия и маркеры ангиогенеза ПМЦР-Г и ПМЦР-Л 215
ГЛАВА 10. Многофакторный анализ 217
10.1. Корреляционный анализ 217
10.2. Регрессионный анализ 224
10.2.1. Однофакторный регрессионный анализ 224
10.2.2. Многофакторный регрессионный анализ 228
10.3. Модели прогноза 236
Заключение 244
Выводы 272
Практические рекомендации 275
Список сокращений 277
Список литературы 278
- Взаимосвязь молекулярно-биологических характеристик с клинико-морфологическими параметрами и прогнозом жизни больных НМКРЛ
- ИП Ag-ЯОР-белков и молекулярно-биологические маркеры
- Показатель пролиферации и молекулярно-биологические маркеры
- ПМЦР-Л и клинико-морфологические параллели
Взаимосвязь молекулярно-биологических характеристик с клинико-морфологическими параметрами и прогнозом жизни больных НМКРЛ
Ядрышко – безмембранная, ядерная органелла, видимая в нуклеоплаз-ме в период интерфазы клеточного цикла. Ядрышко реорганизуется в процессе митоза: исчезает в профазе митоза, когда ядрышковые организаторы "растаскиваются" в ходе конденсации соответствующих хромосом, и вновь формируется в телофазе. Восстановление ядрышка в телофазе митоза начинается с ядрышковых организаторов, отчего и произошло такое название. Ядрышкообразующие районы – это вторичная перетяжка на пяти акроцен-трических хромосомах (13-й, 14-й, 15-й, 21-й и 22-й), где располагаются многочисленные копии генов, кодирующие рибосомальные РНК.
Ядрышко содержит хроматин (ядрышкообразующие районы - многократные повторы рибосомных ДНК цистронов для синтеза 45S РНК) и яд-рышковые рибонуклеопротеины, состоящие из прерибосомальных РНК, малых ядерных РНК и рибосомных белков. Ag-ЯОР-белки – это рибосомные белки (нуклеолин, нуклеофозмин и фибриллярин), а также РНК-полимераза I и фактор инициации транскрипции, которые связывают ионы серебра, являясь субстратом цитохимической реакции с нитратом серебра (реакция специфична для фосфосериновых и фосфотреониновых остатков, которыми богаты данные белки). Нуклеолин и нуклеофозмин являются главными Ag-ЯОР-белками, так как их доля в аргентофилии составляет более 70 %.
При исследовании в электронный микроскоп ядрышко состоит из 3 основных компонентов. 1. Фибриллярные центры – округлые структуры, диаметром 0,3-2,0 мкм, их количество в ядрышке зависит от пролиферативной активности клетки, соответствуют ядрышковым организаторам, содержат РНК-полимеразу I. 2. Плотный фибриллярный компонент – окружает фибриллярный цент, состоит из фибрилл толщиной 5 нм, содержит Ag-ЯОР-белки (нуклеолин, нуклеофозмин, фибриллярин и фактор инициации транскрипции). 3. Гранулярный компонент – состоит из гранул 15-20 нм, окружает фибриллярные центры и плотный фибриллярный компонент, содержит Ag-ЯОР-белки (нуклеолин и нуклеофозмин) [Hernandez-Verdun D. et al., 2010; Sirri V., Urcuqui-Inchima S., Roussel P., Hernandez-Verdun D., 2008].
Нуклеолин (белок С23) – фосфопротеин массой 105 кДа, кодируется геном NCL, расположенном на 2q37.1. Нуклеолин является в основном структурным белком, участвует в транскрипции, синтезе и созревании рибосом. Нуклеофозмин (белок В23, нуматрин) – фосфопротеин массой 38-39 кДа, кодируется геном NPM1, расположенном на 5q35.1. Нуклеофозмин является в основном транспортным белком, участвует в синтезе и созревании рибосом, а также в транспорте белков, регуляции сигнального пути ARF/p53, сборке гистонов и дупликации центросом. Рибосомные белки участвуют практически во всех функциональных проявлениях ядрышка: конденсации и деконденсации хроматина, транскрипции, процессинге, созревании и транспорте прерибосомных частиц в цитоплазму [Hernandez-Verdun D. et al., 2010; Sirri V., Urcuqui-Inchima S., Roussel P., Hernandez-Verdun D., 2008; Derenzini М., Trere D., M.-F. O Donohue, Ploton D., 2003]. Ag-ЯОР-белки выявляются в ядрах клеток на протяжении всего клеточного цикла, количественно увеличиваясь в 1,5-3 раза в S- и G2-фазы [Sirri V., Roussel P., Hernandez-Verdun D., 2000]. Количественное содержание Ag-ЯОР-белков имеет обратную зависимость с длительностью клеточного цикла и временем удвоения опухоли, как в экспериментальных моделях, так и в клинической практике [Уханова Е.М. и соавт., 2013; Зенит-Журавлева Е.Г. и соавт., 2013; Райхлин Н.Т. и соавт., 2011, 2008, 2006; Canet V. еt al., 2001, Trer D., 1998]. Обратную зависимость количественного содержания Ag-ЯОР-белков со временем удвоения Ак были показаны Abe S. с соавторами (1992), а при Пк - Ogura S. с соавторами (1992).
Гистохимический метод выявления ядрышковых организаторов был впервые описан и применен в цитогенетических исследованиях Goodpasture C. и Bloom S.E. в 1975 году и состоял из 2 последовательных фаз: импрегнации и проявления. Одноэтапный метод окрашивания (с одновременной им 32
прегнацией и проявлением) предложили Howell W.M. и Black D.A. в 1980 году. Адаптированным вариантом для гистологической практики оказалась дальнейшая модифицикация метода, предложенная Ploton D. с соавторами в 1986 году (более низкая температура и более длительное время инкубации по сравнению с методикой Howell W.M. и Black D.A.), ввиду более удобного управления ходом реакции и получения наиболее оптимальных результатов окрашивания тканевых срезов. С этого времени отмечается значительный интерес к данной методике в онкоморфологии, и признанием ее, как ценного диагностического и прогностического метода [Лазарев А.Ф. и соавт., 2010; Бобров И.П. и соавт., 2010; Болгова Л.С. и соавт., 2010; Волченко Н.Н. и со-авт., 2007; Montanaro L, Trer D, Derenzini M., 2008; Derenzini М., Trere D., M.-F. O Donohue, Ploton D., 2003; Pich A., Chiusa L., Margaria E., 2000; Ofner D., Schmid K. W., 1996].
Для оценки результатов окрашивания Ag-ЯОР-белков предложено два метода: первый заключается в подсчете количества гранул серебра, второй – в определении площади Ag-ЯОР-белков в ядрах клеток путем автоматического или полуавтоматического измерения с использованием анализатора изображения. Определение площади Ag-ЯОР-белков с использованием компьютерного анализа изображений рекомендовано "Международным комитетом по количественной оценке Ag-ЯОР-белков" в качестве метода оценки Аg-ЯОР-белков в ядрах клеток [Aubele M. et al., 1994]. Однако, из 1000 работ опубликованных к 2000 году по исследованию Ag-ЯОР-белков в опухолях человека только в 15,4 % при оценки активности Ag-ЯОР-белков использовался анализ изображения [Trer D., 2000]. Для исключения межлабораторной объективной вариабельности исследования Ag-ЯОР-белков Ruschoff J. (1990) предложили использовать площадь Ag-ЯОР-белков в ядрах малых лимфоцитов в качестве стандарта окрашивания и внутреннего контроля. При определении площади Ag-ЯОР-белков рекомендуется соотносить ее со средней площадью стандарта окрашивания – получившее название ИП Ag-ЯОР-белков или индекса Ruschoff. В наших исследованиях показана большая диагностическая значимость определения ИП по сравнению с площадью Ag-ЯОР-белков [Лазарев А.Ф. с соавт., 2010; Кобяков Д.С., 2006].
Большие количественные показатели Ag-ЯОР-белков взаимосвязаны с низким показателем выживаемости и негативным прогнозом при злокачественных новообразованиях разной локализации: молочной железы [Trer D. et al., 2006], эндометрия [Giuffr G. et al., 2001], яичника [Sah SP. et al., 2004], щитовидной железы [Райхлин Н.Т. и соавт., 2010], надпочечника [Райхлин Н.Т. и соавт., 2011, 2002; Букаева И.А. и соавт., 2001], почки [Yasunaga Y. et al., 1998], полости рта и глотки [Pillai KR. et al., 2005; Piffk J. et al., 1997], лимфоме [Райхлин Н.Т. и соавт., 2000; Смирнова Е.А. и соавт., 2004], легкого [Казачков Е.Л., Белосохов М.В., 2013; Райхлин Н.Т. и соавт., 2012, 2008], желудка [Бобров И.П., 2005; Климачев В.В., 2003], толстой кишки [Лазарев А.Ф. и соавт., 2010; Лазарев А.Ф., Климачев В.В., Кобяков Д.С., 2006; Кобя-ков Д.С., 2006], саркоме [Авдалян А.М., 2013; Авдалян А.М. и соавт., 2009, 2010; Лазарев А.Ф. и соавт., 2008; Бобpов И.П. и соавт., 2008]. Pich A. с соавторами (2000) провели обзор исследований Ag-ЯОР-белков и показали, что при большинстве злокачественных новообразований количественные показатели Ag-ЯОР-белков взаимосвязаны с клинико-морфологическими параметрами опухоли, общей и безрецидивной продолжительностью жизни больных и являются независимым фактором прогноза.
ИП Ag-ЯОР-белков и молекулярно-биологические маркеры
Результаты определения ИП Ag-ЯОР-белков в ядрах эпителиальных клеток НМКРЛ во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения представлены в таблице 13. Так как при НМКРЛ среднее значение ИП Ag-ЯОР-белков составило 6,52, то случаи с ИП Ag-ЯОР-белков 6,52 и более считались с большим ИП Ag-ЯОР-белков (118 случаев – 49%), до 6,52 мкм – с небольшим (125 случаев – 51%). Таблица 13. ИП Ag-ЯОР-белков и молекулярно-биологические маркеры НМКРЛ.
Результаты определения ИП Ag-ЯОР-белков в ядрах эпителиальных клеток Ак во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения представлены в таблице 14. Так как при Ак среднее значение ИП Ag-ЯОР-белков составило 6,05, то случаи с ИП Ag-ЯОР-белков 6,05 и более считались с большим ИП Ag-ЯОР-белков (48 случаев – 43%), до 6,05 мкм – с небольшим (63 случая – 57%). Таблица 14. ИП Ag-ЯОР-белков и молекулярно-биологические маркеры Ак.
В Ак при увеличении количественных показателей ИП Ag-ЯОР-белков отмечалось увеличение количественных показателей КВ Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1), ПП, ИМ Ki-67 и ИМ ТороII. Также в группе опухолей с большим количественным значением ИП Ag-ЯОР-белков отмечалось большее количество р53 положительных случаев, меньшее количество bcl-2 положительных случаев и большее количество случаев с амплификацией гена Her2. При Ак ИП Ag-ЯОР-белков имел корреляцию с КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,46, р 0,001), Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,76, р 0,001), ПП (r=0,48, р 0,001), ИМ Ki-67 (r=0,37, р 0,001), ИМ ТороII (r=0,35, р 0,001), экспрессией р53 (r=0,29, р 0,01), bcl-2 (r=-0,27, р 0,01) и амплификацией гена Her2 (r=0,24, р 0,01). Таким образом, корреляционные взаимосвязи ИП Ag-ЯОР-белков с молекулярно-биологическими маркерами были тождественны при Ак и НМКРЛ.
Результаты определения ИП Ag-ЯОР-белков в ядрах эпителиальных клеток Пк во взаимосвязи с молекулярно-биологическими маркерами, а также результаты сравнения представлены в таблице 15. Так как при Пк среднее значение ИП Ag-ЯОР-белков составило 6,96, то случаи с ИП Ag-ЯОР-белков 6,96 и более считались с большим ИП Ag-ЯОР-белков (59 случаев – 45%), до 6,96 мкм – с небольшим (73 случая – 55%). Таблица 15. ИП Ag-ЯОР-белков и молекулярно-биологические маркеры Пк.
В Пк при увеличении количественных показателей ИП Ag-ЯОР-белков отмечалось увеличение количественных показателей КВ Ag-ЯОР-белков, Ag-ЯОР-белков (MIB-1), ПП, ИМ Ki-67 и ИМ ТороII. Также в группе опухолей с большим количественным значением ИП Ag-ЯОР-белков отмечалось большее количество р53 положительных случаев и меньшее количество bcl-2 положительных случаев. При Пк ИП Ag-ЯОР-белков имел корреляцию с КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,48, р 0,001), Ag-ЯОР-белками (MIB-1) (r=0,74, р 0,001), ПП (r=0,46, р 0,001), ИМ Ki-67 (r=0,39, р 0,001), ИМ ТороII (r=0,36, р 0,001), экспрессией р53 (r=0,33, р=0,002) и bcl-2 (r=-0,31, р 0,001). Таким образом, корреляционные взаимосвязи ИП Ag-ЯОР-белков с молекулярно-биологическими маркерами были тождественны при Пк и НМКРЛ, за исключением амплификации гена Her2 – взаимосвязь с которой отсутствовала при
В НМКРЛ КВ Ag-ЯОР-белков составил 30,5±4,6%; распределение значений в выборке было параметрическим (W=0,99, р=0,42). Минимальное значение выборки составило 17,1, максимальное – 43,3. Гистограмма распределения характеризовалась незначительным сдвигом вправо (ассиметрия 0,02) и незначительной островершинностью (эксцесс 0,02) (рисунок 9а). В клетках НМКРЛ наблюдалось статистически значимое повышение КВ Ag-ЯОР-белков по сравнению с неизмененным эпителием альвеол и бронхов (р 0,01). Увеличение вариабельности Ag-ЯОР-белков в клетках опухоли по сравнению с неизмененной тканью подтверждало факт участия ядрышкового аппарата клетки в процессе канцерогенеза
Результаты определения КВ Ag-ЯОР-белков в ядрах эпителиальных клеток НМКРЛ, Ак и Пк во взаимосвязи с полом и возрастом больных, а также результаты сравнения представлены в таблице 8 и 9. Найдено статистически значимое увеличение КВ Ag-ЯОР-белков в НМКРЛ у лиц мужского пола по сравнению с женским. Аналогичная тенденция достоверно прослеживается и при Ак; однако, при Пк различия статистически не достоверны. Вероятно, данные различия отражают взаимосвязь пола больных с гистогенезом НМКРЛ. Возраст больных НМКРЛ, Ак и Пк не взаимосвязан с КВ Ag 93
Не найдено статистически значимого увеличения КВ Ag-ЯОР-белков в НМКРЛ с наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах по сравнению с опухолью без метастазов (рисунок 1). Показатель N при НМКРЛ не имел корреляции с КВ Ag-ЯОР-белков. Таким образом, метастатический потенциал НМКРЛ не связан с гетерогенностью ядрышковых организаторов опухолевых клеток.
КВ Ag-ЯОР-белков при НМКРЛ не имел достоверных отличий при II и III стадии по сравнению с I стадией. Стадия процесса при НМКРЛ не имела корреляции с КВ Ag-ЯОР-белков. Таким образом, на ранних и поздних этапах опухолевого роста гетерогенность Ag-ЯОР-белков одинакова.
КВ Ag-ЯОР-белков в НМКРЛ достоверно больше в Пк по сравнению с Ак (рисунок 10 в,г). Гистогенез НМКРЛ имел умеренную корреляцию с КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,29, р=0,01). Таким образом, имелась зависимость гетерогенности Ag-ЯОР-белков от тканевого происхождения опухоли.
В клетках НМКРЛ КВ Ag-ЯОР-белков больше при умеренной и низкой дифференцировке по сравнению с высокодифференцированной карциномой (рисунок 10 д,е). Степень дифференцировки НМКРЛ имела умеренную корреляцию с КВ Ag-ЯОР-белков (r=0,27, р=0,02). Гетерогенность ядрышковых организаторов возрастали в зависимости от степени дедифференцировки НМКРЛ.
Проведенный тест Краскела-Уоллиса показал статистически значимые отличия ИП Ag-ЯОР-белков в НМКРЛ в группах показатель Т, наибольший размер опухоли, гистогенез и дифференцировка.
В Ак КВ Ag-ЯОР-белков составил 29,8±4,7%; распределение значений в выборке было параметрическим (W=0,98, р=0,03). Минимальное значение выборки составило 17,1, максимальное – 40,7. Гистограмма распределения характеризовалась незначительным сдвигом влево (ассиметрия 0,03) и незначительной пологостью вершины (эксцесс -0,18) (рисунок 9б).
Результаты определения КВ Ag-ЯОР-белков в ядрах эпителиальных клеток Ак во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами, а также результаты сравнения представлены в таблице 17. В клетках Ак наблюдалось статистически значимое повышение КВ Ag-ЯОР-белков по сравнению с неизмененным альвеолярным эпителием (р 0,01).
Показатель пролиферации и молекулярно-биологические маркеры
Суммируя данные результатов исследования Ag-ЯОР-белков (MIB-1) и ПП следует отметить следующие основные моменты. В клетках НМКРЛ наблюдалось статистически значимое повышение Ag-ЯОР-белков (MIB-1) и ПП по сравнению с неизмененным эпителием альвеол и бронхов, что имеет практическое дифференциально-диагностическое значение. Имеется гендер-ная взаимосвязь с показателем пролиферации, так как найдено статистически значимое увеличения ПП у лиц мужского пола по сравнению с женским. Ag-ЯОР-белки (MIB-1) и ПП были взаимосвязаны с основными клинико-морфологическими параметрами по системе TNM: показателем Т, наибольшим размером опухоли, показателем N, стадией процесса, гистогенезом и дифференцировкой. Также Ag-ЯОР-белки (MIB-1) и ПП имели корреляцию с большинством молекулярно-биологических маркеров: ИП и КВ Ag-ЯОР-белков, ИМ Ki-67, ИМ ТороII, экспрессией р53, bcl-2, bax, ИГХ Her2 статусом и амплификацией гена Her2. Таким образом, исследование Ag-ЯОР-белков (MIB-1) и ПП является важной молекулярно-биологической характеристикой НМКРЛ, что может быть использовано для дополнительной характеристики новообразования.
По выраженности (интенсивности) окрашивания эпителиальных клеток на антиген Ki-67 можно было выделить три типа ядер интерфазных клеток: гранулярный, гранулярно-диффузный и диффузный [Lindboe C.F., Torp S.H., 2002]. Гранулярный тип окрашивания – соответствовал незначительной интенсивности окрашивания ядер клеток - характеризовался отсутствием или незначительным окрашиванием ядра (нуклеоплазмы), на фоне которой четко выделялись интенсивно прокрашенные ядрышки в виде гранул. Гранулярно-диффузный тип окрашивания – соответствовал умеренной интенсивности окрашивания ядер клеток - характеризовался умеренным окрашиванием нук-леоплазмы (более интенсивным по сравнению с гранулярным типом), на фоне которой определялась гранулярность (более интенсивно окрашенные ядрышки). Диффузный тип окрашивания – соответствовал выраженной интенсивности окрашивания ядер клеток - характеризовался равномерным, интенсивным окрашиванием ядра, ядрышки не дифференцировались. Разная интенсивность окрашивания ядер интерфазных клеток (ядрышек и нуклео 123
плазмы) зависит от фазы клеточного цикла и последовательного изменения локализации антигена Ki-67 в ядре на протяжении клеточного цикла. В фазе митоза также определяется окрашивание хромосом делящихся ядер - интенсивного, равномерного типа, причем форма окрашивания полностью соответствует морфологической форме митоза или патологического митоза (рис. 21). При определении ИМ Ki-67 окрашенные хромосомы в М-фазе не под-считывались. Окрашивание на антиген ТороII имело интенсивный, равномерный, диффузный характер окрашивания ядра, ядрышки не дифференцировались.
В неизмененном эпителии альвеол ИМ Ki-67 и ТороII составил менее 1% (единичные положительные клетки). В неизмененном эпителии бронхов ИМ Ki-67 составил 4 (1-8)%, ИМ ТороII - менее 1% (единичные положительные клетки). Ki-67 и ТороII позитивные клетки определялись в базаль-ном слое и нижней трети эпителия бронха. В НМКРЛ наблюдалось повышение ИМ Ki-67 и ИМ ТороII по сравнению с неизмененным эпителием альвеол и бронхов (р 0,001) (рисунок 17).
В НМКРЛ ИМ Ki-67 составил 25 (18-42)% ; распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,93, р0,001). Минимальное значение выборки составило 2%, максимальное – 95%. Гистограмма распределения характеризовалась значительным сдвигом вправо (ассиметрия 0,93) и значительной островершинностью (эксцесс 0,62) (рисунок 18а).
Результаты определения ИМ Ki-67 при НМКРЛ, Ак и Пк во взаимосвязи с полом и возрастом больных, а также результаты сравнения представлены в таблице 36 и 37. Найдено статистически значимое увеличение ИМ Ki-67 в НМКРЛ у лиц мужского пола по сравнению с женским. Аналогичная тенденция достоверно прослеживается и при Ак; однако, при Пк различия статистически не достоверны. Вероятно, данные различия отражают взаимосвязь пола
Результаты определения ИМ Ki-67 при НМКРЛ во взаимосвязи с кли-нико-морфологическими параметрами, а также результаты сравнения представлены в таблице 38. Отмечалось увеличение ИМ Ki-67 в группах Т2-3 по сравнению с Т1 (показатель Т), N1-3 по сравнению с N0 (показатель N), II-III по сравнению с I (стадия заболевания), однако, статистически значимого отличия не было получено.
Статистически значимые отличия ИМ Ki-67 получены в следующих группах: наибольший размер опухоли (до 3 см и более 3 см), гистогенез (Ак и Пк), дифференцировка (высокодифференцированная и умерено, низкодиф 127
ференцированная опухоль) (рисунок 19, 20). ИМ Ki-67 при НМКРЛ имел слабую корреляцию с наибольшим размером опухоли (r=0,21, р0,01), диф-ференцировкой (r=0,22, р0,01) и умеренную корреляцию с гистогенезом (r=0,31, р0,001). Таким образом, пролиферативная активность увеличивается в процессе увеличения размера НМКРЛ и при Пк по сравнению с Ак. В опухолях без солидизации (высокодифференцированные) по сравнению с опухолями с разной степенью солидизации (умерено и низкодифференциро-ванные) минимально содержание антигена Ki-67.
В Ак ИМ Ki-67 составил 20 (11-38)%; распределение значений в выборке было непараметрическим (W=0,92, р0,001). Минимальное значение выборки составило 2%, максимальное – 92%. Гистограмма распределения характеризовалась значительным сдвигом вправо (ассиметрия 0,93) и умеренной островершинностью (эксцесс 0,49) (рисунок 18б). Результаты определения ИМ Ki-67 в Ак во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами, а также результаты сравнения представлены в таблице 39.
Отмечалось последовательное увеличение ИМ Ki-67 в Ак в группах Т1, Т2, Т3 (показатель Т), N0, N1, N2 (показатель N), I, II, III (стадия заболева 129 ния), однако, достоверного отличия не было получено. Статистически значимые отличия ИМ Ki-67 получены в следующих группах: наибольший размер опухоли (до 3 см и более 3 см), дифференцировка (высокая и умереная-низкая) (рисунок 19). ИМ Ki-67 в Ак имел слабую корреляцию с наибольшим размером опухоли (r=0,25, р=0,02), дифференцировкой (r=0,23, р=0,03). Таким образом, пролиферативная активность увеличивается в процессе увеличения размера Ак. Также в опухоли без солидизации (высокодифференциро-ванная) по сравнению с опухолью с разной степенью солидизации (умерено и низкодифференцированная) минимально значение ИМ Ki-67.
ПМЦР-Л и клинико-морфологические параллели
Суммируя данные результатов исследования ИГХ Her2 статуса и состояния гена Her2 следует отметить следующие основные моменты. В клетках НМКРЛ наблюдалось статистически значимое изменение ИГХ Her2 статуса и состояния гена Her2 по сравнению с неизмененным эпителием альвеол и бронхов, что имеет практическое дифференциально-диагностическое значение. Имеется гендерная взаимосвязь с состоянием гена Her2 – амплификация гена Her2 чаще у лиц женского пола по сравнению с мужским. ИГХ Her2 статус и состояния гена Her2 были взаимосвязаны с основными клинико-морфологическими параметрами по системе TNM: показателем N и гистогенезом. Также ИГХ Her2 статус и состояние гена Her2 имели корреляцию с некоторыми молекулярно-биологическими маркерами: ИП Ag-ЯОР-белков, площадью Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках, показателем пролиферации, ИМ Ki-67, ИМ ТороII. Таким образом, исследование ИГХ Her2 статуса и состояния гена Her2 является важной молекулярно-биологической характеристикой НМКРЛ, что может быть использовано для дополнительной характеристики новообразования.
Общая скорректированная выживаемость больных НМКРЛ за 5-летний период после операции составила 41,3±3,5%. Выживаемость больных НМКРЛ исследована во взаимосвязи с клиническими критериями, клинико-морфологическими параметрами и коэкспрессии молекулярно-биологических маркеров.
Так как при НМКРЛ средний возраст составил 59 лет, то все случаи были поделены на группу с возрастом до 59 лет и группу старше 59 лет. Выживаемость больных НМКРЛ не имела статистически значимого отличия между группами с возрастом до 59 лет и старше 59 лет. Также выживаемость больных НМКРЛ не имела статистически значимого отличия в зависимости от половой принадлежности.
Выживаемость больных НМКРЛ имела статистически значимое отличие (р=0,007) в зависимости от типа операции: 45,4±4,2% - при лобэктомии и 29,3±6,0% - при пневмонэктомии (рисунок 38).
Полихимиотерапия, лучевая терапия и комбинированная терапия (по-лихимио- и лучевая терапия) не имели статистически значимого влияния на выживаемость больных НМКРЛ.
Таким образом, из всех клинических критериев имеется взаимосвязь выживаемости больных НМКРЛ только с типом операции. Однако, тип операции, отражая оперативную тактику и объем операции, взаимосвязан с кли-нико-морфологическими параметрами по системе TNM (показателем Т, наибольшим размером первичной опухоли, показателем N, стадией заболевания и гистогенезом) и имеет вторичное (суммирующее) влияние на выживаемость больных НМКРЛ по сравнению с первичными клинико-морфологическими параметрами опухоли.
Наблюдалось последовательное уменьшение выживаемости от группы с показателем Т1, к Т2 и Т3, а также между группами с размером опухоли менее 3 см и более 3 см (рисунок 39а,б). В зависимости от показателя N достоверные отличия получены только для группы N0 (выживаемость длиннее) по сравнению с N1, N2 и N3 (выживаемость короче). Между группами N1, N2 и N3 отсутствовали статистически значимые отличия выживаемости (рисунок 39в). Наблюдалось последовательное уменьшение выживаемости в ряду 1, 2 и 3 стадия (рисунок 38г). Выживаемость больных достоверно длиннее при Пк по сравнению с Ак (рисунок 39д). Выживаемость больных достоверно длиннее при высокой дифференцировке по сравнению с 186 умеренной и низкой дифференцировкой. Между умерено и низкодифферен-цированной карциномами отсутствовало достоверное отличие в выживаемости больных (рисунок 39е).
Таким образом, имеется взаимосвязь выживаемости больных НМКРЛ с клинико-морфологическими параметрами по системе TNM: показателем Т, наибольшим размером первичной опухоли, показателем N, стадией заболевания, гистогенезом и дифференцировкой опухоли.
Так как при НМКРЛ среднее значение ИП Ag-ЯОР-белков составило 6,52, то случаи с ИП Ag-ЯОР-белков 6,52 и более считались с большим ИП Ag-ЯОР-белков (118 случаев – 49%), до 6,52 – с небольшим (125 случаев – 51%). Выживаемость больных НМКРЛ имела статистически значимое отличие (р 0,001) в зависимости от ИП Ag-ЯОР-белков: 49,8±5,2% - при небольшой площади и 28,6±4,7% - при большой (рисунок 40а).
Так как при Ак среднее значение ИП Ag-ЯОР-белков составило 6,05, то случаи с ИП Ag-ЯОР-белков 6,05 и более считались с большим ИП Ag-ЯОР-белков (48 случаев – 43%), до 6,05 – с небольшим (63 случая – 57%). Выживаемость больных Ак имела статистически значимое отличие (р 0,001) в зависимости от ИП Ag-ЯОР-белков: 39,0±8,2% - при небольшой площади и 13,1±5,6% - при большой (рисунок 40б).
Так как при Пк среднее значение ИП Ag-ЯОР-белков составило 6,96, то случаи с ИП Ag-ЯОР-белков 6,96 и более считались с большим ИП Ag-ЯОР-белков (59 случаев – 45%), до 6,96 – с небольшим (73 случая – 55%). Выживаемость больных Пк имела статистически значимое отличие (р 0,001) в зависимости от ИП Ag-ЯОР-белков: 68,9±6,3% - при небольшой площади и 19,0±5,9% - при большой (рисунок 40в).
Так как при НМКРЛ среднее значение КВ Ag-ЯОР-белков составило 30,5%, то случаи с КВ Ag-ЯОР-белков 30,5% и более считались с большим КВ Ag-ЯОР-белков (108 случай – 44%), до 30,5% – с небольшим (135 случаев
Так как при НМКРЛ медиана ПМЦР-Г составила 43, то случаи с ПМЦР-Г 43 и более считались с большой ПМЦР-Г (115 случаев – 50%), до 43 – с небольшой (113 случаев – 50%). Выживаемость больных НМКРЛ имела статистически значимое отличие (р=0,008) в зависимости от ПМЦР-Г: 49,8±5,2% - при небольшой и 29,8±4,8% - при большой (рисунок 49а).
Так как при Ак медиана ПМЦР-Г составила 47, то случаи с ПМЦР-Г 47 и более считались с большой ПМЦР-Г (56 случаев – 53%), до 47 – с небольшой (49 случаев – 47%). Выживаемость больных Ак имела статистически значимое отличие (р=0,002) в зависимости от ПМЦР-Г: 46,3±8,9% - при небольшой и 18,9±5,9% - при большой (рисунок 49б).
Так как при Пк медиана ПМЦР-Г составила 40, то случаи с ПМЦР-Г 40 и более считались с большой ПМЦР-Г (62 случая – 50%), до 40 – с небольшой (61 случай – 50%). Выживаемость больных Пк имела статистически значимое отличие (р=0,01) в зависимости от ПМЦР-Г: 57,2±6,8% - при небольшой и 31,5±7,1% - при большой (рисунок 49в). Рисунок 50. Графики выживаемости по Каплану-Мейеру больных НМКРЛ (а), Ак (б) и Пк (в) с небольшой (-) и большой (+) ПМЦР-Л. По оси абсцисс – время жизни (в днях), по оси ординат – доля выживших больных. Так как при НМКРЛ медиана ПМЦР-Л составила 4, то случаи с ПМЦР-Л 4 и более считались с большой ПМЦР-Л (129 случаев – 57%), до 4 – с небольшой (99 случаев – 43%). Выживаемость больных НМКРЛ имела статистически значимое отличие (р=0,03) в зависимости от ПМЦР-Л: 48,3±5,5% -при небольшой и 34,0±4,6% - при большой (рисунок 50а). Так как при Ак медиана ПМЦР-Л составила 4, то случаи с ПМЦР-Л 4 и более считались с большой ПМЦР-Л (60 случаев – 57%), до 4 – с небольшой 198 (45 случаев – 43%). Выживаемость больных Ак не имела статистически значимого отличия (р=0,5) в зависимости от ПМЦР-Л: 32,8±8,0% - при небольшой и 29,4±6,9% - при большой (рисунок 50б).
Так как при Пк медиана ПМЦР-Л составила 4, то случаи с ПМЦР-Л 4 и более считались с большой ПМЦР-Л (69 случаев – 56%), до 4 – с небольшой (54 случая – 44%). Выживаемость больных Пк имела статистически значимое отличие (р=0,02) в зависимости от ПМЦР-Л: 59,0±7,5% - при небольшой ПМЦР-Л4 и 36,1±6,3% - при большой ПМЦР-Л4 (рисунок 50в).
